基因合成仪

[size=5][b]多肽合成仪发展史[/b][/size][font=楷体_GB2312][size=3][color=black][b]多肽合成仪简介[/b][/color][/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3] 美国洛克菲勒大学教授Bruce Merrifild 在1963年发明的多肽固相合成技术（SPPS）是多肽合成领域的一个重大突破，对化学，生化，医药，免疫和基因科学等学科和领域都起了巨大的推动作用. 他本人也因此项发明荣获1984化学诺贝尔奖。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3] 多肽固相合成技术的发明同时促进了肽合成的自动化。世界上第一台真正意义上的多肽合成仪出现在1980年代初期，它是利用氮气鼓泡来对反应物进行搅拌，用计算机程序控制来实现有限度的自动合成。虽然在搅拌方式和其他各项功能方面有着明显的缺陷，但是它毕竟把人从实验室里解放出来，极大地提高了工作效率，所以受到了多肽科学家的一致赞扬。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3] 多肽合成仪的问世大大促进了多肽科学的发展。反过来，随着多肽科学的发展，科学家也对合成仪提出了更高的要求，从而带动了合成仪的发展。目前多肽合成仪品种繁多。从合成量上分，可分为微克级的，毫克级的，克级的和公斤级的；从功能上分，可分为研究型的，小试型的，中试型的，普通生产型的和GMP生产型的；从自动化程度上分，可分为全自动的，半自动的和手动的；从通道上分，可分为单通道的和多通道的；从技术角度上分，可分为第一代的，第二代的，和第三代的；等等。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3][/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3][color=black][b]第一代多肽合成仪[/b][/color][/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3]标志性特点是采用氮气鼓泡的搅拌原理来对反应物进行搅拌，即合成仪上反应器是固定的，氮气从反应器的下方通过反应器到上部排出，在这一过程中产生的汽泡把固相和液相混合起来。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3] 它有着消耗成本大，有死角等严重缺陷，已大部分退出了市场。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3][/size][/font][b][font=楷体_GB2312][size=3]第二代多肽合成仪[/size][/font][/b][font=楷体_GB2312][size=3]标志性特点是用不完全性的机械搅拌来取代氮气鼓泡，一般可分为接触式搅拌与非接触式搅拌两种。 接触式搅拌常见的搅拌方式是伸入反应器内部的螺旋桨由上部的电机带动进行快速旋转，使反应器内部的固液两相进行混合。但这种方式会严重降低合成产量，清洗也比较麻烦，还会缩短反应器的寿命，最主要这种方式也会产生反应死角。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3][/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3] 目前全世界共17个多肽合成仪生产厂商有16个放弃了接触式搅拌方法。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3][/size][/font][b][font=楷体_GB2312][size=3]第三代多肽合成仪[/size][/font][/b][font=楷体_GB2312][size=3] 是由美国[/size][/font][font=楷体_GB2312][color=#000000][size=3]ABI[/size][/color][/font][font=楷体_GB2312][size=3]公司制造的无死角多肽合成仪为标志诞生的。其反应器转动方式有别于前两代的多肽合成仪，即反应器上方相对固定，而下方作圆周360度快速旋转，带动反应器里的固液两相从底部向上作螺旋运动，一直达到反应器的最上方。换句话说，溶液可以达到反应器内部的任意点，真正做到了无死角。由于搅拌速率可达每分钟1800转的高速，反应得以充分完全。其合成肽的纯度相当高，对于ACP65-74型肽的粗肽纯度可达87.6% （ABI433使用者手册）。由于无死角的搅拌方式保证的肽的合成纯度，ABI433型多肽合成仪（其退出多肽合成仪市场后最后一款仪器）至今在世界上还占有着很大的比例。当然，ABI产品的售价也是最高的。由于部件使用频率高，电磁阀会经常损坏，而ABI将7个电磁阀做成模块化的设计，坏掉一个电磁阀必须要更换整个模块，无形中增加了维修成本。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3]因此，成本过高，也已停止生产。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3][/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3] 无死角多肽合成仪的另一款方式是反应器在数控马达的带动下作上下180度的翻转运动。固相和液相在运动过程中不断从反应器的一端到达另一端，再返回来。所以在上下180度的翻转运动中溶液可以达到反应器内部的任意点。数控马达的转速可根据需要任意调节。一般用这种仪器合成出来的肽纯度是最高的。由于反应器越大，溶液作180度的翻转运动所得到的惯性也越大，搅拌也越来越剧烈，产品的纯度也会越来越高，所以只要小试能成功，就可以跳过中试这一步，直接放大生产。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3][/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3]微波法多肽合成仪[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3] 另一种革新式的产品，微波多肽合成仪的问世，是区别与之前任何一类合成仪的新产品。其采用微波加热方式，大大提高了反应速度，将多肽合成的速率增加到之前多肽合成仪的几倍甚至十几倍。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3] 这种仪器目前在中国市场还比较受欢迎，但在国际上，其实已经不认可这种方式生产多肽了，因为它有个致命缺点。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3] 在加热的情况下副反应也相应增多，多肽纯度不能与之前的第三代甚至第二代产品媲美。另外，微波加热方法无法放大，故不适合用作多肽药物的研发。[/size][/font][font=楷体_GB2312][size=3] （部分内容摘自：百度百科-多肽合成仪）[/size][/font]

前段时间实验室试用了一家仪器公司代理的进口流动合成仪，效果蛮好的。就是类似于微管道反应器，反应液边流动边反应。之前做了两个实验，都是平时很迟钝的那种，一天一夜或者两天两夜那种，后来使用流动合成仪，增加了系统压力从而可以大大升高反应温度，实验进行了一个小时就达到甚至比之前的反应效果还好。正好我们实验室有一个才从国外回来的博后，他以前就用过流动合成，效率提高很多，也完成了一些平时烧瓶条件不好进行的反应，尤其是在新药研发和条件优化时具有很大的优势。大家有没有知道这款仪器的呢？想多交流交流。加上最近听到的关于流动化学的讲座，我觉得这样的仪器在国内市场上会有很大前景的哦，不过需要一个过程，不知道大家怎么看。

求购二手3900合成仪、BLP-192合成仪13301096091 张先生[em09511]

[size=1][size=4]请大家发表一下看法： 现在微波合成越来越被人们重视了，以前微波消解比较多，现在微波合成也逐年增加，对于做合成的人来说，希望所用微波合成仪都具备哪些功能呢？大家踊跃参加，一起讨论。还有谁用过微波合成仪觉得哪些功能不错也可以罗列！谢谢！积极参与！[/size][/size]

各位老师好，有没有熟练操作希施CS336X多肽合成仪的，我们单位想学习一下这台仪器的使用，南京的最好，方便交流。走过路过的朋友多多发言，或提供学习交流的渠道，非常感谢！

请问哪里有卖固相合成仪用于合成多肽的，还有层析缸？谢谢专家！

请问国产微波化学合成仪有哪几家的产品比较好？我单位拟购买，正在选型，但手中厂家的资料太少，请教一下是否有关这方面的信息？

偶想了解有关蛋白质合成仪方面的信息?请知之者不吝赐教.

大家用的微波消解是哪家的？还有微波合成仪有用过哪家的？出现过什么问题？用的时候觉得有哪些不便之处。

现在用一款国内的微波合成仪，对于顶部开口处是否会泄露微波我真的感觉很害怕，请教专家，为何微波不会通过顶部泄露出来，平时做实验我们应该注意什么？

请问各位大佬，哪有卖公斤级的液相多肽合成仪？

我知道有很多公司生产多肽合成仪，像cs bio, PTI, PSI, AAPPTEC, CEM, 好像还有中国的公司海南建邦，还有德国的一些公司，产品还是蛮多的。所以我想请教一下了解的人士，这些公司在中国有没有代理？哪些品牌比较好？哪些品牌性价比高？都适合什么领域的，比如高校研究、研究所、药厂啊什么的？谢谢各位！

采购微波合成仪应该考虑哪些因素？哪些因素比较重要？

传统的微波炉是多膜技术,不同模式微波的重叠会造成反应容器受热不均匀,使反应不稳定,重现性不好,且容易发生爆炸[em53] .请问有哪几家公司的微波合成仪是单膜技术的.什么公司呀.

各位大神，谁有waters 2767和AKTA OP100核酸合成仪教程，跪求有相关资料也可以，感谢感谢

我是新手,各位GGJJ给推荐个便宜的微波化学合成仪器,像改装过的家用微波炉,不需要多好,能回流! 顺便问句,DMF溶剂能在未经改造的家用微波炉的敞口体系中进行反应吗?只加热不控温.有危险不?

[b]职位名称：[/b]合成仪技术工程师[b]职位描述/要求：[/b]职位描述：1.负责本公司合成仪、氨解仪、PCR仪、定量PCR仪等产品的现场维修；2.能独立前往客户单位进行上述仪器的安装、调试并对客户进行培训：如何使用及日常维护、保养仪器。负责技术支持及远程现场维修的指导；3.能独立前往客户单位进行合成仪的检查维修、维护保养、软件升级及远程4.配合销售开发市场，协助重点用户的维护。5.领导交待的其他工作。职位要求：1、大专或以上学历；2、生物、材料、化学、电气、机械类或相关专业；3、熟悉ABI、Biolytic等品牌的荧光定量PCR仪、合成仪等任意一类产品；4、有生物化学类仪器维修或相关企业工作经验；5、具备良好的电脑软、硬件知识及技能；6、具有较强的技术应用能力及一定的沟通能力；7、能适应频繁出差。[b]公司介绍：[/b] 北京拓普塞斯生物技术有限公司成立于 2008 年，是湖北三七七生物技术有限公司的全资子公司，在美国，巴西，印度等国拥有多家兄弟公司。仪器销往及提供服务给欧美，日本，韩国，新加坡等多个国家。同时是美国 Biolytic 公司 Dr.Oligo 系列 DNA/RNA 合成仪，氨解仪等产品在中国唯一的授权代理商和服务商。我司自成立至今始终致力于各种类型的生物学仪器的销售、维修维护等服务。...[url=https://www.instrument.com.cn/job/user/job/position/59274]查看全部[/url]

[b]职位名称：[/b]多肽合成仪器产品专员/经理（上海）[b]职位描述/要求：[/b]职位描述：1.从事化学合成相关仪器的市场开发； 3.及时了解、分析市场动态并汇报，及时反馈客户需求及其他相关信息； 4.维护责任区域内客户，并为客户提供全面的技术方案及服务； 5.积极配合公司各部门开展仪器展会、学术会议等活动。 职位要求：1.本科及本科以上学历，生物、化学等相关专业毕业； 2.具有1年以上生命科学仪器市场工作经验，市场敏锐度高；3.熟悉国内生命科学仪器领域的情况，了解相关学术的最新动态； 4.良好的英文表达能力，能够阅读并翻译与所销售仪器相关的资料； 5.具有良好的沟通能力，有责任心、进取心，遵守职业道德； 6.有合成产品背景为佳 熟悉相关产品仪器如：微波多肽合成（LIBERTY）、蛋白水解、蛋白酶解、PBI等。[b]公司介绍：[/b] 培安公司自成立以来，一直致力于为国内用户提供最先进的科研仪器和最新的科研技术，旨在提高祖国的科研实力。 培安一贯坚持“质量为本，信誉致上，服务第一”的企业宗旨，弘扬“团结诚信，求实创新”的企业精神，奉行“用户的需求就是我们的目标”的经营理念，竭诚为用户提供最优质的产品及服务。 培安以最快的速度将世界上尖端的技术及设备引进日新月异的中国，经过多年的发展，公司的产品已涉及到...[url=https://www.instrument.com.cn/job/user/job/position/67579]查看全部[/url]

上海交大一项研究有望降低抗肿瘤良药成本2013年02月26日 来源： 中国科技网 作者： 王春 沈海燕 中国科技网 讯 （沈海燕 记者王春）上海交通大学微生物代谢国家重点实验室林双君研究小组通过对链黑菌素生物合成基因簇进行基因解析，阐明了链黑菌素复杂的生物合成途径。由此得到的链黑菌素类似物不仅抗癌活性高很多，其毒性上也比原始链黑菌素降低了约5倍。该研究成果近日发表在国际权威学术期刊《美国化学会会志》上。 链黑菌素是由一株绒毛链霉菌所产生的抗肿瘤抗生素，具广谱抗肿瘤活性。但在上世纪七八十年代进行二期临床实验时，因其毒性过强而被迫终止。 基因组测序技术为生物合成机制的研究提供了更多信息。林双君研究小组首先克隆了链黑菌素潜在的抗生素基因簇，定位出链黑菌素的生物合成的48个独立基因编码，再通过微生物遗传学、化学及生物化学技术和手段，获得了其中17个基因的突变菌株，从中分离鉴定了12个与链黑菌素生物合成相关化合物的化学结构，提出了链黑菌素生物合成途径的模型。 在这一过程中，还揭示了多个新颖或关键的酶催化反应的分子生物学机制。该项研究为抗生素药物新颖酶催化反应基因的挖掘，并利用合成生物学等前沿生物技术创造新的结构衍生物奠定了基础。林双君称，这是首次在基因水平实现链黑菌素的生物合成途径的解析。 课题组通过基因工程技术获得的一个链黑菌素类似物，在抗癌活性上比目前临床使用的抗癌药物高很多。这个类似物在临床应用方面，对治疗淋巴瘤、白血病、鼻咽癌等疾病将有更大的优势。林双君表示，只要将产量提高到可规模化生产，就可将链黑菌素或类似物转化为一个新型的抗癌药物，不仅有望降低药价，而且减少化疗时产生的毒副作用。 《科技日报》2013-2-26 一版

最近在做合成多肽的基因毒性杂质，因为缺乏这方面的经验和相关的文献，无从下手，请大家多多指教

各位版友，我们公司买了一台瑞典Biotage 全自动微波合成仪器，说明书在给仪器搬家的时候弄没有了，经销商电子文档也没有留份，再要的时候客服磨机磨机迟迟不发，请问那位版友有的话能否传份给我，非常感谢，正在编写该仪器的SOP，唉~~没有资料凭借自己经验还是有点不足。。。。。

[b]职位名称：[/b]多肽合成仪产品专员/经理（北京）[b]职位描述/要求：[/b]1.从事多肽合成仪的市场开发；2.及时了解、分析市场动态并汇报，及时反馈客户需求及其他相关信息；3.全力维护北京区域内客户，并为客户提供全面的技术方案及服务；4.积极配合公司各部门开展仪器展会、学术会议等活动。***相关福利：公司提供五险一金、交通补助、餐饮补助、通讯补贴、定期体检、年终奖金、绩效奖金等。（工资待遇中不包含年终奖） 职位要求： 1、本科及本科以上学历，生物、化学等相关专业毕业； 2、具有2年以上仪器市场工作经验，市场敏锐度高，有相关客户关系者优先； 3、熟悉国内仪器领域的情况，了解相关学术的最新动态； 4、良好的英文表达能力，能够阅读并翻译与所销售仪器相关的资料； 5、工作认真主动，态度积极，有较强的责任心，善于沟通； 6、能吃苦耐劳，能承受较大工作压力，有良好的团队精神和协调能力。 [b]公司介绍：[/b] 培安公司自成立以来，一直致力于为国内用户提供最先进的科研仪器和最新的科研技术，旨在提高祖国的科研实力。 培安一贯坚持“质量为本，信誉致上，服务第一”的企业宗旨，弘扬“团结诚信，求实创新”的企业精神，奉行“用户的需求就是我们的目标”的经营理念，竭诚为用户提供最优质的产品及服务。 培安以最快的速度将世界上尖端的技术及设备引进日新月异的中国，经过多年的发展，公司的产品已涉及到...[url=https://www.instrument.com.cn/job/user/job/position/60133]查看全部[/url]

[b]职位名称：[/b]合成仪器产品专员（药物/化学）[b]职位描述/要求：[/b]职位描述：1.从事化学合成相关仪器的市场开发及销售工作； 2.及时了解、分析市场动态并汇报，及时反馈客户需求及其他相关信息； 3.全力维护责任区域内客户，并为客户提供全面的技术方案及服务； 4.积极配合公司各部门开展仪器展会、学术会议等活动。 职位要求：1.本科及本科以上学历，生物、化学、制药等相关专业毕业； 2.具有1年以上化学仪器市场工作经验，市场敏锐度高；3.熟悉国内合成领域的情况，了解相关学术的最新动态； 4.良好的英文表达能力，能够阅读并翻译与所销售仪器相关的资料； 5.具有良好的沟通能力，有责任心、进取心，遵守职业道德； 6.有合成产品背景为佳 熟悉相关产品仪器。[b]公司介绍：[/b] 培安公司自成立以来，一直致力于为国内用户提供最先进的科研仪器和最新的科研技术，旨在提高祖国的科研实力。 培安一贯坚持“质量为本，信誉致上，服务第一”的企业宗旨，弘扬“团结诚信，求实创新”的企业精神，奉行“用户的需求就是我们的目标”的经营理念，竭诚为用户提供最优质的产品及服务。 培安以最快的速度将世界上尖端的技术及设备引进日新月异的中国，经过多年的发展，公司的产品已涉及到...[url=https://www.instrument.com.cn/job/user/job/position/54060]查看全部[/url]

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基因芯片及其在病原微生物检测中的应用基因芯片是近年来迅速发展的一门生物高新技术，它以其能够快速、高效、大规模地同步检测生物遗传信息的卓越功能而得到发展。在基因测序、基因表达分析、药物筛选、基因诊断等领域显示出重要的理论和实用价值。基因芯片是指应用大规模集成电路的微阵列技术。在固相支持物表面（常用的固相支持物有玻璃、硅片、尼龙膜等载体）有规律地合成数万个代表不同基因的寡核苷酸“探针”或液相合成探针后由点样器有规律地点样于固相支持物表面；然后将要研究的目的材料中的DNA、RNA或用cDNA同位素或荧光物标记后，与固相支持物表面的探针进行杂交，通过放射自显影或荧光共聚焦显微镜扫描，对这些杂交图谱进行检测；再利用计算机对每一个探针上的杂交信号作分析处理，便可得到目的材料中有关基因表达信息。该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子进行检测分析。基因芯片分类基因芯片按其片基不同可分为无机片基芯片和有机合成片基芯片：如果按其应用不同，可分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片；如果按其结构不同可分为DNA阵列和寡核苷酸芯片；如果按其制备方法不同可分为原位合成芯片和合成后交联芯片。目前，常用于基因芯片制作的固相支持物主要包括半导体硅片、普通玻璃片、尼龙膜等基质。它们各有优缺点，可根据不同的用途和目的选择使用。用硅片制作的芯片，其DNA探针排列的密度高，在1.28cm芯片上，可达40万点阵。检测灵敏度高但专一性差。用玻璃制作的芯片，可用于双色荧光标记杂交，便于杂交信号的检测，但其灵敏度低，而且对玻璃片的处理要求高。尼龙膜主要用于制作eDNA芯片，即将不同的eDNA片断点阵于尼龙膜上，它可用同位素标记检测，灵敏度高，专一性好，但是DNA阵列的密度低。DNA探针的制备及固化探针的制备及固化有2种方法：①在片基上原位合成寡核苷酸；②在片基以外制备DNA探针，并以显微打印等手段将其固化于片基上。作者介绍了待测DNA样品的制备、标记样品与基因芯片杂交、杂交信息的检测与分析、操作过程中存在的问题及解决办法。基因芯片可以对病原细菌检测、病毒的检测及其他方面如支原体检测等。问题和展望基因芯片在病原微生物检测中具有快速、灵敏、高通量、自动化等特点。但目前仍面临一些问题有待解决，这些问题主要体现在硬件和软件2个方面。在硬件方面，DNA芯片技术需要昂贵的尖端仪器，如生产原位合成芯片需要光刻机器和寡核苷酸合成仪；构建DNA微集阵列的自动仪器约需8万美元以上，而检测芯片则要激光共聚焦显微镜、落射荧光显微镜等设备，费用较高。在软件（即技术）上也存在一些问题。首先，探针制备的环节上，原位合成寡核苷酸技术复杂，且有专利保护，合成过程中有可能插入错误核苷酸或混入杂质，降低了特异性和信噪比；显微打印技术较灵活，易实现，但需收集或合成大量探针，且阵列的集成度不高。其次，在样品和芯片杂交的环节上 ，因为杂交在固相上进行，空间因素会对杂交造成不利影响；还有，在一个芯片上存在多种探针，这对杂交条件是个挑战，因为这种探针的最适条件未必适合另一种探针；而且，复杂的探针如长寡核苷酸容易自身形成二 、三级结构，影响与靶序列的杂交或给出错误的阴性信号，当然在其它技术环节上也存在着一些难题，如样品准备复杂、检测的灵敏度低等。虽然基因芯片技术在多个环节上有待提高，但它在生命科学及相关领域中已呈现出广阔的应用前景，相信随着研究的不断深入和技术的更加完善，基因芯片会成为基础研究和临床应用的强有力工具。

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菊苣酸是世界上广受欢迎的药用植物紫锥菊（[b]Echinacea purpurea[/b] (L.) Menoch）的主要活性成分，被公认为商业热销紫锥菊产品的质量指标。虽然紫锥菊中菊苣酸的生物合成途径已被近期阐明，但其调控网络仍然不清楚。通过共表达和系统发育分析，该研究发现了[b]EpMYB2[/b]，一个典型的R2R3型MYB转录因子（TF），对甲基茉莉酸甲酯（MeJA）刺激有响应，是菊苣酸生物合成的正调控因子。除了直接调控菊苣酸生物合成基因外，[b]EpMYB2[/b]还正向调控上游莽草酸途径的基因。我们还发现[b]EpMYC2[/b]可以通过结合其G-box位点激活[b]EpMYB2[/b]的表达，[b]EpMYC2-EpMYB2[/b]模块参与了MeJA诱导的菊苣酸生物合成。总的来说，我们鉴定了一个通过激活初级和特化代谢基因正向调控菊苣酸生物合成的MYB转录因子[b]EpMYB2[/b]，连接了茉莉酸信号通路与菊苣酸生物合成之间的缺口。这项工作为利用生物技术手段提高紫锥菊药用质量开辟了新方向。 [align=left][b]前言[/b][/align] 几千年来，人类一直使用植物来维持健康。天然产物分子是药物开发的重要资源）。紫锥菊（[b]Echinacea purpurea[/b] (L.) Menoch）原产于北美，并在全球广泛种植。除了作为观赏植物种植外，它还被用作草药治疗口疮、感冒和蛇咬伤。现代药理学实验已经证明它具有免疫调节、抗炎、抗氧化和抗病毒活性。紫锥菊产品几十年来在全球范围内畅销，通常用于预防和治疗普通感冒。在紫锥菊中发现了许多不同的化学成分，包括咖啡酸衍生物、糖蛋白、烷基胺和黄酮类化合物。其中，菊苣酸作为一种咖啡酸衍生物，是这些多种化学成分中最具代表性的，广泛积累在整个植物中，已被用作紫锥菊产品和原材料的质量指标。许多研究报告已经证明，菊苣酸具有多种生物活性，例如抗病毒、抗氧化、抗炎、肝脏保护、肾脏保护和抗癌，这些生物活性已经在最近的综述中得到了介绍。到目前为止，紫锥菊一直是菊苣酸补充剂的主要来源。由于市场对紫锥菊及其菊苣酸的需求量大，有必要提高植物中菊苣酸的含量，这依赖于生物合成途径和调控网络的阐明。 我们之前已经阐明了紫锥菊中菊苣酸的生物合成途径。首先，苯丙氨酸通过限速酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）和随后的一些酶（如肉桂酸4-羟化酶（C4H）和4-香豆酸连接酶（4CL））转化为对香豆酰CoA。对香豆酰CoA是多种苯丙素类化合物生物合成的关键中间体，包括黄酮类化合物、羟基肉桂酸衍生物和白藜芦醇类化合物（Vogt, 2010）。在菊苣酸的生物合成过程中，对香豆酰CoA通过羟基肉桂酰CoA：莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（HCT）和对香豆酰莽草酸/奎宁酸3'-羟化酶（C3'H）转化为咖啡酰CoA。两种BAHD型酰基转移酶（羟基肉桂酰CoA：酒石酸羟基肉桂酰转移酶（HTT）和羟基肉桂酰CoA：奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（HQT））利用咖啡酰CoA作为酰基供体，分别以酒石酸和奎宁酸为酰基受体，生成槲皮素酸和绿原酸。最后，一种特殊的丝氨酸羧肽酶样（SCPL）型酰基转移酶——菊苣酸合酶（CAS）催化菊苣酸的生物合成，以槲皮素酸为酰基受体，绿原酸为酰基供体（Fu, Zhang, Jin等，2021）。我们进一步描述了酰基转移酶的底物多样性，并描绘了紫锥菊中菊苣酸及其类似物的整个生物合成网络。毫无疑问，菊苣酸的积累是由其生物合成基因的表达决定的。与此同时，生物合成基因的表达通常受到转录因子（TFs）的调控。尽管我们已经阐明了生物合成途径，但菊苣酸的调控网络仍然不清楚。 植物的各种转录因子（TFs）家族已经被发现参与植物次生代谢的调控，例如v-Myb髓样细胞白血病病毒癌基因同源物（MYB）、基础/螺旋-环-螺旋（bHLH）、WD重复、乙烯响应因子（ERF）、WRKY和基础亮氨酸拉链（bZIP）。其中，MYB转录因子被认为是苯丙素代谢的主要调控因子。它们包含一个保守的N端DNA结合结构域重复（R）和一个可变的C端调控区域。根据R的数量，MYBs可以分为四类，包括1R-、R2R3-、3R-和4R-MYB蛋白。R2R3-MYBs是植物MYBs中占主导地位的，被认为在功能多样化中帮助植物从水生环境适应到陆地环境。亚家族3、4、5、6、7、8、13、21、31、32、44和79的R2R3-MYBs主要被报道调控苯丙素生物合成途径，通过直接结合启动子作为激活因子或抑制因子发挥作用。许多植物R2R3-MYBs识别DNA靶点的AC元件，这些元件富含腺嘌呤和胞嘧啶残基。例如，AtMYB12，亚家族7的成员，被报道直接结合启动子的MYB12BS位点（CACCTACC、TACCTAMC和TAGCWACC），调控蔗糖磷酸合酶（DAHPS）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮合酶（CHS）和黄烷酮3-羟化酶（F3H）的表达。 此外，生物和非生物刺激也影响植物次生代谢物的生物合成。植物防御机制的诱导通常伴随着大量次生代谢物的产生。在此过程中，脂质衍生植物激素——茉莉酸（JAs）发挥了关键作用。例如，JAs诱导了许多次生代谢物的生物合成，如长春碱、青蒿素、尼古丁和紫杉醇。许多转录因子家族的成员对JAs有响应，并调控JAs诱导的次生代谢物积累。在茉莉酸信号通路中，茉莉酸ZIM域（JAZ）家族的抑制蛋白通常与转录因子结合并抑制其激活功能。在JAs存在的情况下，JAZ蛋白被SCFCOI1复合物降解，最终释放转录因子。该通路中研究最透彻的转录因子属于MYC家族（bHLH型TF），包括MYC2、MYC3和MYC4。例如，MYC2s直接和间接地调控次生代谢物的诱导，通过结合下游基因启动子上的G-box位点并激活其表达。 有趣的是，菊苣酸的生物合成在紫锥菊的毛状根、幼苗和细胞悬浮培养物中显著受到甲基茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导。目前尚不清楚哪种转录因子参与了紫锥菊中MeJA诱导的菊苣酸生物合成。将转录因子与生物合成基因结合使用将显著提高目标代谢物的产量。因此，必须识别潜在的正向调控因子以实现高产量的菊苣酸生产。最近，我们建立了紫锥菊开花期不同组织的转录组，并鉴定了一个属于亚家族6的R2R3-MYB转录因子[b]EpMYB1[/b]，该转录因子正向调控紫锥菊中的花青素生物合成。在此基础上，我们通过共表达和系统发育分析鉴定了可能参与菊苣酸生物合成的转录因子。通过系统表征和体内转基因验证，鉴定出一个MYB转录因子，并阐明了其调控机制。进一步的研究还解释了其在MeJA诱导的菊苣酸生物合成中的作用。这项研究进一步阐明了菊苣酸的生物合成，并为利用生物技术手段提高紫锥菊中菊苣酸含量奠定了基础。 [align=left][b]结果[/b][/align] [b][b]参与菊苣酸生物合成的TF的筛选[/b][/b] 该团队之前已经阐明了紫锥菊中菊苣酸的生物合成途径（图1A）。利用最近建立的多组织转录组数据集，我们通过BLASTP方法识别出了菊苣酸生物合成基因。通过对这些生物合成基因表达水平的层次聚类分析，我们发现它们的表达模式相似，并且在根部高表达（图1B）。尤其是[b]EpPAL[/b]、[b]EpC4H[/b]、[b]Ep4CL[/b]、[b]EpC3’H[/b]、[b]EpHTT[/b]和[b]EpCAS[/b]具有紧密的共表达关系（图1B）。这些结果通过RT-q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]得到了验证。共表达分析已经被广泛应用于中间代谢物、生物合成基因和调控因子的鉴定。随后，我们使用这六个高度相关的菊苣酸生物合成基因作为诱饵进行共表达分析。通过与这六个基因共表达且线性相关系数高于0.8的基因的交集，共获得了139个转录因子（图1C）。MYB转录因子已经被证明可以调控苯丙素代谢。在这139个转录因子中，21个被注释为MYB。在去除冗余序列后，我们将这21个[b]EpMYBs[/b]与[b]AtMYBs[/b]进行比对并用于系统发育分析。这些[b]EpMYBs[/b]分布在几个亚家族中，包括2、7、14、20和78。之前有报道指出，亚家族3、4、5、6、7、8、13、21、31、32、44和79的成员参与调控苯丙素代谢。在这10个[b]EpMYBs[/b]中，亚家族7的两个成员（即CL4945.Contig5_All和CL4945.Contig7_All）可能具有调控苯丙素的潜力。当这两个[b]EpMYBs[/b]在[b]Nicotiana benthamiana[/b]叶片中瞬时过表达时，CL4945.Contig5_All（命名为[b]EpMYB2[/b]）显著增加了总酚含量（图1D）。总体而言，我们通过共表达、系统发育分析和异源功能研究确定了[b]EpMYB2[/b]为潜在的菊苣酸生物合成调控因子。 [b][b]EpMYB2[/b] 正向调控菊苣酸生物合成[/b] 对[b]EpMYB2[/b]与拟南芥亚家族7成员的多序列分析表明，[b]EpMYB2[/b]具有完整的R2和R3结构域，可被鉴定为R2R3-MYB。进一步对[b]EpMYB2[/b]与其他植物物种亚家族7成员的系统发育分析显示，[b]EpMYB2[/b]与[b]Gentiana trifloral[/b]的[b]GtMYBP4[/b]较为接近，后者已被报道能促进类黄酮生物合成（图2A）。RT-q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]分析表明，[b]EpMYB2[/b]在根、茎和叶柄中高表达，这与RNA-seq数据一致（图2B）。通过在烟草叶片中瞬时表达[b]EpMYB2-GFP[/b]融合蛋白，发现[b]EpMYB2[/b]定位于细胞核中（图2C）。此外，[b]EpMYB2[/b]的表达对不同的胁迫处理（尤其是MeJA）具有响应（图2D），这表明它可能在环境胁迫与次生代谢之间起到链接作用。 为了探索[b]EpMYB2[/b]的体内功能，我们构建了[b]EpMYB2-OE[/b]紫锥菊愈伤组织。对照组和[b]EpMYB2-OE[/b]组愈伤组织的表型都呈现淡黄色，彼此之间没有显著差异（图3A）。[b]EpMYB2-OE[/b]组的[b]EpMYB2[/b]表达水平显著高于对照组（P 0.05）（图3B）。采用基于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-高分辨率质谱（LC-HRMS）的非靶向代谢组学方法，对紫锥菊愈伤组织进行代谢物变化评估。在主成分分析（PCA）得分图中，对照组与[b]EpMYB2-OE[/b]组显著分离（图3C）。进一步的载荷图评估表明，主要的差异离子属于菊苣酸及其类似物甲基菊苣酸和其底物槲皮素酸与绿原酸，根据保留时间和质谱进行鉴定（图3D）。与对照组相比，[b]EpMYB2-OE[/b]组中这些化学物质的含量显著增加（图3E）。此外，菊苣酸生物合成基因，包括[b]EpPAL[/b]、[b]EpC4H[/b]、[b]Ep4CL[/b]、[b]EpHCT[/b]、[b]EpC3’H[/b]、[b]EpHQT[/b]、[b]EpHTT[/b]和[b]EpCAS[/b]，均受[b]EpMYB2[/b]上调（图3F）。这些结果表明，[b]EpMYB2[/b]是菊苣酸生物合成的正向调控因子。另一方面，鉴于亚家族7的成员被确认是类黄酮调控因子，我们进一步研究了[b]EpMYB2[/b]对类黄酮的影响。[b]EpMYB2[/b]对关键生物合成基因的表达和类黄酮代表性化学物质的水平没有表现出一致的促进作用。它显著增加了芸香苷的含量，但未显著增加紫茉莉苷的含量。菊苣酸的增加幅度远高于芸香苷，这表明[b]EpMYB2[/b]对菊苣酸生物合成的激活作用比对类黄酮的更强。所有这些结果表明，[b]EpMYB2[/b]主要在紫锥菊中促进菊苣酸的生物合成。 [b][b]EpMYB2[/b] 正向调控上游的初级代谢基因[/b] 许多转录因子被发现具有多个调控靶点，尤其是一些调控次生代谢的转录因子，它们也被发现参与初级代谢的调控。为了进一步评估[b]EpMYB2[/b]的功能，我们对转基因愈伤组织进行了RNA-seq分析。将上调的基因进行KEGG途径富集分析。令人感兴趣的是，除了苯丙氨酸代谢外，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途径也得到了富集（图4A）。这些芳香族氨基酸来源于莽草酸途径，属于初级代谢途径，并且是苯丙素代谢的上游（图4B；表S1）。我们使用RT-q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]评估了这些上游生物合成基因的表达水平。几种结构基因，包括[b]EpDAHPS[/b]、[b]EpEPSPS[/b]、[b]EpCM[/b]、[b]EpPAT[/b]和[b]EpADT[/b]，被[b]EpMYB2[/b]显著上调（P 0.05）（图4C）。因此，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量均显著增加（P 0.05）（图4D）。综上所述，[b]EpMYB2[/b]被发现具有多个潜在的调控靶点，覆盖了初级和次级代谢途径。 [b][b]EpMYB2[/b] 通过直接结合激活关键的苯丙氨酸和菊苣酸生物合成基因的表达[/b] 为了探索[b]EpMYB2[/b]对菊苣酸生物合成的调控机制，我们尝试克隆这些初级和次级代谢基因的启动子。使用之前报道的方法，我们成功克隆了10个启动子（图5B）。然后，我们采用双荧光素酶测定法来测试[b]EpMYB2[/b]对这些启动子激活的作用（图5A）。[b]EpMYB2[/b]对[b]proEpCM[/b]、[b]proEpPAT[/b]、[b]proEpPAL[/b]、[b]proEpC4H[/b]、[b]proEp4CL[/b]、[b]proEpHCT[/b]、[b]proEpC3’H[/b]、[b]proEpHTT[/b]和[b]proEpCAS[/b]表现出激活效应，但对[b]proEpHQT[/b]没有影响（图5C）。在菊苣酸生物合成中起主导作用的关键代谢基因[b]EpPAL[/b]、[b]EpHCT[/b]和[b]EpHTT[/b]被广泛激活（图5C）。[b]EpHQT[/b]在紫锥菊种子发芽过程中的表达模式也表现出明显的差异，这表明其具有不同的调控网络。这些结果表明，[b]EpMYB2[/b]可以通过直接激活重要代谢基因的启动子来调控菊苣酸的生物合成。为了进一步识别潜在的结合位点，我们对这些启动子进行了分析，发现[b]proEpCM[/b]、[b]proEpPAT[/b]、[b]proEpPAL[/b]、[b]proEpHCT[/b]、[b]proEpC3’H[/b]和[b]proEpHTT[/b]在ATG上游500 bp内都包含[b]MYB12BS[/b]位点（图5B）。我们选择了[b]EpPAL[/b]、[b]EpHCT[/b]和[b]EpHTT[/b]这三个菊苣酸生物合成的关键代谢基因，来研究潜在的结合位点。在[b]EpPAL[/b]、[b]EpHCT[/b]和[b]EpHTT[/b]的启动子上突变[b]MYB12BS[/b]位点后，在双荧光素酶测定法中[b]EpMYB2[/b]对这些启动子的激活水平显著降低（图S7A；图5D、F）。此外，我们采用酵母单杂交（Y1H）实验来确认直接的结合效应。[b]EpMYB2[/b]显示出直接结合在[b]proEpHCT[/b]和[b]proEpHTT[/b]的[b]MYB12BS[/b]位点上（图5E、G）。由于[b]proEpPAL[/b]具有较高的自活性，因此难以验证[b]EpMYB2[/b]对其的直接结合作用（图S7B）。这些结果表明，[b]MYB12BS[/b]至少是[b]EpMYB2[/b]的一个结合位点。综上所述，我们发现[b]EpMYB2[/b]可以通过与启动子结合直接激活基因表达，并识别了一个结合位点。 [b][b]EpMYC2-EpMYB2[/b] 模块介导了MeJA诱导的菊苣酸生物合成[/b] 先前的研究表明，紫锥菊中菊苣酸的生物合成受到MeJA的诱导。在本研究中，我们注意到[b]EpMYB2[/b]的表达显著受到MeJA的影响（图2D），这让我们推测[b]EpMYB2[/b]是否参与了MeJA诱导的菊苣酸生物合成。由于[b]EpMYB2[/b]主要在根部表达（图2），我们处理了紫锥菊根部以进一步探索[b]EpMYB2[/b]在JA信号响应中的作用。结果表明，[b]EpMYB2[/b]的表达水平显著被MeJA处理所诱导（图6A）。此外，菊苣酸生物合成基因的表达水平和化学物质的含量也均受诱导（图6B）。考虑到[b]MYC2[/b]在JA信号途径中的重要作用，我们通过BLASTP分析发现了[b]EpMYC2[/b]，该基因是从[b]Artemisia annua[/b]中鉴定出的[b]AaMYC2[/b]的同源基因。多序列比对分析表明，[b]EpMYC2[/b]包含完整的[b]MYC2[/b]结构域，包括基础和HLH（螺旋-环-螺旋）结构域、JAZ结合域（JID）以及与MED25蛋白结合的转录激活域（TAD）。系统发育分析显示，[b]EpMYC2[/b]与[b]AaMYC2[/b]较为接近，是bHLH亚家族7的典型成员（图6C）。为了探究[b]EpMYC2[/b]是否会影响[b]EpMYB2[/b]的表达，我们克隆了包含两个G-box位点的[b]EpMYB2[/b]启动子。[b]EpMYC2[/b]通过双荧光素酶测定法验证了其对[b]EpMYB2[/b]启动子的激活作用（图6D）。当启动子上距ATG 126 bp的G-box位点被突变后，[b]EpMYC2[/b]对[b]EpMYB2[/b]启动子的激活水平显著下降（图6D）。通过酵母单杂交（Y1H）实验确认了[b]EpMYC2[/b]直接结合[b]proEpMYB2[/b]–126 bp G-box位点的作用）。因此，[b]EpMYC2[/b]通过G-box位点激活了[b]EpMYB2[/b]启动子的表达。以上结果表明，[b]EpMYC2-EpMYB2[/b]模块介导了MeJA诱导的菊苣酸生物合成。 [align=left][b]结论[/b][/align]该研究发现了一种 MYB TF，即 EpMYB2，它能通过直接激活涵盖初级和特化代谢基因的初级和特化代谢基因的表达，正向调控紫锥菊中的菊苣酸生物合成通过直接激活涵盖初级和次级代谢的初级和特化代谢基因的表达，积极调控紫锥菊的菊苣酸生物合成。次生代谢基因的表达。鉴定EpMYC2-EpMYB2模块还连接了JA信号途径与菊苣酸生物合成之间的联系。这些结果进一步解释了菊苣酸的生物合成，并为菊苣酸的工程生产铺平了道路。此外，与 CK 组几乎不产生菊苣酸相比，EpMYB2 过度表达的紫锥菊中的菊苣酸含量相当可观，可将其视为提取菊苣酸的原料。