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液液分配色谱篇——包治百变的“HPLC咒”:极极如意令 此“咒”一出必峰回路转一、关于高效液相色谱的主要类型及选择 以液体作流动相的色谱称液相色谱。广义范围内,除柱色谱外,薄层色谱(液固色谱)和纸色谱(液液色谱)也属于液相色谱。该篇只讨论狭义的液相色谱,即柱色谱。柱色谱法按分离机理分类可分为液固吸附色谱、液液分配分色谱、键合相色谱、凝胶相色谱、离子色谱等。其中,离子色谱法的分析对象是离子性化合物。 本篇只论行业目前广泛使用的高效液相色谱:液液分配色谱。二、关于高效液相色谱的核心与保护 在高效液相色谱分析中,除了固定相(色谱柱填料)对样品的分离起主要作用外,合适的流动相(也称为做洗脱液)对改善分离效果也会产生重要的辅助效应。 从实用角度考虑,选用作为流动相的溶剂除具有价廉、易购的特点外,还应满足高效液相色谱分析的下述要求: 1. 选用的溶剂应当与固定相互不相溶,并能保持色谱柱的稳定性; 2. 选用有溶剂应有高纯度,以防甩含微量杂质在柱中积累,引起柱效性能的改变; 3. 选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配,如使用UV检测器,就不能选用在检测波长下有UV吸收的溶剂;若使用RI检测器,就不能使用梯度洗脱; 4. 选用的溶剂应对样品有足够的溶解能力,以提高测定的灵敏度; 5. 选用的溶剂应具有低的黏度和适当低的沸点。使用低黏度溶剂,可减少溶质的传质阻力,有利于提高柱效; 6. 应尽量避免使用具有显著毒性的溶剂,以保证工作人员的安全; 附:一般实验室流动相备品的极性强度可用溶剂强度参数 ξ 表示。 ξ 是指每单位面积吸附剂表面的溶剂的吸附能力, ξ 越大表明其极性也越大。如下: http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607302250_602716_2239775_3.png三、液液分配色谱的分离原理及与正、反相的异同 分离原理:在液液分配色谱中,一个液相作为流动相,另一个液相(即固定液:填料化合物)则分散在很细的惰性载体或硅胶上作为固定相。作为固定相的液相与流动相互不相溶,它们之间有一个界面。固定液对被分离组分按照它们各自分配系数,很快地在两相间达到分配平衡。这种分配平衡的总结果导致的各组分迁移速度产生不同,或快或慢,从而达到分离的效果。很明显,分配色谱法的基本原理与液液萃取相同的一致的,都是由化学性质的差异引起的分配定律。 正、反相的异同:依据固定相和流动相的相对极性的不同,分配色谱法可分为:正相分配色谱法——固定相的极性大于流动相的极性;反相分配色谱法——固定相的极性小于流动相的极性。 在正相分配色谱法中,固定载体涂布的是极性固定液(即填料化合物),流动相是非极性溶剂。可用来分离极性较强的水溶性样品,洗脱顺序即有:非极性组分先洗脱出来,极性组分后洗脱出来。 在反相分配色谱法中,固定相载体上涂布极性较弱或非极性的固定液(即填料化合物),而用极性较强的溶剂作流动相。可用来分离油溶性样品,其洗脱顺序与正相液液色谱相反,即极性组分先被洗脱,非极性组分后被洗脱。四、正相、反相流动相的改性方法 在正相分配色谱中,使用的流动相此时以已烷、庚烷为主体,可加入﹤20%的极性改性剂,如1-氯丁烷、异丙醚、二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、乙腈等; 在反相分配色谱中,使用的流动相以水为主体,可加入一定量的改性剂,如二甲基亚砜、乙二醇、乙腈、甲醇、丙酮、对二氧六环、乙醇、四氢呋喃、异丙醇等。 注:改性的原由主要调节流动相的极性强度和改造其洗脱能力,但切勿改性过度导致造成色谱柱损伤!!!切记!切记!切记! 林林总总有诗曰: 选流动相溶剂:选溶先着稳,纯度定柱寿 选溶样品溶剂:溶器相匹配,多溶方灵敏 概括溶剂效果:毒低得安全,低黏得高效 柱子极性特征:相正而极强,相反而低极 正相分析特性:水溶选正相,强相而后现 反相分析特性:油溶必反相,强强多分离 正流动相要求:正相烷不二,极弱先出局 反流动相要求:反相与水多,改性防伤害
我是大学生,最近学习气相色谱。我用的溶剂是乙酸,条件是厂家给的条件:柱箱温度:190度,气化室温度:300,检测室温度:280,厂家用的色谱柱是OV-17毛细管柱。我学校的色谱柱是30QC3/AC20 0.5。我是按照这些条件做的,进样量0.1/0.2uL。出来的色谱图只有溶剂峰能和厂家给的色谱图对上,其他的峰都没有出来,只有许多很小的峰,而厂家给的的谱图中原料的峰也是很大的,可我却怎么也弄不峰来。溶液的浓度我试过了,从低到高,基本都一样,只出溶剂峰,其他就是一些很小的峰。我想请问大家,我应该从哪些方面解决这个问题呢?色谱柱不行?这两个差别大吗?条件不合适?谢谢大家能够给我提供宝贵意见!
请问各位老师能否提供些关于凝胶色谱柱埃值(凝胶孔径)与分子测定体积之间关系的资料呢。或者说如何通过色谱柱埃值来知道要分离物质分子量多少?或者通过分子量来确定所需色谱柱埃值。谢谢。