离子交换是温和条件下分离蛋白质混合物的一个非常有用的技术,最常见的是应用增加盐浓度的缓梯度溶液进行洗脱。pH 梯度洗脱使用频率较低(除专属应用外,例如色谱聚焦),并且需要复杂的缓冲液体系。尽管如此,如今的四元液相色谱系统完全能够利用常规缓冲盐实现pH 梯度洗脱。本篇应用报告中,我们展示了pH 梯度洗脱在分离单克隆抗体带电异构体时的优势。本文的工作使用了Agilent Bio mAb 色谱柱、安捷伦1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统和安捷伦缓冲液顾问软件。
本实验使用擅长在中性条件下分析碱性化合物的CAPCELL PAK MGII色谱柱,按照客户指定方法对其所提供注射用泮托拉唑钠样品进行分析。首先,按照有关物质项下方法进行分析,结果如图1、2。泮托拉唑钠峰理论塔板数为173948,远超标准要求的2500;杂质A与泮托拉唑钠主峰得到良好分离,分离度为7.83。 其次,按照有关物质项下杂质D、F的色谱条件与系统适用性方法进行分析,结果如图3、4。泮托拉唑钠峰理论塔板数为18314,杂质D、F之间分离度为1.24,符合分离度不小于1.2的要求。 接下来,按照含量测定项下方法进行分析,结果如图5。泮托拉唑钠峰理论塔板数为20149,超过要求的2500。
SPE 柱净化(Copure® C18,500 mg/6 mL)活化:C18 柱使用前用 5 mL 乙腈、5 mL 水活化。上样和洗脱:取备用液全部过柱,弃去流出液;加 5 mL 水淋洗,弃去流出液;抽干小柱,加 5 mL 乙腈洗脱,收集洗脱液(上样、洗脱过程流速控制在 1 mL/min 内)。上机测试:洗脱液于 50℃氮吹至近干,用 1 mL 80% 甲醇水溶液溶解,经 0.45 µ m 有机滤膜过滤,供上机测试。