婴幼儿奶粉双氰胺检测——默克色谱柱快速解决方案
ZIC-HILIC色谱柱快速检测婴幼儿奶粉中双氰胺默克密理博应用实验室 2013-01-291 前言2013 年1 月,新西兰牛奶及奶制品被检测出含有低含量的有毒物质双氰胺(二氰二氨Dicyanodiamide,DCD),已经下令禁售含有DCD的奶制品。中国的进口奶粉八成来自新西兰,全球60%以上的奶源产自新西兰。新西兰奶农通常会在牧草上喷洒双氰胺,防止肥料中的副产品硝酸盐流入河流和湖泊。双氰胺 目前,还没有相应的食品含量标准和检测标准。默克密理博致力于分析方法的开发,为客户提供简便、快速的解决方案。双氰胺极性较强,易溶于水,中性及酸性条件下易电离,适合使用默克密理博的两性离子型亲水作用(ZIC-HILIC)色谱柱分离。同时,双氰胺在218nm下有强紫外吸收,可以采用ZIC-HILIC 色谱柱在HPLC-UV条件进行快速分析,亦可在LC-MS/MS进行痕量检测。 2 仪器及试剂2.1 仪器设备2.1.1 色谱柱:ZIC-HILIC, PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm, 5 &mu m, 200 Å (1.50458.0001)2.1.2 HPLC:Agilent 1260HPLC(DAD检测器)2.1.3 单道移液器TransferpetteS,Digital adjustable 500-5000ul(Brand:BR704782)2.1.4 微孔滤膜:0.45um,PTFE(Millipore:SLFHX13NL)2.1.5 纯水系统:Milli-Q3(Millipore)2.1.6 PP离心管:50mL,带盖,含底座(货号:114822BR)2.2 试剂2.2.1 色谱乙腈:LichroSolvAcetonitrile Gradient Grade(1.00030.4008)2.2.2 乙酸铵:Ammonium acetate for analysis EMSURE ACS,Reag. Ph Eur(1.01116.1000)2.2.3 甲酸:Formic acid 98-100% for analysis EMSURE ACS,Reag. Ph Eur(1.00264.1000)2.2.4 2%甲酸溶液:取20ml甲酸,加入1000ml超纯水中2.2.5 乙腈-甲酸溶液:取700ml乙腈(2.2.1),与300ml 甲酸溶液(2.2.4)混合3 实验方法3.1 样品处理方法1:取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管(2.1.6)中,加18mL 2%的甲酸水溶液,加盖密闭。摇振60秒,再超声30分钟,取出,再摇振60秒,放入离心机中离心(4000转),20分钟。取出,吸取上清液50ul,于10ml PP管中,加入950ul乙腈,加盖密闭,振摇60秒,吸取溶液,过滤,即得供试液。方法2:取婴幼儿配方奶粉2g于50mL PP管中,加20mL 乙腈-甲酸水溶液(2.2.4),加盖密闭。摇振60秒,再超声30分钟,取出,再摇振60秒,静置,吸取上层溶液,过滤,即得供试液。加标样品同法配制。3.2 测试条件3.2.1 色谱条件流动相 (v/v): A-醋酸铵溶液(10 mM),B-乙腈比例*:A:B=12:88流速:1 mL/min进样量:20ul*必要时设置如下方法对色谱柱进行再生和平衡:时间,min%%流速 ml/min 012881等度1012881等度10.530702再生1530702再生15.112882平衡202882平衡3.3 测试结果按照方法1处理,结果如下: 3.3.1 对照品图谱图1 对照品图谱(DCD浓度1.25ug/ml)双氰胺保留时间4.98min,理论塔板数13086,拖尾因子1.1. 3.3.2 无检出的奶粉空白图2 配方奶粉空白3.3.3 奶粉加标图3 奶粉加标(测试液中加入的标样浓度:5ug/ml)图4 奶粉加标(测试液中加入的标样浓度:0.05ug/ml)3.3.4 某知名品牌奶粉图5 某进口奶源的知名品牌奶粉图谱该品牌奶粉中未检出双氰胺. 4 结论采用ZIC-HILIC色谱柱,可用于双氰胺的快速检测。处理方法简单,色谱峰型良好,方法重现性良好(RSD2%),检测浓度在0.5-10ug/ml之间现行关系良好(R=0.999),加样回收率在95.6-101.5%之间。按照方法1的处理,LOD为1.3ug/g奶粉,按照方法二处理,LOD可达0.07ug/g。该色谱柱还能用于三聚氰胺、双氰胺、三聚氰酸、二甲双胍、尿素等的同时检测,如: 另外,LC-MS/MS采用如下色谱条件:色谱柱:ZIC-HILIC (5 µ m, 200Å ) PEEK 150x2.1 mm流动相:A: 95:5 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2OB: 50:50 ACN:0.1% formic acid/10 mM ammonium formate in H2O梯度方法Time (min)Solution A (%)Solution B (%)Flow rate (mL/min)Elution0.0-5.010000.400isocratic5.0-12.8100-250-750.400gradient12.8-15.825750.400isocratic15.8-16.010000.400equilibration16.0-24.910000.600equilibration24.9-25.010000.400equilibration详细方法可参考:FDA Laboratory Information Bulletin 4487Journal of Chromatography A 1220 (2012) 101&ndash 107更多详情,请拨打默克密理博实验室基础业务 400-889-1988