3月19日,天瑞仪器在北京召开“2012质谱仪系列新品媒体发布会”,面向媒体发布自主研发的三款质谱仪新品:GC-MS 6800气相色谱-质谱联用仪、LC-MS 1000液相色谱质谱联用仪、ICP-MS 2000电感耦合等离子体质谱仪。为使用户更加深入、直观地了解三款质谱仪,我们特别策划“质谱仪新品技术探讨系列网络讲堂”活动。网络讲堂共含两期,主讲人分别是质谱项目负责人周立博士、ICP-MS 2000项目经理丁志国。用户完成注册后,即可通过指定通道,进入网络讲堂现场。这是继“论坛竞猜赢iPhone 4S”、“质谱仪新品专题”后推出的又一次线上活动,天瑞仪器将再次通过网络,与所有支持国产质谱发展的朋友进行技术交流与探讨,届时,您还可以通过语音、视频、白板等工具与天瑞仪器质谱专家互动提问、交流探讨。同时,我们还为网络讲堂与会人员准备了精美纪念品,只要您参与提问即可赢取!足不出户,看天瑞质谱新品、侃质谱应用技术,拿精美青花瓷笔!天瑞仪器质谱新品网络大讲堂,诚挚邀请您来参与!了解详细并报名:http://www.skyray-instrument.com/cn/activity/MSvideo/index.html http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/04/201204131609_361124_2090336_3.jpg
——访赛默飞世尔科技的Orbitrap质谱仪发明人马可洛夫博士人类文明的发展越来越体现在对物质世界认识深化的科学和技术的进步上。质谱仪作为人类深入了解客观世界的主要工具之一,日益受到重视。质谱技术是分析技术中发展最快的。10年前中国质谱仪的拥有量仅在一百台左右,而今天已超过千台,用户对质谱仪的要求也在不断地提高。各大分析仪器公司无不投巨资激励科研人员创新技术提高质谱仪的性能,以满足客户的需求, 如飞行时间,离子阱技术都得到了一定的发展。在现有质谱技术中,傅里叶变换离子回旋共振质谱FT-MS的性能无疑是最强的, 然而其价格和运行维护成本也出现了直线的攀升,使客户欲拥有之又望尔却之。鱼和熊掌不能兼得,这似乎成了质谱仪发展的一条规律。然而,赛默飞世尔科技推出的静电场轨道阱(Orbitrap)质谱仪改写了这一规律使之成为历史。Orbitrap实现了二十年来质谱仪发展的革命性突破,在争攀高峰的质谱仪赛场上,犹如一匹腾飞的黑马越过所有的竞争对手,登上了一个全新的高峰。它的性能可与傅里叶变换离子回旋共振质谱FT-MS媲美,而它的价格尤其是运行维护成本则几乎达到了普及型仪器的水平,所实现的性/价比是其他同类仪器所望尘莫及的,这使它成为每个客户都值得拥有的鱼和熊掌兼得的白马王子。赛默飞世尔推出的新款复合型线性离子阱静电场轨道阱质谱仪(LTQ Orbitrap)一举夺得了2006年的Pittcon金奖(Gold award at Pittcon 2006)和2006年的百名世界研发精英奖(R&D 100 award for 2006)。Orbitrap质谱仪的发明人亚力山大 马可洛夫博士也因此在2007年获得了默克奖(Heinrich Emanuel Award)和俄罗斯质谱学会的金牌(Gold Medal from Russian for Mass Spectrometry)。《生物技术世界》杂志有幸专访了马可洛夫博士。通过专访我们了解了发明人的创新历程,赛默飞世尔科技对他进行大力支持所取得的成就,以及赛默飞世尔科技向客户提供的优质服务和勇于开拓应用的强者气魄。借此报道的机会我们将此次专访中获得的,有关这位带传奇色彩的发明天才科学家的创新历程和赛默飞世尔科技的成就的主要内容整理出来与读者分享。
【网络讲堂】:基于Orbitrap质谱的定量蛋白质组学技术新进展【讲座时间】:2015年01月29日 14:00【主讲人】:李静 (赛默飞世尔公司色谱质谱部应用研究中心质谱应用工程师,在赛默飞一直致力于蛋白质组学的技术支持,积累有丰富的分析经验。)【会议简介】1、 2015 CNHUPO生物质谱蛋白质定量高级研讨会新进展介绍2、 Thermo DIA(数据非依赖采集)定量技术新应用3、 Thermo TMT SPS MS3定量技术新应用-------------------------------------------------------------------------------1、报名条件:只要您是仪器网注册用户均可报名参加。2、报名并参会用户有机会获得100元手机充值卡一张哦~3、报名截止时间:2015年01月29日 13:304、报名参会: http://www.instrument.com.cn/webinar/meeting/meetingInsidePage/13225、报名及参会咨询:QQ群—231246773
[b]仪器信息网讯[/b] 2010年全国质谱大会曁第三届世界华人质谱研讨会将于7月30日在长春国际会展中心正式拉开序幕。在开幕的前一天,大会主办单位邀了中科院化学所的王光辉研究员、中国医科院基础医学研究所的李智立研究员、复旦大学的陆豪杰教授、北京协和医院的胡蓓教授以及沃特世公司和安捷伦公司的工程师分别进行了内容新颖的质谱技术培训讲座,使广大参会人员在其相关领域的质谱技术上得到了启迪和可借鉴的经验。培训讲座由中科院长春应化所的刘淑莹研究员主持。[align=center][img]http://bimg.instrument.com.cn/lib/editor/UploadFile/20107/201073051322457.jpg[/img][/align][align=center]质谱技术培训讲座现场[/align][align=center][img]http://bimg.instrument.com.cn/lib/editor/UploadFile/20107/201073074547744.jpg[/img][/align][align=center]王光辉研究员就小分子的激光电离研究进展进行讲解[/align] 来自中科院化学所的王光辉研究员给大家进行了题为《小分子的激光电离研究进展》的讲座。王光辉研究员具体介绍了MALDI中利用不同表面物理形态的靶(如多空硅及硅纳米丝)及不同基质(如铅笔芯及质子海面)检测小分子物质的方法和实例,并根据其导电性影响,给大家介绍了多种不同材质的样品靶,如聚四氟乙烯、胶带、陶瓷等。王老师的试验方法及结果很好的证明了MALDI进行小分子检测的能力,拓宽了MALDI检测的分子量范围,给大家在进行小分子检测时增加了新的思路和适用方法。[align=center][img]http://bimg.instrument.com.cn/lib/editor/UploadFile/20107/201073074622988.jpg[/img][/align][align=center]李智立研究员介绍傅里叶离子回旋共振质谱仪(FTICR-MS)在生物医学中的应用[/align] 接着,来自中国医科院基础医学研究所的李智立研究员就傅里叶离子回旋共振质谱仪(FTICR-MS)在生物医学中的应用给大家进行了详细的讲解。李老师具体介绍了FTICR-MS的原理及其主要功能,以及它在生物大分子、有机小分子及代谢产物和组织成像等领域中的主要应用和当前存在的问题。[align=center][img]http://bimg.instrument.com.cn/lib/editor/UploadFile/20107/2010730581960.jpg[/img][/align][align=center]陆豪杰教授介绍质谱大规模研究肿瘤蛋白质标志物的新技术新方法[/align] 复旦大学化学系的陆豪杰教授给参会人员介绍了质谱大规模研究肿瘤蛋白质标志物的新技术新方法。陆博士肯定了蛋白质组学在转化医学中所处的核心地位,蛋白质是肿瘤最主要的标志物,目前基于质谱的分析方法是目前大规模筛选肿瘤标志物的最有效手段。陆博士继而介绍了他们建立的复合材料富集低含量蛋白质、痕量蛋白质酶解、复合纳米材料富集糖蛋白、化学修饰磷酸化蛋白质这四种质谱分析新方法。[align=center][img]http://bimg.instrument.com.cn/lib/editor/UploadFile/20107/20107305823579.jpg[/img][/align][align=center]胡蓓教授介绍质谱技术在临床药理研究中的应用[/align] 来自协和医院的胡蓓教授给参会人员介绍了质谱技术在临床药理研究中的应用。胡教授主要介绍了他们正在进行的PK和PD/PK研究及其延伸性研究进展,以及药物的生物转化研究等内容。在定量分析方法学问题上,胡教授介绍了在临床研究中为保证生物标本定量分析的安全性和可靠性所需要符合的各项规范及其相关考核内容。[align=center][img]http://bimg.instrument.com.cn/lib/editor/UploadFile/20107/20107305949266.jpg[/img][/align][align=center]沃特世公司丁雁灵博士介绍SYNAPT G2 HDMS的离子淌度 高清质谱技术及应[/align][align=center][img]http://bimg.instrument.com.cn/lib/editor/UploadFile/20107/201073051010884.jpg[/img][/align][align=center]Agilent的王颖博士介绍安捷伦超高解析度质谱技术在药物代谢中的应用[/align] 除了以上4专家以外,来自沃特世公司丁雁灵博士和来自安捷伦公司的王颖博士也分别就SYNAPT G2 HDMS的离子淌度高清质谱技术及应用和安捷伦超高解析度质谱技术在药物代谢中的应用这两个主题进行了仪器介绍及相关实例讲解。SYNAPT G2 HDMS显示出了其优秀的分离及检测能力,而安捷伦超高解析度质谱的代谢产物鉴定软件可根据数据进行评分,并进行分子特征提取,大大提高了代谢产物选择的准确性。[url]http://www.instrument.com.cn/news/20100730/045713.shtml[/url]
生物质谱技术应用及进展 生物质谱因其高灵敏度、高准确度、快速、易于自动化等特点,在生命科学领域的应用和研究日益广泛。本文就其近年来在蛋白质、核酸、糖类、药物代谢以及微生物检验等方面的应用及进展作一综述。 生物质谱;电喷雾;基质辅助激光解吸附;串联质谱 O657.6 A Applications and progress on bio-mass spectrometry YING WAN TAO,QIAN XIAO HONG National Center of Biomedical Analysis, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850 For its high sensitivity, accuracy, high speed and easy to automate, bio-mass spectrometry develops very fast . This article reviews its applications and latest progress in the field of proteins/peptides, nucleotides, carbohydrates, pharmaceutical metabolism and microbiology in the past years. bio-mass spectrometry; electrospray ionization; matrix-assisted laser desorption ionization; tandem mass spectrometry 1 概述 生命科学的发展总是与分析技术的进步相关联,X射线晶体衍射对DNA双螺旋结构的阐述奠定了现代分子生物学的基础,使人类对微观领域的认识迈出了决定性的一步。原位PCR技术的出现使得生命科学在微观领域的研究不再是可望而不可及。大规模、自动化基因测序技术的问世,使本世纪生命科学领域最宏大的研究项目 人类基因组计划的实施比预期一再提前。而后基因组时代,即功能基因组和蛋白质组计划的实施所必需的高通量大规模筛选对分析方法又一次提出了挑战。已发展了一百多年的质谱技术,由于其所具有的高灵敏度,高准确度,易于自动化等特点,毫无疑问地成为解决上述问题的关键手段之一。 自1886年Goldstein发明早期质谱仪器常用的离子源,到1942年第一台单聚焦质谱仪商品化,质谱基本上处于理论发展阶段。随后质谱在电离技术和分析技术上的发展和完善,使之很快应用于地质、空间研究、环境化学、有机化学、制药等多个领域。然而,即使在等离子体解吸(plasma desorption, PD)和快原子轰击(fast atom bombardment, FAB)两项软电离质谱技术出现以后,质谱分析的相对分子质量也只是在几千左右。真正意义上的变革以80年代中期出现的两种新的电离技术:电喷雾电离(electrospray ionization, ESI)和基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)为代表,这两种技术所具有的高灵敏度和高质量检测范围,使得在fmol (10-15)乃至attomole(10-18)水平检测分子量高达几十万的生物大分子成为可能,从而开拓了质谱学一个崭新的领域棗生物质谱,促使质谱技术在生命科学领域获得广泛应用和发展。 2 生物质谱仪 目前商业化的生物质谱仪,其离子化方式主要是电喷雾电离与基质辅助激光解吸电离,前者常采用四极杆质量分析器,所构成的仪器称为电喷雾(四极杆)质谱仪(ESI-MS),后者常用飞行时间作为质量分析器,所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)。ESI-MS的特点之一是可以和液相色谱、毛细管电泳等现代化的分离手段联用,从而大大扩展了其在生命科学领域的应用范围,包括药物代谢、临床和法医学的应用等;MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加物的耐受能力高,且测样速度快,操作简单。此外可用于生物大分子测定的质谱仪还有离子肼(ion trap, IT)质谱和傅里叶变换离子回旋共振(fourier transform ion cyclotron resonance, FTICR)质谱等。而最近面市最新型的生物质谱仪是液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱仪(LC-ESI-MS-MS)与带有串联质谱功能的MALDI-TOF质谱仪,前者是在传统的电喷雾质谱仪的基础上采用飞行时间质量分析器代替四极杆质量分析器,大大提高了仪器的分辨率、灵敏度和质量范围,其商品名有Q-TOF和Q-STAR等;后者是在质谱中加入了源后降解(post-source decay, PSD)模式或碰撞诱导解离(collisionally induced dissociation, CID)模式,从而使生物大分子的测序成为可能。 3 生物质谱的应用 3.1 蛋白质和多肽的分析 3.1.1 分子量测定 分子量是蛋白质、多肽最基本的物理参数之一,是蛋白质、多肽识别与鉴定中首先需要测定的参数,也是基因工程产品报批的重要数据之一。分子量正确与否往往代表着所测定的蛋白质结构正确与否或者意味着一个新蛋白质的发现。生物质谱可测定生物大分子分子量高达400KDa,准确度高达0.1%~0.001%,远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。 3.1.2 肽谱测定 肽谱是基因工程重组蛋白结构确认的重要指标,也是蛋白质组研究中大规模蛋白质识别和新蛋白质发现的重要手段。通过与特异性蛋白酶解相结合,生物质谱可测定肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint, PMF),并给出全部肽段的准确分子量,结合蛋白质数据库检索,可实现对蛋白质的快速鉴别和高通量筛选。PMF常和胶上原位酶解相结合,成为蛋白质组研究中必不可少的一种手段。此外根据肽段质量数变化,可对基因产品的插入、缺失、突变进行对比分析。 3.1.3 肽序列测定技术 构成蛋白质的常见氨基酸有20种,一段3个氨基酸的肽段碎片将有8,000种可能的排列方式,4个氨基酸将有160,000种排列方式,即一个特定的4个氨基酸序列的出现概率为1/160,000。因此,即使对于一个相当大的蛋白质组来说,五、六个氨基酸残基的序列片段已具有很高的特异性。串联质谱技术可直接测定肽段的氨基酸序列,从一级质谱产生的肽段中选择母离子,进入二级质谱,经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂,由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列,用于数据库查寻,称之为肽序列标签技术(peptide sequence tag, PST),目前广泛应用于蛋白质组研究中的大规模筛选。较之传统的Edman降解末端测序技术,生物质谱具有不受末端封闭的限制、灵敏度高、速度快的特点。另外,一种间接的肽序列测定技术即肽阶梯序列技术(peptide ladder sequence),通过末端酶解或化学降解,产生一组相互之间差一个氨基酸残基的多肽系列,经MALDI-TOF-MS鉴定后,由所得到的肽阶梯图中各肽段的分子量差值确定末端的氨基酸序列,从而用于数据库查寻。
目前越来越多的环境监测、排放源监测、工业控制方面运用到了在线质谱技术。这一技术以高特异性和高灵敏度得到了广泛的认可。那么什么是在线质谱技术?其内涵有哪些分类可以选择呢?以下就来简单介绍一下:质谱分析法是测量离子质荷比的分析方法,离子质荷比即质量-电荷比。其遵循样品导入→离子源→分析器→检测器的方式,将样品导入离子源中发生电离,生成带电荷离子,然后运用加速电场将离子束引入分析器中,再利用电场和磁场使其发生相反的速度色散,再将它们聚焦起来而得到质谱图,从而确定其质量。而在线质谱则是在这之后增加了数据处理和控制系统、并可以将有效数据上传至云服务器,达到远程、实时查看及数据分析的目的。质谱技术根据样品导入、离子源、分析器、检测器等均有着不同的分类和组合方式,可谓种类繁多。按样品导入可分为:1)直接引入,将低挥发性、热稳定性好的样品直接装在探针上进行电流极具加热,样品在高温下挥发形成蒸汽,蒸汽被引至离子源中离子化。2)间接引入,色谱引入和膜进样。色谱引入是将样品通过毛细管导入至离子源。而膜进样则是采用硅聚合半透膜,阻挡基体和溶剂,并使小分子有机物通过膜壁。按电离技术主要包含:1)等离子体解吸2)快原子轰击3)电喷雾4)基质辅助激光解吸按离子源主要包含:1)电子电离,其离子化试剂为电子,适宜气态样品2)化学电离,其离子化试剂为气体离子,适宜气态样品3)解吸电离,其离子化试剂为光子、高能粒子,适宜固态样品4)喷雾电离,其离子化试剂为高能电场,适宜热溶液按分析器主要包含:1)双聚焦质谱仪2)四极杆质谱仪3)飞行时间质谱仪4)离子阱质谱仪5)傅立叶变换质谱仪按检测器主要包含:1)电子倍增管2)离子计数器3)感应电荷检测器4)法拉第收集器按属性组合主要包含:1)[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]质谱仪2)液相色谱质谱仪3)基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪4)傅里叶变换质谱仪5)火花源双聚焦质谱仪。6)感应耦合等离子体质谱仪。7)二次离子质谱仪这些分类只是目前质谱分析的主要分类,根据分析样品和目的的不同,运用不同的技术和组合会衍生更多的应用分类。在线质谱设备专业性相对较强,针对客户不同的要求、检测环境和检测物质等都有着不同的仪器配置方案。
由美国质谱学会(ASMS)主办的第59届美国质谱学术交流会于2011年6月5日-9日在美国丹佛市召开,仪器信息网编辑亲临现场。在此次质谱界大腕云集的会议现场,本网编辑现场采访了力可、岛津、Advion BioSciences、布鲁克、IonSense、安捷伦六家公司的相关人员,就各家质谱新品、质谱技术发展前景、质谱市场等进行了探讨。 力可:质谱领域的“后起之秀”——访力可公司亚太及非洲区域副总裁庄皓谨(John Hawkins)先生 美国力可公司(LECO)在金属工业分析领域尤其是元素分析方面一直处于国际领先地位,主打产品有碳硫分析仪、氧氮分析仪以及氢分析仪等。力可公司在70年代已经进入中国市场,据力可公司统计到目前为止已经在中国销售超过4000台设备。近年来力可公司大力向质谱领域扩展,虽然目前力可公司在这方面还是一个新“玩家”,但是推出的产品极具特色和冲击力,其最新产品飞行时间质谱仪在Pittcon 2011展会上一举夺得金奖。 三重四极质谱需求大增 岛津意在以速度取胜——访岛津美国分公司Scott A. Kuzdzal先生和岛津公司飯田顺子博士 Scott A. Kuzdzal博士预计在很短的时间内,三重四极杆质谱的需求将会呈现爆炸式增长,在各类质谱市场中成为份额最大的一部分;与去年同期相比,三重四极杆质谱的市场竞争不论是在全球还是在中国都将加剧,应用领域持续扩大,例如越来越多的质谱仪器应用于临床领域;很多质谱厂商的重点也会放在UHPLC和三重四极杆质谱上。岛津公司是质谱类产品主要供应商之一,去年岛津首次推出了三重四极杆液质联用仪,是三重四极杆液质联用仪市场的强有力竞争者。 质谱NanoMate离子源:市场需求潜力巨大——访美国Advion BioSciences公司董事长兼首席科学官、康奈尔大学Jack Henion教授 Advion BioServices是康奈尔大学Jack Henion教授1993年创办的公司,当时主要业务是CRO(医药外包)服务,即专门向制药公司提供LC及LCMS分析服务。在2002年,Advion推出了NanoMate芯片纳升电喷雾电离源(chip-based nanoelectrospray ion source)。NanoMate集馏分收集和芯片电喷雾技术于一体,把质谱和液相技术结合在一起,可为分析复杂样品提供更多的信息。结合FTMS、Orbitrap 或是TOF等高分辨率的质谱技术,NanoMate特别适合蛋白质鉴定、药物分析、代谢组学、脂质组学等涉及复杂基质和分析物的研究。布鲁克、IonSense、安捷伦的专访随后发布,请密切关注仪器信息网人物专访栏目:http://www.instrument.com.cn/interview/
主要讲解质谱分析原理,包括质谱技术发展的历史和主要技术原理以及技术参数。
质谱法可以进行有效的定性分析,但对复杂有机化合物分析就无能为力了,而且在进行有机物定量分析时要经过一系列分离纯化操作,十分麻烦。而色谱法对有机化合物是一种有效的分离和分析方法,特别适合进行有机化合物的定量分析,但定性分析则比较困难,因此两者的有效结合必将为化学家及生物化学家提供一个进行复杂化合物高效的定性定量分析的工具。这种将两种或多种方法结合起来的技术称为联用技术(Hyphenated Method),利用联用技术的有[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]一质谱(G-MS)、液相色谱一质谱([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url])、毛细管电泳一质谱(CZE-MS)及串朕质谱(MS-MS)等,其主要问题是如何解决与质谱相连的接口及相关信息的高速获取与贮存等问题。
1书籍名称:色谱质谱联用技术2作者:盛龙生,苏焕华,郭丹滨3出版社:化学工业出版社4封面:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/05/201305041225_438232_2649431_3.png5内容简介:第一章 气象色谱-质谱联用技术第一节 概述;第二节 GCMS主要性能指标;第三节 GCMS仪器配置;第四节 GCMS的真空技术;第五节 GCMS的质谱技术;第六节 GCMS中的气相色谱技术;第七节 GCMS应用相关技术第二章 液相色谱-质谱联用技术第一节 ESIMS及其原理;第二节 APCI基本原理;第三节 液相色谱-质谱联用中的进样和色谱技术;第四节 液相色谱-质谱联用中的质谱技术 第五节 应用及有关原理与技术6本书重点讨论GCMS及LCMS的相关原理,操作要点,数据采集与处理,谱库检索和典型应用实例,以帮助初学者快速掌握质谱学的基本理论,方法和技术。
各位使用色谱质谱版友,大家好。可能大家对仪器的使用都比较熟悉,但是仪器相关技术方面的知识了解各有差异,借这个平台大家一起来讨论下。现有几个问题供大家参考,可以根据自己的实际情况选择回答,也可以进行补充。1、目前所在行业,使用的仪器?2、是否了解电子压力(流量)控制(EPC/AFC),相对于手动控制载气压力流量有哪些优点?3、质谱定性时,NIST谱库匹配度是主要判断依据,还是仅为参考?4、色谱质谱并用技术有过了解吗,会有哪些优势,和色谱质谱联用又有哪些区别? 5、为什么离子阱技术,主要是在液相质谱联用上?回答范例:1、第三方检测机构,7890A-5975C2、不了解,现在用的仪器可以直接在软件设置压力和流量3、质谱定性时,目前主要是和标样比对,很少用NIST谱库4、不了解,我现在用的应该是联用吧,并用是不是样品通过色谱柱后,流向两个不同的检测器5、应该是离子阱多级质谱功能,在大分子化合物分析鉴定方面有优势吧,而大分子气相分析不了
二、质谱技术在医学检验中的主要应用1、质谱技术在临床生化检验中的应用质谱技术在应用较早的国家已成为继免疫学方法和化学发光法之后的第三大生化检测技术。目前采用质谱技术检测的项目数量虽然与其他两种方法相比还有很大差距,但越来越多的生化检测项目正被转移至质谱技术平台进行检测;质谱技术也成为生化检验领域新兴的发展方向和不可或缺的重要技术[6]。质谱技术在临床生化检验中应用最为成熟的项目主要包括:生化遗传检测、治疗药物监测、类固醇激素检测、营养素检测以及毒理学检测。技术高特异性的特点可有效避免结构类似物对检测结果的影响,为临床提供更准确的结果,提高患者的依从性。技术高灵敏度的特点可在很大程度上弥补内分泌类固醇激素检测中,低浓度化合物检测困难和测不准的难题,为疾病的预测和诊疗分型提供准确结果。国外许多内分泌实验室已经将大部分体内激素类物质的检测由放射免疫学方法或免疫学方法转换为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS方法,并将质谱技术作为内分泌类固醇激素类物质检测的首选方法。质谱技术一次可检测多种化合物的特点,可提高检测通量、减少样品用量和降低检测成本。如在生化遗传检测中,质谱技术一次可分析60多种氨基酸和酰基肉碱,筛查40余种新生儿遗传代谢病;在营养素检测中一次可分析20种氨基酸、20种脂肪酸、10余种微量元素或5种脂溶性维生素,有效提高了检测通量、减少了样品用量,并提供了丰富的检测信息;在毒理学检测中一次可检测尿液中19种药物,实现了高通量、快速高效的药物筛查技术[7]。在临床生化检验领域,质谱技术相比于传统方法的优势较为突出,但随着技术的深入应用与经验的积累,技术应用的缺点也逐步凸显出来,包括质谱技术应用的陷阱问题、实验室日常运行过程中的管理问题以及相关政策法规问题等,主要体现在:(1) 质谱技术在分析基质复杂的生物样本时,检测结果易受到基质效应、结构类似物干扰以及质谱信号产生的不稳定所带来的干扰影响;对这些问题认识和预防不当,则质谱的检测结果将存在较大的错误风险;(2) 质谱技术相比于免疫学方法和化学发光法,检测的自动化程度较低,对人员依赖性较大;同时各厂家仪器系统还未实现与临床实验室信息管理系统 (LIS) 的接口双向对接,在数据处理和报告发放环节,仍未实现自动化;(3) 对于质谱技术应用较成熟的项目,检测数据仍缺乏统一的应用标准[4];(4) 质谱技术检测方法所需的标准物质、试剂和耗材等,目前主要依赖于进口,较多的检测项目受限于这些因素而开展受阻;(5) 目前质谱实验室的方法基本为自建方法,标准化和规范化较为薄弱。美国临床实验室标准化协会已发布了临床质谱的使用指南[8],中华医学会检验医学分会、卫生计生委临床检验中心和《中华检验医学杂志》编辑部也于2017年10月份共同发布了《[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱临床应用建议》[9],这些都为质谱技术临床检测工作提供良好了的指导和参考;(6) 由于质谱技术较为复杂,仪器构成多样化,在实际的应用过程中,需要有经验的专业技术人才进行规范的使用操作,但目前国内相关的技术人才匮乏;质谱实验室的仪器设备昂贵,对于安装条件有特殊要求,建设需要投入大量的资金;这些使得质谱技术临床应用的门槛较高,一定程度上限制了技术的应用;(7) 在日常运营过程中仪器的维修服务成本较高,维修周期较长,维修的及时性也存在不能满足临床检测的报告周期固定性的要求;(8) 国内对于质谱技术在临床的应用监管还不成熟,相关的检测项目在临床上无收费标准,也在一定程度上限制了技术的应用普及。虽然质谱技术的应用仍存在较多缺陷,但随着技术的革新与发展,应用监管的成熟,各项瓶颈将被不断突破,未来随着质谱仪器的各项性能的提升;前处理自动化的实现;检测数据自动输出并实现与实验室信息系统的双向对接,以及结果报告自动预警功能的实现,质谱仪有望像免疫学方法和化学发光法一样,成为临床生化检验中自动化、智能化、易用化的检测平台。2、质谱技术在微生物检验中的应用近年来,MALDI-TOF技术已成功应用于微生物的鉴定及分型,并逐渐成为微生物鉴定的主流技术,可快速检测和鉴定革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌、分枝杆菌、酵母菌和丝状真菌等[6,10-14]。相比于传统的革兰染色、菌落形态、表型鉴定及分子生物学技术, MALDI-TOF技术具有快速、准确、经济、高通量等优点。MALDI-TOF是基于细菌表面蛋白分子检测的技术,通过测定未知微生物自身独特的蛋白质指纹图谱及特征性的图谱峰,并与数据库中参考菌株的蛋白指纹图谱进行比对,从而实现菌株的鉴定[11]。该技术是将完整的微生物细胞直接进行检测,样品制备简单,检测周转时间短,在数分钟内就可以得到一个菌种的测试结果,且分析用菌量极少,而传统方法完成常规细菌鉴定至少需要8~18h或更长时间。MALDI-TOF通过检测细菌胞膜成分或表达的特异蛋白对细菌进行种群的鉴别,敏感性和准确性高,可以区分表型相似或相同的菌株,提供属、种、型水平的鉴定,对临床常见分离菌鉴定到种水平的准确率很高。以16S r RNA基因测序结果为标准,质谱检测结果准确率为90.0%~95.0%[15],不仅可以识别病原菌,而且有助于发现新的病原菌。此外,质谱技术还用于病原体的药物敏感性检测,常规的药物敏感性实验方法比较费时,局限于少数细菌,MALDI-TOF通过比对耐药菌株和药物敏感菌株间的特征性蛋白和图谱峰及检测耐药菌株与抗生素共培养后的分解产物,可以分析几乎所有的耐药机制。研究表明,相比于标准的微生物培养技术,质谱技术可降低约50%的试剂成本和劳动力成本[16]。但是,MALDI-TOF作为一项新兴技术,在微生物鉴定方面也存在着一定的局限性。如对于具有特殊结构的菌种和图谱极为相似的菌种的鉴定区分存在一定的难度、对于一些罕见菌种或新型细菌鉴定困难、对血培养样本中的混合菌种难以准确鉴别等,原因是质谱数据库中标准菌株的图谱有限、质谱峰的数据不充分以及细菌库中无这些菌株[17,18]。随着仪器技术参数、质谱数据库及分析软件的不断更新完善,所有的分离株将被逐步的明确鉴定出来。因此,随着质谱技术在临床微生物实验室的应用数据库进一步完善,MALDI-TOF技术必将在微生物鉴定、菌种分型、同源分析、耐药监测等多方面发挥出更大作用,有望成为新一代病原微生物诊断的常规技术。3、质谱技术在核酸检测中的应用核酸质谱检测技术是在MALDI-TOF原理的基础上,结合引物延伸分析法和碱基特异裂解分析法,针对双链DNA的特性进行了特殊优化,使样品在电离过程中不产生或产生较少的碎片离子,可用于检测核酸的分子量和研究基因组单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) ,是近年来应用于临床核酸检测的新型软电离生物质谱[19]。相比于以凝胶电泳为基础的测序法,质谱技术具有分辨率高、分离速度快、杂质干扰少的优点,被广泛应用于核酸测序、核酸指纹图谱、核酸SNP分析等[20]。SNP是指基因组DNA序列上某个位置单个核苷酸碱基的差异,即基因位点的突变,在人群中的发生频率大于1%,是决定个体疾病易感性和药物反应性差异的重要因素,通过分析突变的位点,可预测疾病,并提供诊断意见和指导用药。MALDI-TOF分析检测SNP是根据不同的分子量将等位基因排序,区分和鉴别相对分子量达7000左右 (含20多个碱基) 、仅存在1个碱基差别的不同DNA,可以精准地分辨到碱基种类。药物代谢酶遗传多态性是产生药物毒副作用、降低或丧失药物疗效的主要原因之一,通过检测药物代谢酶的基因型可对临床用药方案进行指导和调整,为临床个体化用药提供依据。以往检测药物代谢酶基因多态性通常采用化学法,依赖于核苷酸的互补性对核酸序列进行分析,对于序列的长度、复杂性、反应条件等都具有较高的要求,容易受到不同程度的化学因素干扰,导致检测结果出现偏差。若能将化学和物理方法结合起来对药物代谢酶基因进行检测,将极大提高检测结果的准确性。MALDI-TOF是药物代谢酶基因多态性的新型检测方法,其根据核苷酸分子被电离后在真空管中的飞行时间来确定其分子量大小,最终确定核苷酸序列,检测结果仅仅依赖于核酸分子量。经过验证比较,MALDI-TOF检测结果与Sanger测序的结果符合率为100%[21,22]。传统的Sanger测序方法虽然是序列测定的金标准,但其操作步骤繁琐费时和试剂成本高等限制了其临床应用。MALDI-TOF可通过一次实验检测多个标本的多个突变,实现基因型的高通量、快速检测,为个体化用药提供更加多样化的检测手段。4、质谱技术在蛋白质组学中的应用质谱技术可检测蛋白质的氨基酸组成、分子量、多肽或二硫键的数目与位置及蛋白质的空间构象等,从而实现未知肽段的筛选、测序、肽指纹图谱、蛋白质表达谱、蛋白质翻译后修饰谱、全蛋白完整无损分析等。质谱多样化的前端连接方式极大地促进了研究者对基础蛋白科学领域的认识,但将这些认识转变为对临床实践的有效信息则有相当大的难度。到目前为止,基于质谱技术的将蛋白组学多样性的蛋白和多肽标志物, 成功应用于临床检测的案例并不多见[22]。相反,对于已知的、确定的多肽和蛋白标志物即目标蛋白组学,质谱技术得到了较好的应用。目前,已经有一些关于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS用于临床目标多肽和蛋白分析的文章发表,如甲状腺球蛋白 (Tg) 和淀粉样蛋白的鉴定与定量分析等[23-25]。质谱技术在这一领域的应用,在很多情况下均可为临床提供有价值的信息[21],如对某一分析物的免疫学方法不存在时;已经存在的免疫学方法不能给出某些临床关键问题的答案时;已经存在的免疫学方法存在干扰时;某一分析物存在多个异构体时;对同一分析物的检测,不同的检测方法间存在较大的结果变异性时;已经存在的分析方法流程较为复杂时,质谱技术均可发挥相应作用,弥补免疫学方法的不足。质谱技术在医学检验领域中应用的下个目标和挑战,是如何弥补免疫学方法在蛋白和多肽检测方面的局限性。相信随着技术的发展,这方面的突破会越来越多,为临床提供更多的有价值的质谱检测数据。【参考文献】[1]潘柏申.迎接质谱技术进入检验医学领域[J].中华检验医学杂志, 2017, 40 (10) :733-736.[2] Jannetto PJ, Fitzgerald RL.Effective use of mass spectrometry in the clinical laboratory[J].Clin Chem, 2016, 62 (1) :92-98.[3] 韩丽乔, 庄俊华, 黄宪章.质谱技术及其在临床检验中的应用[J].检验医学, 2013, 28 (3) :252-256.[4] 张自强, 李岩.质谱技术在临床生化检测中的应用[J].检验医学, 2015, 30 (5) :407-409.[5] 李水军, 王思合.[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱技术的临床应用进展[J].临床检验杂志, 2016, 34 (12) :881-884.[6] Vogeser M, Seger C.Quality management in clinical application of mass spectrometry measurement systems[J].Clin Biochem, 2016, 49 (13-14) :947-954.[7] 王思合, 程雅婷, 赵蓓蓓.临床色谱质谱检验技术[M].北京:人民卫生出版社, 2017.[8] 沈立松, 马妍慧.质谱技术在检验医学中的应用现状和前景[J].诊断学理论与实践, 2012, 11 (5) :536-538.[9] 中华医学会检验医学分会, 卫生计生委临床检验中心.[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱临床应用建议[J].中华检验医学杂志, 2017, 40 (10) :770-779.[10] Van Veen SQ, Class ECJ, Kuijper EJ.High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories[J].J Clin Microbiol, 2010, 48 (3) :900-907.[11] Robert PR, Brosnikoff C, Turnbull L, et al.Multicenter evaluation of the vitek 2 anaerobe and Coryne bacterium identification card[J].J Clin Microbiol, 2008, 46 (8) :2646-2651.
21世纪的最前沿科学之一,随着人类第一张基因序列草图的完成和发展,生命科学的研究也将进入一个崭新的后基因组学,即蛋白质组学时代。正如基因草图的提前绘制得益于大规模全自动毛细管测序技术一样,后基因组研究也将会借助于现代生物质谱技术等得到迅猛发展。本文拟简述生物质谱技术及其在生命科学领域研究中的应用。1 质谱技术质谱( Mass SPectrometry)是带电原子、分子或分子碎片按质荷比(或质量)的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离,并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。质谱分析的基本原理用于分析的样品分子(或原子)在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子,进入由电场和磁场组成的分析器,离子束中速度较慢的离子通过电场后编转大,速度快的偏转小;在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转,即速度慢的离子依然偏转大,速度快的偏转小;当两个场的偏转作用彼此补偿时,它们的轨道便相交于一点。与此同时,在磁场中还能发生质量的分离,这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上,不同质荷比的离子聚焦在不同的点上,其焦面接近于平面,在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线,即质谱。通过质谱分析,我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息。质谱技术的发展质谱的开发历史要追溯到20世纪初J.J.Thomson创制的抛物线质谱装置,1919年Aston制成了第一台速度聚焦型质谱仪,成为了质谱发展史上的里程碑。最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量,随着离子光学理论的发展,质谱仪不断改进,其应用范围也在不断扩大,到20世纪50年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。现今,质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领域,在固体物理、冶金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命科学领域的应用,更为质谱的发展注入了新的活力,形成了独特的生物质谱技术。 2 生物质谱技术电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围,使得在pmol(10-12甚至fmol(10-15的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能,从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域,并得到迅速的发展。以下主要介绍与生物医学有关的几项质谱技术。电喷雾质谱技术电喷雾质谱技术(Electrospray Ionizsation MassSpectrometry,ESI-MS)是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子,使质量电荷比(m/z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用,如液一质联用([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url])是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。基质辅助激光解吸附质谱技术基质辅助激光解吸附质谱技术(MatriX AssistedLaser Desorption /Ionization,MALDI)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,致使基质和分析物膨胀并进入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子,因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有—一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测,理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的,因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。快原子轰击质谱技术快原子轰击质谱技术是一种软电离技术,是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品,使样品离子溅出进入分析器,这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析,特加适用于多肽和蛋白质等的分析研究。只能提供有关离子的精确质量,从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS-MS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息,从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。同位素质谱是一种开发和应用比较早的技术,被广泛地应用于各个领域,但它在医学领域的应用只是近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力,该化合物又易于用同位素标示,人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含量以达到检测该病原菌的目的,同时也为同位素质谱在医学领域的应用开辟了一条思路。3 生物质谱技术的应用随着质谱技术的不断改进和完善,质谱的应用范围已扩展到生命科学研究的许多领域,特别是质谱在蛋白质、医学检测、药物成分分析及核酸等领域的应用,不仅为生命科学研究提供了新方法,同时也促进了质谱技术的发展。质谱与蛋白质分析蛋白质分子量的测定 蛋白质类生物大分子分子量的测定有着十分重要的意义,如对均一蛋白质一级结构的测定,既要测定蛋白质的分子量,又要测定亚基和寡聚体的分子量及水解、酶解碎片的分子量。常规的分子量测定主要有渗透压法、光散射法、超速高心法、凝胶层析及聚丙烯酸胺凝胶电泳等。这些方法存在样品消耗量大,精确度低易受蛋白质的形状影响等缺点。MALI-MS技术以其极高的灵敏度、精确度很快在生物医学领域得到了广泛的应用,特别是在蛋白质分析中的应用,至今已被分析的蛋白质已有数百种之多,不仅可测定各种亲水性、疏水性及糖蛋白等的分子量,还可直接用来测定蛋白质混合物的分子量,也能被用来测定经酶等降解后的混合物,以确定多肽的氨基酸序列。可以认为这是蛋白质分析领域的一项重大突破。蛋白质组研究 蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律,包括细胞内所有蛋白质的分离、蛋白质表达模式的识别、蛋白质的鉴定、蛋白质翻译后修饰的分析及蛋白质组数据库的构建。质谱技术作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一,除了用于多肽、蛋白质的质量测定外,还广泛地应用于肽指纹图谱测定以及氨基酸序列恻定等。肽指纹图谱( PePtide Mass Fingerprinting,PMF)测定是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法,对质谱分析所得肽片与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽片进行比较,从而判别所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列,因而不同蛋白质所得肽片具有指纹的特征。采用肽指纹谱的方法已对酵母、大肠杆菌、人心肌等多种蛋白质组进行了研究。对大肠杆菌经PVDF膜转印的蛋白质的研究表明,三个肽片即可达到对蛋白质的正确识别。而采用原位酶解的方法对酵母蛋白质组研究的结果显示,约90%的蛋白质被识别,其中三十多种新蛋白质被发现,而这些蛋白质是酵母基因组研究中未能识别的开放阅读框架。研究显示,肽指纹谱的方法比氨基酸组成分析更为可靠,这是因为MALDI测定肽质量的准确度为99.9%,而氨基酸组成分析的准确度仅为90%。另外MALDI可以耐受少量杂质的存在,对于纯度不是很高的样品也能得到理想的结果。对肽序列的测定往往要通过串联质谱技术才能达到分析目的,它采用不同的质谱技术选择具有特定质荷比的离子,并对其进行碰撞诱导解高,通过推断肽片的断裂,即可导出肽序列。质谱与核酸研究现代质谱技术自诞生以来在多肽及蛋白质的研究中获得了极大的成功,于是人们开始偿试着特质谱技术用于核酸的研究工作,近年来合成寡核苷酸及其类似物作为反义治疗剂在病毒感染和一些癌症的治疗方面有着良好的前景,寡核苷酸作为药物其结构特征必须进行确证。常规的色谱或电泳技术只能对其浓度和纯度进行分析,而对其碱基组成、序列等结构信息却无能为力。ESI和MALDI质谱技术的出现为寡核苷酸及其类似物的结构和序列分析提供了强有力的方法,它是将被测寡核苷酸样品先用外切酶从3’或5’端进行部分降解,在不同时间内分别取样进行质谱分析,获得寡核苷酸部分降解的分子离子峰信号,通过对相邻两个碎片分子质量进行比较,可以计算出被切割的核苷酸单体分子质量,将其与四个脱氧苷酸的标准分子量进行对照,就可以读出寡核苷酸的序列。由于MALDI技术分辨率的问题,使得其更适合于减基数较少的短链核酸的分析。如何获得高分辨率的DNA质谱图一
引 言在过去的30 年里,质谱技术尤其是测定生物大分子的生物质谱技术有飞速的发展,电喷雾离子化(ESI) 和基质辅助激光解吸电离(MALDI)离子化技术的发现为质谱的生物应用奠定基础;质谱的分辨率、灵敏度、准确度也达到很高的水平,生物质谱在蛋白、多肽领域得到广泛地应用,在核酸研究领域,质谱也逐渐发挥越来越重要的作用。下面分别介绍质谱技术、核酸的质谱检测方法以及质谱在核酸领域的应用。1 质谱技术简介质谱是测定物质分子量的工具,简单地说,质谱的操作部件由软件和硬件两部分组成。硬件主要包括三个核心硬件,分别为样品离子化、质量分析器(M/Z) 和离子检测器;软件部分包括机器的控制和质谱数据的分析处理。样品离子化有多种方法,在过去的20 多年,质谱领域的重大进展之一就是ESI 和MALDI 离子化方法的发现,可以在比较温和的条件下产生离子,这大大促进质谱在生物领域的应用。ESI 和 MALDI 离子化的原理在文献 中已经详细的介绍,这里不再详述。电喷雾离子化的特点是产生多电荷离子,使质量电荷比(m/z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展分子量的分析范围。电喷雾离子化根据喷射源液体流量的大小,可分为纳升、微升、电喷和涡轮离子喷射。 MALDI 是通过气化的带电基质和样品之间发生碰撞,把激光的能量传递给样品,从而导致样品的离子化。它也是一种软电离技术,适用于混合物及生物大分子的测定。质量分析器是质谱的核心,目前质谱的质量分析器有四类:离子阱(Ion Trap)、飞行时间(Time of Flight,TOF)、四极杆(Quadrupole) 和傅立叶变换离子回旋共振。它们在设计和构造上各有不同,因而各有优缺点。质量分析器决定整个机器的分辨率、质量准确性、敏感性和质量检测范围。离子阱质量分析器使用频率分离离子,具有中等的质量准确度,且测量的质量范围有限。傅立叶变换离子回旋质谱使用频率分离离子,具有很高的质量准确度和分辨率,但傅立叶变换离子回旋质谱价格昂贵、仪器操作复杂。飞行时间分析器使用时间和距离分离离子,具有较高的质量准确度和分辨率,测量的质量范围大。四极杆质量分析器使用频率分离离子,具有较低的质量准确度和分辨率,且测量的质量范围有限。这些质量分析器的发明促进质谱的应用。近10 年来,质谱的重要进展体现在两个方面:(1)质谱技术的第一个重要进展就是开发串联质谱,就是对上述质量分析装置进行不同的组合,以达到特异性的目标;(2)质谱另一个重要进展不是在于技术层面上,而是在仪器化方面,商业化的仪器推动质谱在应用领域里的快速发展。各厂家为满足客户的需要,尤其是生命科学领域的需要,组合不同的特殊电离技术以及各种质量检测器,生产出超高分辨率、高灵敏度、宽质量范围的质谱仪;把质谱与气相色谱、高效液相色谱系统联用,大大拓宽质谱应用范围。下面主要介绍一些有代表性的质谱仪。傅立叶变换- 离子回旋共振质谱(Fourier Transform ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer, FT-ICR-MS) 具有超高质谱分辨率、高质量测量准确度、回旋池内现场反应等显著优点。生产傅立叶变换- 离子回旋共振质谱的主要厂家有 Thermo Fisher 和Bruker。Thermo Fisher 的LTQ-FT 是串联线性离子阱 FT-ICR,而Bruker 的APEX-Qe 是三级四极杆和FT-MS 的结合; FT-ICR-MS 质量准确度达1~2ppm, 分辨率超过105。静电场轨道阱(Orbitrap) 质量分析器,是第一个在静电场中进行离子捕获的高性能质量分析器,基于这一分析器,开发LTQ orbitrap 质谱仪。该机器使用线性离子阱实现离子分离、裂解以及多级质谱功能。它在质量准确度、分辨率、动态范围、灵敏度以及多级质谱能力等方面具有明显优势,具有高达30 万的分辨率。它与LTQ FT 线性离子阱回旋共振质谱仪有相近的工作原理,但仪器运行时无需消耗大量制冷剂,能够在降低运行成本的同时得到高分辨率的数据结果。MALDI - TOF 质谱采用一系列的新技术, 如提供二阶无网离子反射器,延长离子在飞行管中的飞行距离, 飞行路径可达3m ;创新的使用LIFTTM 技术来提升能量,可高速完成高质量的MS/MS 质谱数据;采用独有的PANTM 全景宽域聚焦技术,可以在非常宽的质量范围内获得大于25000 的分辨率。MALDI - TOF 质谱可用来分析较为复杂的混合物,在样品含量低于10-12mol 时,分子量的测定仍有相当高的灵敏度和分辨率。近年来发展的MassARRAY ™时间飞行质谱生物芯片系统由美国Sequenom 公司开发,是目前唯一采用质谱法直接检测单核苷酸多态性(SNP)的设备。该系统的突出特点是能以极高的精确度快速进行基因型识别,直接测出带有SNP 或其他突变的目标DNA。MassARRAY ™系统反应体系为非杂交依赖性,不存在潜在的杂交错配干扰,不需要各种标记物,其采用的高密度SpectroCHIP ™点阵芯片分析系统能在4h 之内完成多达3840 个多重性鉴定,每个检测点只需3~5s,结果实现全自动分析。这套系统所提供的大规模、高通量检测SNP 的技术平台,在当前疾病机制研究中发挥重要作用。
[i]国外医学临床生物化学与检验学分册;2002年,第23卷,第6期:352-353[/i][b]毛细管电泳与质谱联用技术[/b][i]李廷富[/i]摘 要:毛细管电泳与质谱联用技术是近年来发展起来的一种新型分离检测技术。它综合了毛细管电泳的高效、快速与质谱强大的检测功能等优点,广泛应用于生命科学研究各领域,成为分析生物大分子的重要工具之一。关键词:毛细管电泳 ;质谱;预浓缩 毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)是 80 年代初发展起来的一种基于待分离物组份间淌度和分配行为差异而实现分离的电泳新技术。具有快速、高效、分辨率高、重复性好、易于自动化等优点。质谱分析技术(MS)是通过对样品离子的质量和强度的测定进行定量和结构分析的一种分析方法。具有分析灵敏度高、速度快等优点。这两种技术的联用 (CE/ MS)综合二者优点成为分析生物大分子物质的有力工具。本文对近年来 CE/ MS中的接口及样品预浓缩技术作一综述。1 仪器结构 任何一种类型质谱仪诸如傅立叶变换离子回旋加速共振质谱(FT-ICR) 、飞行时间质谱、离子陷阱质谱和三级四极杆质谱等均可与 CE联用,但四极杆质谱与 CE 联用最常见。在各种 CE与质谱联用中,区带毛细管电泳(CZE) 最常用。其它如毛细管等电聚焦电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳等应用较少。电子喷雾离子化 (Electro-sprayIonization, ESl) 是质谱首选的离子源。其理由有二 : ESI 可用于检测多种高质量的带电分子;其次,从 CE 分离出来的分子经过接口可以直接进入质谱仪。2 接口技术CE末端接口是影响整个检测的一个关键因素,所有 CE/ESI-MS 接口的目标都是为了获得稳定的雾流 (Spray-Current)和高效的离子化。由于 CE需要较高离子强度、挥发性低的缓冲液,而 ESI需要相对较低的盐浓度才能获得好的雾化及离子化。因此接口技术必须优化,使其尽可能提供好的电子接触,同时尽量减少对 CE分离效率的影响。此外,对于每一种接口应选择相应的缓冲液。CE/ ESI-MS 接口共有三种类型:同轴液体鞘流(Coaxial Liquid Sheath Flow) 、无鞘接口、液体连接。2.1 同轴液体鞘流 此种类型接口是最常见的连接 CE 与ESI-MS 的方法。该接口是一个同心的不锈钢毛细管套在电泳毛细管末端,鞘内充有鞘液。再在此不锈钢套外再套一个同心的钢套,鞘内通鞘气。鞘液与毛细管电泳缓冲液液体在尖端混合,同时被鞘气雾化。鞘液流量通常为每分钟纳升至数微升之间,但却显著高于 CE 流速。由于鞘液的稀释作用,雾流稳定性得到改善。理想的鞘液缓冲液盐浓度应在高分离 (高盐浓度)和高雾化(低盐浓度)间优化。由于鞘液在雾化过程中也完全蒸发,鞘液的稀释并不显著降低检测灵敏度。但混合液体的体积应尽可能小,以避免谱带展宽。
在介绍Orbitrap之前需要先简单介绍傅里叶变化的数据采集模式和傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)。 傅里叶变换是是一种线性的积分变换。连续傅里叶变换将平方可积的函数f(t)表示成复指数函数的积分或级数形式。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110301957_327268_2265735_3.gif这是将频率域的函数F(ω)表示为时间域的函数f(t)的积分形式。连续傅里叶变换的逆变换 (inverse Fourier transform)为http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110301957_327269_2265735_3.gif 这种数据采集方式最成功的应用是核磁共振仪(NMR),恩斯特因为在傅里叶变换NMR的贡献获得诺贝尔奖。简短的说就是在核磁中用一个短而强的脉冲瞬时激发所有核,取代连续波照射(原连续波NMR),收集这些信号,把时间谱变换为频谱(这些激发和数据采集的过程设计到傅里叶变换,我也不懂,感兴趣的版友可以自己阅读文献,鼓励与大家共享),利用快速傅里叶变换缩短了采样时间和检测灵敏度。生物质谱需要高的灵敏度和快速扫描速度来满足高通量分析要求,傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)和Orbitrap的神奇之处在于他们采用傅里叶变化模式采集数据,检测分子质量,拥有高的分辨率和质量精度。 傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)拥有超高的分辨率和精确的质量准确度,同时它也可以完全兼用CID,ECD,ETD等多种模式产生的多级质谱,所以傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)是从头开始(top-down)蛋白组学的理想检测工具。但是傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)是昂贵的质谱,体积庞大和巨额的运行维护费用让FTICR一直为少数科学家和大型实验所应用。2000年出现的新质谱——静电轨道阱质谱(Orbitrap)在一些实验中几乎可以达到傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)一样的高分辨率和质量准确度。 Orbitrap质量分析器工作时,两个电极之间形成静电场。当高速运动带电离子进入Orbitrap内,在静电作用下围绕中心电极做圆周轨道运动,不同的离子在z方向形成不同频率ωz与(m/z)1/2 成正比。检测器检测离子运动形成的电势,经过信号放大和快速傅立叶变换后形成频谱,经过处理最后形成质谱。在2005年,Thermo公司推出商品化的静电轨道阱质谱——LTQ-Orbitrap线性Orbitrap价格相比傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)便宜很多,使用维护方便。Orbitrap质量分析器形状如同纺椎,纺椎内有一个内心电极,两个半纺锥体构成外套电极,质离子阱静电轨道阱串联质谱。(图1)线性离子阱和Orbitrap由双曲面四级杆C-trap连接,C-trap把线性离子阱快速扫描的离子或二级质谱产生的离子聚焦推入Orbitrap进行高分辨的质量分析。LTQ-Orbitrap在蛋白组学已经获得了比较成功的应用,在高通量蛋白样品鉴定和磷酸化蛋白组学有一定的优势。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/10/201110301959_327270_2265735_3.gif图1线性离子阱静电轨道阱联用质谱仪(LTQ-Orbitrap)。a质谱仪组合装置示意图。b静电场轨道阱示意图。(引自自Thermo宣传资料)
ABSCIEX 生物质谱新技术培训4月/25日9:00-9:15am ABSCIEX 介绍9:15-10:15am 复旦杨芃原:生物质谱QTOF的仪器技术10:15-10:30am Break10:30-11:15am 实验室考察: 复杂生物样本的蛋白质鉴定11:15-12:00pm AB SCIEX 专家: 蛋白质鉴定和定量的实验设计--5600 QTOF的应用12:00-1:00pm 午餐1:00-2:30pm ABSCIEX 专家(Wenhai): SWATH 技术的实验设计2:30-3:15pm 实验室考察: 建立SWATH 技术的实验流程3:15-3:30pm Break3:30-5:00pm ABSCIEX 专家:SWATH 技术的数据处理4月/26日9:00-9:45am 复旦刘晓慧/陈晨/张磊:疾病生物标志物的鉴定和确认技术9:45-10:15am AB SCIEX 专家:MIDAS 实验设计10:15-10:30am Break10:30-12:00pm 实验室考察: MIDAS 实验流程的建立和数据处理12:00-1:00pm 午餐1:00-2:30pm ABSCIEX 专家: 应用iTRAQ 技术筛选分子标志物2:30-3:30pm 热电公司专家:待定”生命科学中的化学基础协同创新中心”生物质谱培训和讨论班4月/27日9:00-9:50am 复旦杨芃原: 生物质谱的仪器技术概况10:00-10:50am 复旦金红: 组蛋白修饰分析的质谱技术10:50-11:10am Break11:10-12:00 am 诺华/复旦廖日晶: 组蛋白修饰(甲基化)分析的质谱技术12:00-1:00pm 午餐2:00-2:50pm 复旦陆豪杰:磷酸化蛋白的质谱分析3:00-3:50pm 复旦杨芃原/曹玮倩/刘铭琪: 糖修饰蛋白的质谱分析3:50-4:10pm Break4:10-5:00pm 热电公司张伟:Orbitrap质谱的蛋白质组学方法开发与应用进展5:00-5:50pm康昱盛信息科技有限公司: 非标记定量方法的介绍和前期数据质量控制4月/28日9:00-9:50am 复旦申华莉/刘晓慧:蛋白质组测序的深度覆盖技术10:00-10:50am 北京蛋白质组研究中心应万涛:蛋白质谱分析的绝对定量技术10:50-11:10am Break11:10-12:00 am 康昱盛信息科技有限公司:蛋白质组学的IPA生物通路分析方法12:00-1:00pm 午餐2:00-2:30pm 热电公司讲座(欢迎参加)地址:上海市徐汇区东安路130号 复旦大学上海医学院 生物医学研究院 明道楼2楼
2011 BCEIA“质谱仪器与技术评议”活动安排活动一 2011质谱技术评议--聚焦离子源时间:2011年10月13日 上午9:00-12:009:15 CaptiveSpray离子源技术与应用,布鲁克公司蒲海,9:40 解吸电晕束离子源的开发与进展,岛津公司孙文剑,10:05 封闭式可调气氛电喷雾离子源研发,好创生物朱一心,10:30 多通道直接进样系统与应用,华质泰科刘春胜,10:55 离子淌度离子源,AB 公司蒋鸿剑,地点: 北京展览馆二号馆二层第八会议室活动二 便携式气质联用仪现场评议时间:2011年10月13日 下午13:00-17:00地点: 北京展览馆二号馆二层第八会议室中国分析测试协会分析测试仪器技术评议办公室
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早在1886年, Goldstein发明了早期质谱仪常用的离子源。1906年, 诺贝尔物理学奖得主、英国著名物理学家Thomson发明了世界上第1台质谱仪。1942年第1台单聚焦质谱仪的商业化推广代表着质谱技术终于突破了理论发展的瓶颈阶段。迄今为止, 质谱技术已经为化合物结构研究提供了大量有用的信息, 被广泛应用于地质、环境化学、有机化学、制药、生命科学等领域[1]。质谱技术是测量分子质荷比(m/z)的分析方法。它通过将分子电离后形成带电离子, 并按照离子m/z的大小顺序排列形成谱图数据。质谱仪是一类可以将样品分子转化成带电离子, 并利用适当的电场、磁场实现离子m/z分离, 进而检测每种离子的峰强度进行物质分析的仪器。质谱仪主要由进样系统、离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统5个部分组成, 其中核心部件为离子源与质量分析器。离子源分为硬电离和软电离。硬电离如电子轰击电离可以给予样品分子较大的能量, 导致样品产生的离子碎片很小 软电离则较为温和, 可以产生较大的离子碎片, 如电喷雾电离、基质辅助激光解吸电离和大气压化学电离等。随着软电离技术的发展与不断成熟, 实现了高分辨率与高质量检测范围的结合, 使得生物大分子质谱分析成为可能, 从而开辟了一个新的领域— — 生物质谱, 并在生命科学领域得到了广泛应用和飞速发展。质量分析器的作用是根据m/z将电离产生的带电离子分离, 主要有时间飞行、四级杆、离子阱、傅立叶变换离子回旋共振质量分析器等多种类型。目前用于生命科学领域的质谱仪多由几种质量分析器串联而成, 在空间或时间上实现了母离子选择、母离子碎裂、子离子检测功能并提供了离子碎裂的特征峰。这些特征峰是分子定性的依据, 使得质谱检测结果具有极高的特异性[1, 2, 3]。一、质谱在临床生化检测中的应用由于生物质谱技术具有特异性好、灵敏度高、选择性广、检测速度快等特点, 所以近年来在临床生化检验中的应用越来越广泛。目前国际上已经被广泛应用的质谱临床生化检验项目包括新生儿遗传代谢病筛查、维生素D检测、激素检测、血药浓度监测、微量元素检测等。1. 新生儿遗传代谢病筛查新生儿遗传代谢病筛查是指在新生儿期对某些危害严重的先天性遗传代谢疾病进行群体筛查, 并进行早期治疗, 从而避免或减轻疾病的影响。新生儿遗传代谢病筛查起源于1961年对苯丙酮尿症的筛查。此后随着医疗技术的发展, 越来越多的遗传代谢病被引入其中。我国自上世纪80年代初期开展的新生儿遗传代谢病筛查主要包括先天性甲状腺功能减退症、苯丙酮尿症、先天性肾上腺皮质增生以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症等, 每种筛查需要单独进行。目前国际上美、欧、日等国家都已经使用串联质谱技术对多个代谢产物进行联合检测, 同时筛查超过30种疾病, 除以上提到的几项外, 还包括囊胞性纤维症、半乳糖血症、氧化脂肪酸缺陷症、有机酸尿症和尿素循环缺陷症等[4, 5]。在我国, 顾学范教授等多个研究团队已经利用该技术进行了大量临床检测与研究, 取得了良好效果[6]。同时多家第三方医学实验室和妇幼保健机构也可以提供项目服务。因此, 对于新生儿遗传代谢病筛查的质量控制与室间质评是目前急需解决的关键问题之一。2. 维生素D检测维生素D是一种脂溶性维生素, 化学本质为固醇类衍生物, 目前也被认为是一种类固醇激素。维生素D存在于部分天然食物中, 人体皮下储存有由胆固醇衍生出的7-脱氢胆固醇, 受紫外线照射后即可转变为维生素D3。近年来发现维生素D缺乏不仅可以造成骨质疏松症, 还与糖尿病、癌症、心血管疾病等相关。体内保持足够的维生素D对糖尿病等都有一定的预防作用。目前维生素缺乏已经成为一个全球性问题, 对体内维生素D含量的检测受到了越来越多的关注。25-羟基维生素D是体内维生素D的主要代谢形式, 包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3两种形式, 其含量可以代表体内维生素D的水平。目前国内外对血清中25-羟基维生素D的检测方法主要有放射免疫、竞争蛋白结合法以及新兴的串联质谱法。与传统方法相比, 串联质谱法定量测定25-羟基维生素D具有更好的特异性和更强的抗干扰性, 并能实现25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的同时测定[7]。郭守东等[8]利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]串联质谱法检测糖尿病患者血浆中25-羟基维生素D3水平, 发现糖尿病患者25-羟基维生素D3水平明显低于健康人。周宁等[9]利用串联质谱法对过敏性鼻炎儿童血清中的维生素D进行了检测, 发现患儿维生素D水平低于正常儿童, 且维生素D3尤为显著。由此可见, 当需要区分维生素D的不同代谢产物种类时, 串联质谱法比传统免疫法具有明显的技术优势。3. 激素检测对类固醇激素及其代谢产物的检测是生物质谱技术在临床生化检验中一个非常重要的项目。通过质谱定量检测, 可以判断相应的类固醇激素与疾病的相关性[10, 11]。目前利用质谱技术可以对睾酮、脱氢睾酮、雄酮、雌酮、雌二醇和雌三醇等多种激素进行定量检测, 进而对相关疾病进行临床诊断和治疗, 如先天性肾上腺增生症、家族性高醛甾酮过多症、原发性醛固酮增多症等[1]。丁一峰等[12]利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱[/color][/url]-质谱联用法分析尿液中的类固醇, 实现多种激素同时检测, 且不同激素之间没有交叉反应, 准确性和灵敏度较好, 并证明类固醇激素水平与肾上腺和性腺等类固醇激素代谢异常疾病有关。黄河花等[13]建立了一种基于电喷雾电离质谱同时检测脱氢表雄酮、睾酮和雄酮的定量方法, 检测快速、灵敏度高、准确性好。4. 血药浓度监测在临床疾病治疗中, 很多药物的浓度需要严格限定在某一合适范围, 过少达不到治疗效果, 过多则可能引起毒性或成瘾反应, 造成不良后果, 给患者带来巨大痛苦。对这些药物浓度的检测目前我国主要应用免疫化学方法。这种方法虽简单易行, 但只能检测少数几种药物, 无法满足临床检测的要求。而且一般药物在体内的浓度都很低, 要求检测方法具有高灵敏度。近年来, 质谱技术逐渐成为药物浓度检测的重要手段。多种药物均可以利用质谱技术进行准确检测, 而且可以实现多药物同时检测, 提高了临床检测工作的效率。目前国际上已经在临床开展的药物浓度监测项目包括器官移植患者使用的免疫抑制剂、疼痛治疗药物、抗精神病药物、麻醉药、抗逆转录病毒药物等。同时随着质谱技术的不断发展和完善, 其有望成为药物及其代谢产物检测的“ 金标准” [14]。曲素欣等[15]建立了基于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]-质谱联用技术检测卡马西平浓度的方法, 并研究了该药物与癫痫疗效的关系。该检测方法特异性强、操作方便, 具有很好的灵敏度和准确性, 且重现性良好。崔刚等[16]建立了超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]-质谱联用技术检测肾移植患者体内霉酚酸浓度的方法。该方法快速、准确, 可广泛应用于器官移植患者血药浓度的临床监测中。5. 痕、微量元素检测人体元素含量可以作为很多疾病的标志物, 检测人体痕、微量元素可以辅助诊断某些临床疾病和职业病。元素检测中常用的方法为发射光谱法和质谱法。质谱法可以实现多元素同时检测, 且灵敏度高、检测限低、动态范围宽, 可以直接对血液样品进行检测。目前质谱技术已成为无机元素分析的主要方法之一, 已建立了几十种痕、微量元素的检测方法, 广泛应用于全血、血清、尿液和头发中砷、铅等有害重金属以及铁、锌、硒等人体微量元素的检测[17]。张文洁等[18]利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]电感耦合等离子体质谱[/color][/url]法对慢性肾炎患者血清中的微量元素做了检测, 发现慢性肾炎患者血清中钠、钾等元素与正常人无明显差异, 而铝、铁、锌等明显低于正常人。该方法可以对患者血液中微量元素的变化做实时监测, 为慢性肾炎的临床治疗提供指导。欧阳珮珮等[19]建立了基于质谱法的分析方法并对全血中5种微量元素同时做了检测, 此方法检出限低、灵敏度高、准确性好, 元素之间干扰较小, 符合复杂生物样品多元素同时检测的要求。6. 其他项目除以上项目外, 质谱技术的临床研究也已全面开展。叶军等[20]利用质谱技术对临床诊断不明的神经系统、消化系统以及皮肤损害患儿做了检测, 诊断患儿为多种羧化酶缺乏症, 并对生物素治疗过程做了监测, 发现疗效显著。二、总结与展望质谱技术自诞生以来发展十分迅速, 在临床生化检验中的作用越来越明显, 成为临床检验中的重要新型工具。质谱技术较其他方法具有更高的特异性、灵敏度、准确度、精确度, 且检出限低, 不受抗体或特殊生化反应的限制, 在临床应用中具有很好的前景。新生儿遗传代谢病筛查等多个项目已经在临床检验中得到广泛应用。相比较而言, 我国临床生化检验中质谱技术的应用还非常有限, 与国外发展水平差异较大, 很多相关部分还需要进一步完善, 例如:质谱检测数据的判断标准、技术方法的掌握与人员培训、质量控制体系的建立、收费渠道与收费标准的确定等等。目前我国串联质谱技术进行临床生化检测的项目单一, 主要集中于少量第三方检测机构与妇幼保健单位, 独立于大型综合医疗机构之外, 不利于临床质谱技术的进一步深入发展。因此, 从临床需求出发, 结合医院实际情况, 完善技术与管理方案, 力求形成临床、科研、政府管理部门密切沟通合作的工作模式是发展质谱等新型检测技术的有效途径。参考文献[1] 韩丽乔, 庄俊华, 黄宪章. 质谱技术及其在临床检验中的应用[J]. 检验医学, 2013, 28(3): 252-256. 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An [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS method for steroid profiling during adrenal venous sampling for investigation of primary aldosteronism[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2014, 145: 75-84.[11] ZHAO X, XU F, QI B, et al. Serum metabolomics study of polycystic ovary syndrome based on liquid chromatography-mass spectrometry[J]. J Proteome Res, 2014, 13(2): 1101-1111.[12] 丁一峰, 顾学范, 叶军, 等. [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱[/color][/url]-质谱分析新生儿尿液中类固醇激素方法的建立[J]. 临床儿科杂志, 2010, 28(8): 748-751.[13] 黄河花, 刘东阳, 胡蓓, 等. 高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联质谱法同时定量测定人血清中脱氢表雄酮、睾酮及雄酮[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(2): 210-216.[14] 任秀华, 杜光, 刘东. [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联质谱法测定人血浆中甲氨蝶呤的血药浓度及其临床应用[J]. 中国医院药学杂志, 2014, 34(10): 801-804. [15] 曲素欣, 陈湛芳. [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]法监测癫痫患儿卡马西平血药浓度及结果分析[J]. 中国医学创新, 2014, 7(26): 101-103.[16] 崔刚, 陈文倩, 刘晓, 等. 超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联质谱法测定肾移植患者体内霉酚酸的血药浓度[J]. 中国药房, 2013, 24(22): 2046-2048.[17] 张霖琳, 邢小茹, 吴国平, 等. 微波消解-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]测定人体血浆中30种痕量元素[J]. 光谱学与光谱分析, 2009, 29(4): 1115-1118.[18] 张文洁, 何学红, 赵友林, 等. [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]电感耦合等离子体质谱[/color][/url]法测定慢性肾炎患者血清中的微量元素[J]. 中华中医药学刊, 2009, 28(5): 1017-1019.[19] 欧阳珮珮, 吴惠刚, 黄诚, 等. 压力罐消解[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]法同时测定全血中5种微量元素[J]. 氨基酸和生物资源, 2014, 36(2): 70-72. [20] 叶军, 韩连书, 邱文娟, 等. 联合质谱技术在多种羧化酶缺乏症诊治中的应用研究[J]. 中国实用儿科杂志, 2008, 23(8): 582-585.
请问哪位大侠知道ABI的质谱如何?
微生物质谱技术无疑是质谱行业热点之一,他的前景如何?技术瓶颈在哪里呢?
[font=&][size=18px]引言[/size][/font][font=&][size=18px]质谱(mass spectrometry,MS)技术是一种重要的检测分析技术,通过将待测样本转换成高速运动的离子,根据不同的离子拥有不同的质荷比(m/z)进行分离和检测目标离子或片段,然后依据保留时间和其丰度值进行定性和定量[ 1]。近年来,质谱技术发展迅速,通过改进离子源和分离器相继发展了多种类型的质谱仪如电喷雾离子源质谱(ESI-MS)、大气压化学电离离子源质谱(APCI-MS)、四级杆(QQQ)质谱仪、离子阱质谱技术以及各种串联、联用质谱仪等多种类型,极大提高了检测的分辨率和检测范围。质谱技术最先应用于计量和分析化学领域,在临床检验中质谱仍属于一种年轻的检测方法。但自从其在临床检验应用以来,便以其高灵敏度、低检测限、样本用量少、高通量、检测速度快、样本前处理简单的优势显示出巨大的生命力,尤其和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相[/color][/url]、高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]的联用极大的扩展了质谱技术在临床检验中的分析范围。[/size][/font][font=&][size=18px]一、质谱仪的组成[/size][/font][font=&][size=18px]质谱仪主要有5个部分组成:进样系统、离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统。其核心部件是离子源和质量分析器。离子源的功能是将由进样系统引入的样本分子转化成离子,包括硬电离方法和软电离方法。硬电离方法给予样本较大的能量,如电子轰击电离、化学电离、场致离子化电离等 软电离方法是一种比较温和的离子化方式,包括快原子轰击电离、大气压化学电离、大气压光致电离、电喷雾电离、基质辅助激光解吸电离等类型。硬电离方法适用于一些小分子化合物的分析,软电离适用于分子量较大的化合物,尤其是一些生物分子,如蛋白质、多肽、寡聚核苷酸等。质量分析器主要是将电离产生的离子根据其不同的质荷比来分离目标离子,其主要类型有单聚焦、双聚焦、摆线、磁分析器、飞行时间、四级杆质量分析器、离子阱分析器、傅立叶变换离子回旋共振质谱等类型。此外仪器还需要在高真空环境中进行离子分离,因此真空系统也是质谱仪必备的组成部分[ 2]。[/size][/font][font=&][size=18px]二、质谱仪的工作原理[/size][/font][font=&][size=18px]质谱仪的基本工作原理:待测样本由进样系统进入离子源内电离成离子进入质量分析器,然后质量分析器据形成的离子的m/z进行分离,后进入检测器检测,数据系统将离子信号转换成谱图进行质谱解析或定量分析。目前生命科学领域中的质谱仪大都由几种质量检测器串联组成,这样可以提高离子分离效率,使检测更具特异性和准确度[ 3]。[/size][/font][font=&][size=18px]三、质谱仪在临床检验中应用[/size][/font][font=&][size=18px](一)在微生物检验方面的应用[/size][/font][font=&][size=18px]传统的致病微生物检测大多采用微生物培养、生物化学和分子生物学的方法检测,不仅分析周期长而且没有明确的种群分型标准,往往造成分析结果的滞后和种类分型的误判。据估计,在临床实验室中仅在链球菌的分类中,就有高达13%的辨别错误[ 4]。近年来,质谱技术在微生物检验方面的应用越来越多,这主要得益于其得天独厚的优势:(1)可用于多种微生物样本,如痰液、血液、尿液、脑脊液和胸腹腔积液以及经过培养的样本 (2)可用于几乎所有类型的病原体鉴定和分类检测,如细菌、真菌及其孢子、病毒、寄生虫等 (3)可对病原的多种成分进行分析,包括蛋白质、脂质、脂多糖、脂寡糖、DNA、多肽及其他可被离子化的分子 (4)检测速度快,例如一个病原微生物的质谱检定实验,包括样本的采集和制备,整个过程不到10 min[ 5] (5)样本用量少 (6)样本前处理简单 (7)特异性和准确性高,例如金黄色葡萄球菌的表型鉴定,Rajakaruna等[ 6]利用基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术分析了来自临床实验室的95个分离群和39个葡萄球菌群,并利用MicrobeLynx软件成功的识别了各个种群 (8)高敏感性,例如[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]串联质谱可以检测到10~100个细菌或20~50个孢子的存在。在对生物样本进行处理后,甚至可以在单个菌水平发现并确定致病菌[ 7] ,使其在微生物尤其是传染病病原体鉴定方面具有巨大的优势。近年来已建立了微生物胞膜蛋白质、脂多糖、核酸等的指纹数据库,使其检测更加准确和快速。[/size][/font][font=&][size=18px]目前在细菌检测中应用较多是飞行质谱技术。通过检测细菌胞膜成分或表达的特异蛋白对细菌进行种群的鉴别,不仅可以识别病原菌,而且有助于发现新的病原菌。此外还有用于病原体的药物敏感性实验检测和真菌检测研究等[ 8, 9] 。[/size][/font][font=&][size=18px](二)质谱技术在临床免疫学检验的应用[/size][/font][font=&][size=18px]飞行质谱技术的全称是表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS),是利用相同能量的带电粒子,由于质量的差异而具有不同速度从而以不同时间通过相同的漂移距离到达接收器,依据离子束到达检测器的时间推算出m/z,从而进行定性和定量检测。其高灵敏度、高通量的分析特点使其在临床免疫学检验生物标志物检测方面成为一项有力的工具,筛选作用独特高效。如前列腺癌及前列腺增生、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、结肠癌、喉癌、鼻咽癌、食道癌等,都发现了特异的蛋白或某些蛋白的增加或者减少[ 10, 11, 12, 13]。尤其质谱检测技术在泌尿系统中的应用发展迅速。由于其检测的样本为尿液,对患者身体不造成伤害,不仅可以早期诊断肾脏疾病,而且避免或减轻了传统侵入性方法如肾脏活检等给患者带来的痛苦,提高患者治疗的依从性和存活率。在肾脏肿瘤、糖尿病性肾脏病变、肾脏移植功能检测等具有很大应用前景[ 14]。此外毛细管电泳质谱技术被广泛用于泌尿系统 peptidomical 生物标志物的研究,验证了许多已经报道的但是没有蛋白和肽段识别的研究结果[ 15]。[/size][/font][font=&][size=18px]Agger等[ 16]采用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-多重反应检测-质谱(LC-MRM/MS)方法通过同时定量测定血浆样本中载脂蛋白A-Ⅰ和载脂蛋白B来推进质谱方法同时定量多种血浆/血清中蛋白质在临床前期的生物标志物大规模筛选以及取代价格昂贵的免疫测定方法作为实验室检查的常规方法的应用。结果表明LC-MRM/MS与传统免疫学方法相关性良好且具有大规模应用于临床研究的可行性。因其简化了样本的前处理以及样本前处理中蛋白消化作用带来的变异,具有潜在的应用前景。[/size][/font][font=&][size=18px](三)在临床生物化学检验中的应用[/size][/font][font=&][size=18px]1.在体内激素检测方面的应用 质谱技术在临床生物化学中一项重要的应用是用于体内激素的检测,如类固醇激素(甾体激素)及其代谢产物的检测,具有极重要的临床诊断价值,几乎可以诊断所有的类固醇相关障碍性疾病。如睾酮(T)、双氢睾酮(DHT)、血浆雌酮硫酸盐、雌酮、雌二醇和雌三醇等的定量检测,可辅助多种激素相关疾病及激素替代治疗疾病如儿科遗传性激素相关疾病、先天性肾上腺增生症、家族性高醛甾酮过多症、多囊卵巢病、成人生殖系统和第二性征的维持、前列腺增生和前列腺癌、原发性醛固酮增多症、肾上腺机能减退、雌激素缺乏及抗雌激素药治疗、肾上腺功能异常(如Cushing's综合症)的诊断、监测、治疗和研究等[ 17, 18]。[/size][/font][font=&][size=18px]2.在血药浓度监测和药物代谢研究中的应用 临床中某些药物效用范围比较窄,很容易引起毒性反应,造成不良后果。如免疫抑制剂随着器官移植技术和移植成活率的提高越来越多的应用于患者,其在人体内过多和过少都会给患者带来很大的痛苦。但这些药物在体内的浓度往往很低,给检测带来一定的困难。近几年随着质谱技术的发展,其高灵敏度、高特异性和检测速度快的优势使其已成为药物浓度检测的重要工具。特别是在免疫抑制药物、抗肿瘤药物、抗逆转录病毒(HIV)药物、抗精神病药物、一些激素类药物、中药及其天然产物分析、药物滥用(如吗啡、鸦片和一些镇痛药)、麻醉药、中毒药物的急救中得到广泛应用,并且质谱技术被公认为生物样本中药物及其代谢产物检测的标准化方法[ 19, 20]。此外有报道通过用飞行质谱方法进行单链核苷酸多态性的快速基因分型从而指导华法林(抗凝血药)用量的研究[ 21]。这为新的多重基因分型方法提供了一个非常好的临床检验平台,促进个体化药物治疗的研究。[/size][/font][font=&][size=18px]3.在遗传性疾病检测中的应用 质谱技术在遗传性疾病的诊断和筛查中应用广泛。最为大家熟知的就是质谱技术在新生儿筛查检测中的应用,通过检测氨基酸、脂肪酸、有机酸及其代谢产物可以灵敏、准确地检测出20多种遗传代谢疾病,从而早期诊断、早期治疗,挽救了很多患儿的生命和人生[ 22, 23]。还有报道质谱技术用于快速筛查嘌呤和嘧啶代谢紊乱高危患者的研究,快速且特异,弥补了该种遗传病表型表现多样性和非特异性给诊断带来的困难[ 24]。孙卫华等[ 25]采用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱[/color][/url]质谱联用技术([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]GC-MS[/color][/url])测定尿琥珀酰丙酮(SA),精确性和准确性均较高,为临床上鉴别诊断酪氨酸血症I型提供了新的方法。[/size][/font][font=&][size=18px]4.痕量元素/微量营养素检测中的应用 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]电感耦合等离子体质谱[/color][/url]分析技术([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url])是20世纪80年代发展起来的无机元素分析检测技术,近年来在痕量、超痕量成分及同位素分析检测中广泛应用。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]ICP-MS[/color][/url]是在样本处理前加入待测元素的同位素,利用其测定前后的丰度比例改变而达到测定目的。可以同时测定多种痕量元素,具有检测限低、动态线性范围宽、干扰少、稳定性好、分析精密度高、速度快、样本前处理简单、高通量等诸多优点,是最准确的无机元素分析方法之一。目前已广泛应用于血清、全血、尿液以及头发中铅(Pb)、砷(As)、铁(Fe)、硒(Se)、锌(Zn)等有害重金属元素和人体微量元素的测定,可辅助临床疾病和职业病的诊断和鉴别诊断等。但是其一个最大的缺点是昂贵的耗费以及某些重金属元素比如铬和铁等有较多的干扰[ 26]。此外,质谱技术还可应用于人体微量营养元素的检测,如B12、维生素D等,对于诊断人体相关微量营养素异常导致的疾病具有重要临床应用意义。[/size][/font][font=&][size=18px]5.糖化血红蛋白的检测应用 糖化血红蛋白(HbA1c)被认为是诊断糖尿病的最好指标。Nakanishi等[ 24]报道用电喷雾电离质谱法(ESI-MS)检测HbA1c并与传统方法比较,结果显示ESI-MS方法与传统方法的相关性高于96%,而且重复性非常好,在临床检验常规方法的质量控制中可以起到很大作用。[/size][/font][font=&][size=18px](四)在分子生物诊断中的应用[/size][/font][font=&][size=18px]1.蛋白组学和核苷酸多态性的研究应用 质谱技术应用领域中的另一个重要方面是蛋白质组学研究。2002年软电离技术被授予诺贝尔化学奖。生物质谱技术也成为质谱学中最具有活力的前沿热门技术。其可以检测蛋白质的氨基酸组成、分子量、多肽或二硫键的数目和位置及蛋白质的空间构象等 还用于检测核酸的分子量和单核苷酸多态性(即基因位点的突变)研究。其准确、灵敏和高通量的特点已经成为检测蛋白及多肽分子和基因的重要技术[ 28, 29]。通过MALDI-TOF-MS检测寻找特异的一组蛋白质峰,建立肿瘤早期血清差异表达蛋白的诊断模型,对早期快速诊断肿瘤提供可能。已有研究报道用于多种肿瘤的早期诊断。单核苷酸多态性是指DNA序列上发生的单个核苷酸碱基之间的变异,在人群中的发生频率1%,是决定疾病易感性和药物反应性差异的重要因素。通过检测突变的位点可以对疾病进行预测,提供诊断意见和用药指导并探讨与疾病发生的相关性。因为MALDI-TOF-MS检测的是核苷酸本身的分子量,相较于传统的单核苷酸多态性分型检测方法更为省时、省力和可靠。[/size][/font][font=&][size=18px]2.代谢组学研究的应用 人体是一个复杂的生化大工厂。当某部件出现异常时必然会伴随着某些代谢小分子的水平异常。相对来说这些小分子比DNA、RNA、蛋白质等更能反应一个细胞当前的功能状态。代谢组学也是目前研究的一个热点,质谱技术在检测这些代谢小分子的变化上也有重要的应用,为多种疾病及肿瘤的更早期诊断和指导治疗提供依据[ 30]。如张文亮等[ 31]采用毛细管电泳与MALDI-TOF-MS联用测定血清转甲状腺素蛋白的化学修饰,为进一步探索淀粉样变性的发病机制提供了一种简便的检测方法。[/size][/font][font=&][size=18px](五)在参考方法建立和研制标准物质方面的应用[/size][/font][font=&][size=18px]在临床检验中基于准确性的标准化检测是目前急需的。1997年国际物质量咨询委员会(CCQM)将同位素稀释质谱(ED-ID-MS)原理定为一级(基准)测量原理之一,其同时具有质谱分析的高度特异性和同位素稀释的高度精密性,且测量的动态范围宽,样本制备不需严格定量操作,测量值能够直接溯源到国际单位制的物质量基本单位“摩尔”。因此基于同位素稀释质谱原理的方法在生物和临床化学溯源研究中受到越来越多的重视,为临床检验中标准物质的研制提供了技术保障,是临床检验参考方法的最佳选择。[/size][/font][font=&][size=18px]Thienpont 等[ 32]建立基于常规实验室的ED-ID-MS法检测游离T3和T4通过IFCC的候选国际传统参考测量程序方法的校准和溯源,检测指标都取得了很好的相关性。张传宝等[ 32]应用同位素稀释[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联质谱法建立了测定血清尿酸的候选参考方法。[/size][/font][font=&][size=18px]四、结语[/size][/font][font=&][size=18px]质谱技术,尤其是串联质谱技术可以提供物质的结构和质量信息。因此其在定性和定量生物样本中的作用越来越大,同时也适合一些探索性的工作。MALDI-TOF和SELDI质谱仪近来被广泛用于一些标志性物质的探索。三重四级杆线性离子阱分析器的发展使分析器定量的能力与离子阱的扫描能力相结合,从而可以容纳扫描器组合的不同排列。选择性反应物探测的组合和三重质谱技术的组合(MS/MS/MS)是一个定量的很好组合。电喷雾离子化、大气压光致电离是近年来发展迅速的离子源,可以检测极性和非极性化合物。[/size][/font][font=&][size=18px]质谱技术虽然有很多的优点,在近年来很多领域的应用也发展迅速,但其也有自身的瓶颈:如没有某纯物质为内标或特征性的离子碎片,则难以判断该物质是何种物质,无法定性和定量,所以目前还有许多物质无法用质谱检测,尤其是一些大分子的复杂物质 目前质谱技术的自动化程度还还相对较差,前处理过程也相对复杂,其对工作人员的技术要求较高 另外仪器昂贵,日常运行费用及维护费用也较高,如ID-MS仪器,在处理样本时需要加入适量的同位素稀释剂,该种稀释剂来源较困难,制备成本较高等,这些都为ID-MS的普及应用带来困难 此外该技术的高敏感性,如SELDI-TOF-MS技术筛检蛋白的高敏感性必然带来了检测的假阳性,这也是该技术不容忽视的一个弱点。但相信随着质谱技术的发展成熟,其在临床实验室检测中会有更广泛的应用。[/size][/font][font=&][size=18px]参考文献[/size][/font][font=&][size=18px][1] Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE. 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飞行质谱的全称是表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(seldi-tof或seldi)。质谱技术-飞行质谱是由2002年诺贝尔化学奖得主田中(tanaka)发明,赛弗吉(ciphergen)系统生物公司制造的特殊芯片,诞生伊始便引起学术界的重视,成为最引人注目的亮点。 ■工作原理 早期的飞行质谱为基质辅助激光解吸离子飞行质谱(maldi-tofms),基质使被分析蛋白质离子化,再由质谱测定。seldi把基质改为以色谱原理设计的蛋白芯片,增强了分离能力。芯片技术最初应用于dna分析,称基因芯片。由于芯片整合了多种高技术:高度集成、超微化、计算机化、自动化,具有多样、快速等优点,也成了飞行质谱的首选。和dna不同,蛋白质是三维结构,制作蛋白芯片最困难的是如何在不损害功能又不增加背景的条件下在芯片表面通过固定某些蛋白起分离作用。鉴于传统技术很难解决这一难题,在飞行质谱的检测系统中, 蛋白芯片根据色谱原理,表面经化学(阳离子、阴离子、疏水、亲水和金属离子整合等)或生物化学(抗体、受体、dna等)处理,芯片特异性地和血清中测定蛋白结合,再通过选择性清洗,获得高分辨率的保留蛋白谱(第一次分离)。当加入能量吸收分子(eam)后,芯片上保留的蛋白形成晶体。在特异的激光照射后,晶体发生解离作用,带电分子在通过电场时加速,记录仪记录飞行时间的长短,质量越轻,相对所带的电荷越多(质荷比m/z越小),飞行时间越短。信号由高速的模拟数字转化器传化并记录,被测定的蛋白质以一系列峰的形式呈现,这些特异的峰可看成此类疾病的指纹。单个蛋白在谱图上的位置取决于飞行时间。seldi携有特有的软件,能快速处理、分析大量的信息。seldi分析的蛋白峰的质谱图的横轴表示蛋白类型,纵轴代表蛋白质的强度和丰度。进行定量测定。利用飞行质谱就能发现过去无法分离检测的新的疾病蛋白谱图。根据几年来世界各地的使用情况,普遍认为该方法快速、重复性好,可检测微量蛋白。■临床应用 飞行质谱这一技术目前已广泛用于多种疾病,如癌症、老年病、感染性疾病、心血管病和神经系统疾病,认为可以提高多种疾病的诊断率,其中应用于癌症的最多。国外研究人员应用seldi检测了转移性黑色素瘤、肉瘤和肾癌,敏感性达87%。他们认为,该方法根据独特的8~24条蛋白指纹图可以用于多种癌症的诊断,如肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、食道癌,其检测限为飞摩尔/升。据报道,美国华盛顿伊丽莎白医院利用该技术检测肺癌,敏感性达98%,特异性97%;美国霍普金斯医学院检测了卵巢癌敏感性82%,特异性98%;霍普金斯医学院、美国国立癌症研究所合作检测乳腺癌,敏感性93%,特异性91%。国内研究也成绩斐然,结果十分惊人,各项统计指标均远好于经典的肿瘤标志。许多科学家认为,seldi发现是十分激动人心的事,临床应用有巨大潜力,seldi将发现许多新的肿瘤标志,使肿瘤研究有突破性进展。■前景 虽然,seldi推出仅4年,距第一篇正式发表的工作报告只有两年多,但从世界范围的应用结果来看,seldi在许多疾病的诊断特别在肿瘤早期准确诊断上有着极其光明的应用前景。美国科学顾问委员会的300多位从事生命科学或医疗一线的研究者普遍认为飞行质谱是一个极有前途的应用技术,将给诊断学带来一场革命或革新,大大改变目前一些疾病如肿瘤、心血管病等诊断落后的情况,前景美好。
生命科学被誉为21世纪的最前沿科学之一,随着人类第一张基因序列草图的完成和发展,生命科学的研究也将进入一个崭新的后基因组学,即蛋白质组学时代。正如基因草图的提前绘制得益于大规模全自动毛细管测序技术一样,后基因组研究也将会借助于现代生物质谱技术等得到迅猛发展。本文拟简述生物质谱技术及其在生命科学领域研究中的应用。 1. 质谱技术质谱(Mass SPectrometry)是带电原子、分子或分子碎片按质荷比(或质量)的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离,并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。质谱分析的基本原理 用于分析的样品分子(或原子)在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子,进入由电场和磁场组成的分析器,离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大,速度快的偏转小;在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转,即速度慢的离子依然偏转大,速度快的偏转小;当两个场的偏转作用彼此补偿时,它们的轨道便相交于一点。与此同时,在磁场中还能发生质量的分离,这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上,不同质荷比的离子聚焦在不同的点上,其焦面接近于平面,在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线,即质谱。通过质谱分析,我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息。质谱技术的发展 质谱的开发历史要追溯到20世纪初J.J.Thomson创制的抛物线质谱装置,1919年Aston制成了第一台速度聚焦型质谱仪,成为了质谱发展史上的里程碑。最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量,随着离子光学理论的发展,质谱仪不断改进,其应用范围也在不断扩大,到20世纪50年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。现今,质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领域,在固体物理、冶金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命科学领域的应用,更为质谱的发展注入了新的活力,形成了独特的生物质谱技术。2. 生物质谱技术电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项轨电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。它们具有高灵敏度和高质量检测范围,使得在pmol(10-12)甚至fmol(10-15)的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能,从而使质谱技术真正走入了生命科学的研究领域,并得到迅速的发展。以下主要介绍与生物医学有关的几项质谱技术。电喷雾质谱技术电喷雾质谱技术(Electrospray Ionizsation MassSpectrometry,ESI-MS)是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子,使质量电荷比(m/z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用,如液一质联用([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url])是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。基质辅助激光解吸附质谱技术基质辅助激光解吸附质谱技术(MatriX AssistedLaser Desorption/IonizationMALDI)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,致使基质和分析物膨胀并进入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]。MALDAI所产生的质谱图多为单电荷离子,因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-FlightTOF)检测器来检测,理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的,因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究。快原子轰击质谱技术快原子轰击质谱技术(Fast Atom Bomebard-ment Mass Spectrometry,FABMS)是一种软电离技术,是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品,使样品离子溅出进入分析器,这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析,更加适用于多肽和蛋白质等的分析研究。FABMS只能提供有关离子的精确质量,从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS-MS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息,从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。同位素质谱同位素质谱是一种开发和应用比较早的技术,被广泛地应用于各个领域,但它在医学领域的应用只是近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力,该化合物又易于用同位素标示,人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含量以达到检测该病原菌的目的,同时也为同位素质谱在医学领域的应用开辟了一条思路。
质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化,然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同,把离子按质荷比(m/z)分开而得到质谱,通过样品的质谱和相关信息,可以得到样品的定性定量结果。从J.J. Thomson制成第一台质谱仪,到现在已有近90年了,早期的质谱仪主要是用来进行同位素测定和无机元素分析,二十世纪四十年代以后开始用于有机物分析,六十年代出现了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]-质谱联用仪,使质谱仪的应用领域大大扩展,开始成为有机物分析的重要仪器。计算机的应用又使质谱分析法发生了飞跃变化,使其技术更加成熟,使用更加方便。八十年代以后又出现了一些新的质谱技术,如快原子轰击电离子源,基质辅助激光解吸电离源,电喷雾电离源,大气压化学电离源,以及随之而来的比较成熟的液相色谱-质谱联用仪,感应耦合等离子体质谱仪,富立叶变换质谱仪等。这些新的电离技术和新的质谱仪使质谱分析又取得了长足进展。目前质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、地质、能源、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=25329]质谱分析技术[/url]
质谱技术是抗体药物分析最重要的技术手段之一。本文简述了抗体药物的发展和质谱技术的原理。对于质谱技术在抗体药物的分析中应用进行了归类整理,主要分为在一级结构和高级结构分析中的应用。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物,所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的发展,是当前生物药物领域增长最快的一类药物.1.抗体药物发展新趋势在生物药物领域,抗体药物占据着越来越重要的地位,全球销售排名前10位的药物中有6个为抗体药物,抗体药物按来源分类可以分为:鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。目前,批准的单克隆抗体药物中,人源化单抗和全人源单抗数量已占据大多数。1.1 抗体药物偶联物(ADC)抗体药物偶联物(ADC)由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成。通过抗体的靶向作用,ADC 的抗体部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合,通过细胞内吞作用,将抗体和小分子化合物一起带进肿瘤细胞内部,释放出小分子化合物。这样既可以降低小分子药物的毒性,同时具有靶向结合的作用。已经上市的两个ADC 是Kadyla 和Adcetris。1.2 双特异性抗体(BsAb)双特异性抗体(BsAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体,能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁,由于基因工程的发展,目前双特异性抗体已经研发出多种类型,主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体(串联scFv)、DVD-Ig 等多种形式。2.质谱技术近年来质谱仪性能的显著改进主要基于开发出的两种离子化技术:一种是介质辅助的激光解吸/离子化技术。另一种是电喷雾离子化技术。由于这两种电离技术的出现,使原本只能检测小分子的质谱技术,可以运用于检测生物大分子。在过去质谱技术主要运用于对一级结构和序列的表征,而现在质谱技术越来越多地运用于高级结构的分析,而高级结构对于抗体药物的生物活性至关重要。3.质谱技术在抗体药物一级结构分析中的应用3.1 完整抗体药物精确分子量测定当得到抗体药物时,可以直接通过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS进行分子量的检测。通过对于脱糖后分子量的检测,可以对于抗体药物进行初步定性分析,并将可以作为药物常规放行的分析方法。对于脱糖前的抗体药物进行分析,可以得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化水平的分布,对于快速了解生产工艺与药物质量的关系具有十分重要的意义。3.2 药物抗体偶联比(DAR)对于赖氨酸链接的抗体偶联药物,采用C4色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品进行分析,根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目。对于质谱测定的结果,不仅可以给出确切的药物抗体偶联比值,更能够给出链接不同个小分子药物的分布情况,及反应过程副产物空链接头的分布情况。3.3 肽图谱分析蛋白被特异酶切后的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于不同的抗体药物具有不同的氨基酸序列,蛋白质被酶水解后,产生的肽片段也各不相同,肽混合物的质量数具有唯一特征。可以通过LC-ESI-MS进行肽片段的一级质量数的鉴定,也可以通过LC-ESI-MS/MS对于每个肽片段进行进一步确证,提高肽图谱的准确性。3.4 翻译后修饰研究蛋白质的翻译后修饰(PTM)对于抗体药物的生物学功能十分重要。常见的翻译后修饰有:磷酸化、脱酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修饰、N端焦谷氨酸环化,C端赖氨酸切除等。质谱分析仪检测蛋白和肽片段的分子量偏差,可以实现高灵敏、高通量和高精确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的种类。3.5 N端氨基酸序列检测常规N端氨基酸检测用Edman降解法进行检测,但是抗体药物有时候会出现N 端环化的现象,在这种情况下用Edman降解法需要先对抗体进行去封闭处理,而直接使用质谱可以直接测出N端的氨基酸序列,同时可以检测出N端环化的相对比例。4.质谱技术在抗体药物高级结构分析中的应用4.1 氢/氘交换质谱(HDX-MS)常规的质谱只能获得蛋白的一级结构信息。氢/氘交换质谱(HDX-MS)可以进行蛋白质构象,溶液动力学和表位映射进行分析。在能够调查的蛋白质的高阶结构和动态结构技术中,HDX-MS已经证明适合单克隆抗体和单克隆抗体-抗原复合物的构象分析。4.2 离子淌度质谱法(IM-MS)离子淌度是根据蛋白的电荷和形状选择性分离的方法,可以区分相同分子量的蛋白和肽段,可用于检测蛋白的简单高级结构。4.3 高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)能够检测最高质量数的质谱仪器,并且有着很高的分辨率。FTICR-MS 是目前被公认为是蛋白质组学研究的有力工具,特别是和完整的蛋白质鉴定和上/下调翻译后修饰(PTM)蛋白质的鉴定。
早在1886年, Goldstein发明了早期质谱仪常用的离子源。1906年, 诺贝尔物理学奖得主、英国著名物理学家Thomson发明了世界上第1台质谱仪。1942年第1台单聚焦质谱仪的商业化推广代表着质谱技术终于突破了理论发展的瓶颈阶段。迄今为止, 质谱技术已经为化合物结构研究提供了大量有用的信息, 被广泛应用于地质、环境化学、有机化学、制药、生命科学等领域[1]。 质谱技术是测量分子质荷比(m/z)的分析方法。它通过将分子电离后形成带电离子, 并按照离子m/z的大小顺序排列形成谱图数据。质谱仪是一类可以将样品分子转化成带电离子, 并利用适当的电场、磁场实现离子m/z分离, 进而检测每种离子的峰强度进行物质分析的仪器。质谱仪主要由进样系统、离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统5个部分组成, 其中核心部件为离子源与质量分析器。离子源分为硬电离和软电离。硬电离如电子轰击电离可以给予样品分子较大的能量, 导致样品产生的离子碎片很小; 软电离则较为温和, 可以产生较大的离子碎片, 如电喷雾电离、基质辅助激光解吸电离和大气压化学电离等。随着软电离技术的发展与不断成熟, 实现了高分辨率与高质量检测范围的结合, 使得生物大分子质谱分析成为可能, 从而开辟了一个新的领域— — 生物质谱, 并在生命科学领域得到了广泛应用和飞速发展。质量分析器的作用是根据m/z将电离产生的带电离子分离, 主要有时间飞行、四级杆、离子阱、傅立叶变换离子回旋共振质量分析器等多种类型。目前用于生命科学领域的质谱仪多由几种质量分析器串联而成, 在空间或时间上实现了母离子选择、母离子碎裂、子离子检测功能并提供了离子碎裂的特征峰。这些特征峰是分子定性的依据, 使得质谱检测结果具有极高的特异性[1, 2, 3]。 一、质谱在临床生化检测中的应用 由于生物质谱技术具有特异性好、灵敏度高、选择性广、检测速度快等特点, 所以近年来在临床生化检验中的应用越来越广泛。目前国际上已经被广泛应用的质谱临床生化检验项目包括新生儿遗传代谢病筛查、维生素D检测、激素检测、血药浓度监测、微量元素检测等。 1. 新生儿遗传代谢病筛查 新生儿遗传代谢病筛查是指在新生儿期对某些危害严重的先天性遗传代谢疾病进行群体筛查, 并进行早期治疗, 从而避免或减轻疾病的影响。新生儿遗传代谢病筛查起源于1961年对苯丙酮尿症的筛查。此后随着医疗技术的发展, 越来越多的遗传代谢病被引入其中。我国自上世纪80年代初期开展的新生儿遗传代谢病筛查主要包括先天性甲状腺功能减退症、苯丙酮尿症、先天性肾上腺皮质增生以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症等, 每种筛查需要单独进行。目前国际上美、欧、日等国家都已经使用串联质谱技术对多个代谢产物进行联合检测, 同时筛查超过30种疾病, 除以上提到的几项外, 还包括囊胞性纤维症、半乳糖血症、氧化脂肪酸缺陷症、有机酸尿症和尿素循环缺陷症等[4, 5]。在我国, 顾学范教授等多个研究团队已经利用该技术进行了大量临床检测与研究, 取得了良好效果[6]。同时多家第三方医学实验室和妇幼保健机构也可以提供项目服务。因此, 对于新生儿遗传代谢病筛查的质量控制与室间质评是目前急需解决的关键问题之一。 2. 维生素D检测 维生素D是一种脂溶性维生素, 化学本质为固醇类衍生物, 目前也被认为是一种类固醇激素。维生素D存在于部分天然食物中, 人体皮下储存有由胆固醇衍生出的7-脱氢胆固醇, 受紫外线照射后即可转变为维生素D3。近年来发现维生素D缺乏不仅可以造成骨质疏松症, 还与糖尿病、癌症、心血管疾病等相关。体内保持足够的维生素D对糖尿病等都有一定的预防作用。目前维生素缺乏已经成为一个全球性问题, 对体内维生素D含量的检测受到了越来越多的关注。25-羟基维生素D是体内维生素D的主要代谢形式, 包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3两种形式, 其含量可以代表体内维生素D的水平。目前国内外对血清中25-羟基维生素D的检测方法主要有放射免疫、竞争蛋白结合法以及新兴的串联质谱法。与传统方法相比, 串联质谱法定量测定25-羟基维生素D具有更好的特异性和更强的抗干扰性, 并能实现25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的同时测定[7]。郭守东等[8]利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]串联质谱法检测糖尿病患者血浆中25-羟基维生素D3水平, 发现糖尿病患者25-羟基维生素D3水平明显低于健康人。周宁等[9]利用串联质谱法对过敏性鼻炎儿童血清中的维生素D进行了检测, 发现患儿维生素D水平低于正常儿童, 且维生素D3尤为显著。由此可见, 当需要区分维生素D的不同代谢产物种类时, 串联质谱法比传统免疫法具有明显的技术优势。 3. 激素检测 对类固醇激素及其代谢产物的检测是生物质谱技术在临床生化检验中一个非常重要的项目。通过质谱定量检测, 可以判断相应的类固醇激素与疾病的相关性[10, 11]。目前利用质谱技术可以对睾酮、脱氢睾酮、雄酮、雌酮、雌二醇和雌三醇等多种激素进行定量检测, 进而对相关疾病进行临床诊断和治疗, 如先天性肾上腺增生症、家族性高醛甾酮过多症、原发性醛固酮增多症等[1]。丁一峰等[12]利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱[/color][/url]-质谱联用法分析尿液中的类固醇, 实现多种激素同时检测, 且不同激素之间没有交叉反应, 准确性和灵敏度较好, 并证明类固醇激素水平与肾上腺和性腺等类固醇激素代谢异常疾病有关。黄河花等[13]建立了一种基于电喷雾电离质谱同时检测脱氢表雄酮、睾酮和雄酮的定量方法, 检测快速、灵敏度高、准确性好。 4. 血药浓度监测 在临床疾病治疗中, 很多药物的浓度需要严格限定在某一合适范围, 过少达不到治疗效果, 过多则可能引起毒性或成瘾反应, 造成不良后果, 给患者带来巨大痛苦。对这些药物浓度的检测目前我国主要应用免疫化学方法。这种方法虽简单易行, 但只能检测少数几种药物, 无法满足临床检测的要求。而且一般药物在体内的浓度都很低, 要求检测方法具有高灵敏度。近年来, 质谱技术逐渐成为药物浓度检测的重要手段。多种药物均可以利用质谱技术进行准确检测, 而且可以实现多药物同时检测, 提高了临床检测工作的效率。目前国际上已经在临床开展的药物浓度监测项目包括器官移植患者使用的免疫抑制剂、疼痛治疗药物、抗精神病药物、麻醉药、抗逆转录病毒药物等。同时随着质谱技术的不断发展和完善, 其有望成为药物及其代谢产物检测的“ 金标准” [14]。曲素欣等[15]建立了基于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]-质谱联用技术检测卡马西平浓度的方法, 并研究了该药物与癫痫疗效的关系。该检测方法特异性强、操作方便, 具有很好的灵敏度和准确性, 且重现性良好。崔刚等[16]建立了超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]-质谱联用技术检测肾移植患者体内霉酚酸浓度的方法。该方法快速、准确, 可广泛应用于器官移植患者血药浓度的临床监测中。 5. 痕、微量元素检测 人体元素含量可以作为很多疾病的标志物, 检测人体痕、微量元素可以辅助诊断某些临床疾病和职业病。元素检测中常用的方法为发射光谱法和质谱法。质谱法可以实现多元素同时检测, 且灵敏度高、检测限低、动态范围宽, 可以直接对血液样品进行检测。目前质谱技术已成为无机元素分析的主要方法之一, 已建立了几十种痕、微量元素的检测方法, 广泛应用于全血、血清、尿液和头发中砷、铅等有害重金属以及铁、锌、硒等人体微量元素的检测[17]。张文洁等[18]利用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/yp][color=#3333ff]电感耦合等离子体质谱[/color][/url]法对慢性肾炎患者血清中的微量元素做了检测, 发现慢性肾炎患者血清中钠、钾等元素与正常人无明显差异, 而铝、铁、锌等明显低于正常人。该方法可以对患者血液中微量元素的变化做实时监测, 为慢性肾炎的临床治疗提供指导。欧阳珮珮等[19]建立了基于质谱法的分析方法并对全血中5种微量元素同时做了检测, 此方法检出限低、灵敏度高、准确性好, 元素之间干扰较小, 符合复杂生物样品多元素同时检测的要求。 6. 其他项目 除以上项目外, 质谱技术的临床研究也已全面开展。叶军等[20]利用质谱技术对临床诊断不明的神经系统、消化系统以及皮肤损害患儿做了检测, 诊断患儿为多种羧化酶缺乏症, 并对生物素治疗过程做了监测, 发现疗效显著。 二、总结与展望 质谱技术自诞生以来发展十分迅速, 在临床生化检验中的作用越来越明显, 成为临床检验中的重要新型工具。质谱技术较其他方法具有更高的特异性、灵敏度、准确度、精确度, 且检出限低, 不受抗体或特殊生化反应的限制, 在临床应用中具有很好的前景。新生儿遗传代谢病筛查等多个项目已经在临床检验中得到广泛应用。 相比较而言, 我国临床生化检验中质谱技术的应用还非常有限, 与国外发展水平差异较大, 很多相关部分还需要进一步完善, 例如:质谱检测数据的判断标准、技术方法的掌握与人员培训、质量控制体系的建立、收费渠道与收费标准的确定等等。目前我国串联质谱技术进行临床生化检测的项目单一, 主要集中于少量第三方检测机构与妇幼保健单位, 独立于大型综合医疗机构之外, 不利于临床质谱技术的进一步深入发展。因此, 从临床需求出发, 结合医院实际情况, 完善技术与管理方案, 力求形成临床、科研、政府管理部门密切沟通合作的工作模式是发展质谱等新型检测技术的有效途径。
[font=&][size=14px]质谱成像(Imaging Mass Spectrometry, IMS)这种最新原位分析技术主要是利用质谱直接扫描生物样品,分析分子在细胞或组织中的“结构、空间与时间分布”信息。其基本流程(以质谱分析生物组织标记物为例)见下: [color=#333333] [/color][/size][/font][img]https://file.jgvogel.cn/134/upload/resources/image/406626.jpeg?x-oss-process=image/resize,w_700,h_700[/img][font=&][size=14px]简单而言,质谱成像技术就是借助于质谱的方法,再配套上专门的质谱成像软件控制下,使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。但是随着这项技术的不断发展,也陆续出现了许多针对各种问题的新技术。[/size][/font][font=&][size=14px]最早的质谱成像技术是基质辅助激光解吸电离(MALDI,matrix assisted laser desorption ionization)质谱分子成像技术,由范德堡大学(Vanderbilt University)的Richard Caprioli等在1997年提出,他们通过将MALDI质谱离子扫描技术与专业图像处理软件结合,直接分析生物组织切片,产生任意指定质荷比(m/z)化合物的二维离子密度图,对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析,可通过所获得的潜在的生物标志物的空间分布以及目标组织中候选药物的分布信息,来进行生物标志物的发现和化合物的监控。[/size][/font][font=&][size=14px]正如数字图像包括三个通道:红,绿,蓝一样(单个亮度定义了每个像素的颜色),质谱成像也包含了数以千计的通道,每一个对应于一个特殊的光谱峰值,“你可以通过质谱方法从这些像素中获得任何信号,然后调整图像中所需分子像素的相对亮度,最后,得到一张分子特异性的成像图。”[/size][/font][font=&][size=14px]这种方法可用于小分子代谢物,药物化合物,脂质和蛋白,而且,质谱成像能相对快速的利用许多分子通道,完全无需特殊抗体,下面列出五种先进的质谱成像方法。[/size][/font][font=&][size=14px]1、MALDI质谱分子成像技术[/size][/font][font=&][size=14px]在对组织或生物体进行成像,分析小分子构成的时候,有一个“拦路虎”总是阻碍实验的进程,那就是多肽,这些多肽体积十分大,要想对它们进行分子成像几乎是不可能的,比如,想要研究肿瘤边缘的分子微环境,如果直接成像是不可能获得清晰图像的。[/size][/font][font=&][size=14px]来自范德堡大学的质谱方法专家Richard Caprioli博士因此发明了基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱分子成像技术,这项技术不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子,它可在组织切片中找到每一种蛋白质分子,并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息,而事先无需知道所检测蛋白的信息。同时,可对这些蛋白质分子含量进行相对定量。[/size][/font][font=&][size=14px]MALDI质谱分子成像是在专门的质谱成像软件控制下,使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。被用来研究的组织首先经过冰冻切片来获得极薄的组织片,接着用基质封闭组织切片并将切片置入质谱仪的靶上。通过计算机屏幕观察样品,利用MALDI系统的质谱成像软件,选择拟成像部分,首先定义图像的尺寸,根据尺寸大小将图像均分为若干点组成的二维点阵,来确定激光点轰击的间距。激光束通过这个光栅图案照射到靶盘上的组织切片,软件控制开始采集质谱数据,在质谱仪中,激光束对组织切片进行连续的扫描,组织样品在激光束的激发下释放出的分子被质谱仪所鉴定从而获得样品上每个点的质荷比(m/z)信息,然后将各个点的分子量信息转化为照片上的像素点。在每个点上,所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集组织切片的质谱数据,最后得到具有空间信息的整套组织切片的质谱数据。这样就可以完成对组织样品的“分子成像”。设定m/z的范围,即可确定该组织区域所含生物分子的种类,并选定峰高或者峰面积来代表生物分子的相对丰度。图像中的彩色斑点代表化合物的定位,每个斑点颜色的深浅与激光在每一个点或像素上检测到的信号大小相关。[/size][/font][font=&][size=14px]通过增加单位面积上轰击的激光点数量和像素,研究人员可以获得更多的样品信息,例如,采用4000像素比200像素能够得到更好的样品图像。质谱分子成像技术是一种半定量或相对定量技术,图像上颜色深的部分表明有更多的生物分子聚集在组织的这个部分,然而,不可能据此确定生物分子在组织的不同部位的实际绝对含量。选择组织图像上的任意一个斑点,图像都能够给出一个质谱谱图或者离子谱图,代表在组织的该部位存在这种生物分子,然后,与做指纹图谱类似,像做指纹图谱那样,将样品的离子谱图与已知标准品进行对照,分析差异,从而进行生物标志物的发现和药物作用的监控。[/size][/font][font=&][size=14px]2、电喷雾电离技术[/size][/font][font=&][size=14px]一般质谱成像方法由于体积庞大,重量重,需要冗长的样品准备阶段,因此,并不适用于即时成像(bed side applications),比如,要帮助外科医生进行实时的肿瘤边界成像监控,那么就要寻找新的方法了。[/size][/font][font=&][size=14px]一种称为电喷雾电离技术(desorption electrospray ionization,DESI)的MS成像技术解决了这个问题。DESI技术于2004年首次提出,由于这一方法具有样品无需前处理就可以在常压条件下,从各种载物表面直接分析固相或凝固相样品等优势而得到了迅速的发展。[/size][/font][font=&][size=14px]这种方法的原理是带电液滴蒸发,液滴变小,液滴表面相斥的静电荷密度增大。当液滴蒸发到某一程度,液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发,就可获得自由徘徊的质子化和去质子化的蛋白分子DESI与另外一种离子源:SIMS(二次离子质谱)有些相似,只是前者能在大气压下游离化,发明这项技术的普渡大学Cooks博士认为DESI方法其实就是一种抽取方法,即利用快速带电可溶微粒(比如,水或者乙腈acetonitrile)进行离子化,然后冲击样品,获得分析物的方法。[/size][/font][font=&][size=14px]DESI系列产品最大的优势就在于无需样品处理,一般质谱和高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]分析,样品必须经过特殊的分离流程才能够进行分析检测,使得一次样品检测常常需要约一个小时,而DESI系列产品可将固体样品直接送入质谱,溶液被喷射到检测表面,促使样品离子均匀分布。采用这一手段的质谱分离过程,只需3分钟左右即可完成。[/size][/font][font=&][size=14px]3、APIR MALDI/LAESI技术[/size][/font][font=&][size=14px]了解细胞的内部成分是理解健康细胞不同于病变细胞的关键,但是,直到目前为止,唯一的方法是观察单个细胞的内部,然后将其从动物或植物中移除,或者改变细胞的生存环境。但是这么做的话,会使细胞发生变化。科学家还不是很清楚一个细胞在病变时与健康细胞的差别,或者当它们从一个环境移到另一个环境中产生的变化。[/size][/font][font=&][size=14px]来自华盛顿大学Akos Vertes教授希望能从另外一个方面来进行活细胞分析,在他的一项关于活叶样品中初级和次级代谢产物分布的研究中,研究人员发现叶片中积累基质很厚,常导致光谱末端低分子量部分模糊,而且基质辅助激光解析电离(MALDI)质谱分析需要在真空中进行,但是,活体样本在真空中无法存活。[/size][/font][font=&][size=14px]实际上,MALDI质谱分析的原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,由于,基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,致使基质和分析物膨胀并进入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相[/color][/url]。而生物样品也可以直接吸收能量的,比如,2.94mm波长的光能激活水中氢氧键。[/size][/font][font=&][size=14px]因此,Vertes等人想到复合两种技术来解决这一问题。首先他们利用大气压红外线(an atmosphericpressure infrared,APIR)MALDI激光直接激活组织中的水分,使样品气化,就像是组织表面发生了细胞大小的核爆炸,从而获得了离子化微粒,进入质谱中进行分析。但是并不是所有的气化微粒都带电,大部分其实是不带电的,会被APIR MALDI遗漏。[/size][/font][font=&][size=14px]为了捕捉这些中性粒子,Vertes等人采用了第二种方法:[/size][/font][font=&][size=14px]LAESI(laser ablation electrospray ionization,激光烧蚀电喷雾电离),这种方法能捕捉大量带电微滴的微粒,然后重新电离化。通过对整个样品进行处理,复合这两种方法,就能覆盖更多的分子,分析质量更高。[/size][/font][font=&][size=14px]与一般质谱成像过程不同,Verte的方法还在成像中增加了高度,从而实现了3D代谢物成像。这项技术的分辨率是直径10mm,高度30mm,这与生物天然的立体像素相吻合,这样科学家们就可以获得天然构像。[/size][/font][font=&][size=14px]4、二次离子质谱技术[/size][/font][font=&][size=14px]质谱成像技术能将基质辅助激光解吸电离质谱的离子扫描与图像重建技术结合,直接分析生物组织切片,产生任意质荷比(m/z)化合物的二维或三维分布图。其中三维成像图是由获得的质谱数据,通过质谱数据分析处理软件自动标峰,并生成该切片的全部峰值列表文件,然后成像软件读取峰值列表文件,给出每个质荷比在全部质谱图中的命中次数,再根据峰值列表文件对应的点阵坐标绘出该峰的分布图。[/size][/font][font=&][size=14px]但是,一般的质谱成像技术不能对一些携带大分子碎片的化学成分进行成像,来自宾夕法尼亚州州立大学的NicholasWinograd教授改进了一种称为二次离子质谱(SIMS,secondary ion mass spectrometry)的方法,可以对样品进行完整扫描,三维成像。[/size][/font][font=&][size=14px]SIMS早在用于生物学研究之前就已经应用广泛了,比如,分析集成电路(integratedcircuits)中的化学成分,这种质谱技术是表面分析的有利工具,能检测出微小区域内的微量成分,具有能进行杂质深度剖析和各种元素在微区范围内同位素丰度比的测量能力。[/size][/font][font=&][size=14px]这种技术具有几个优点:[/size][/font][font=&][size=14px]速度快(-10,000 spectra per second),亚细胞构造分辨率(-100nm),以及不需要基质。但是另外一方面,不同于MALDI方法,SIMS方面不是一种“软”技术,这种方法只能对小分子成像,因此常常需要进行粉碎。[/size][/font][font=&][size=14px]Winograd教授改进了这一方法,他利用了一种新型SIMS光束(carbon-60磁性球),这种新光束比传统的SIMS光束对物体的化学损伤更小。C60同时撞击样品表面,类似于“一阵爆炸”,这样重复的轰击使得研究人员能深入样品,进行三维分子成像,Winograd教授称这个过程是“分子深度成像”(molecular depth profiling)。[/size][/font][font=&][size=14px]C60的能量与其它的离子束相当,却不到达样品表面以下,这样样品可以连续地被逐层剥离,研究人员就可以得到纵面图形,最终获得三维的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液将硅的薄片包裹起来并进行SIMS实验,随着薄膜逐渐被C60剥蚀,可以获得糖和肽的稳态信号。最终,薄膜完全剥离后就可以获得硅的信号。如果用其它的射线或原子离子代替C60,粒子束会快速穿过肽膜而无法提供有关生物分子的信息。因此,这种方法具有良好的空间分辨率,能够获得巨噬细胞和星型细胞的细胞特征和分析物的分布情况。[/size][/font][font=&][size=14px]这里还要说到一点,SIMS和上一技术(APIR MALDI/LAESI技术)都可以对三维成像,但两者也有差别,SIMS方法中,采用高能离子轰击样品,逐出分析物离子(二级离子),离子再进入质量分析器。MALDI方法则用激光辐射样品使之离子化,另外SIMS探针可以探测到100nm的深度,能提供纳米级的分辨率,而MALDI可以探测更深,但空间分辨率较低。[/size][/font][font=&][size=14px]5、纳米结构启动质谱技术[/size][/font][font=&][size=14px]质谱在检测生物分子方面有很大潜力,但现有方法仍存在一些缺陷,灵敏度不够高和需要基质分子促使分析对象发生离子化就是其中之二。比如说,需要溶解或者固定在基质上的方法检测代谢物,较易错判,因为这些代谢物与那些基质常常看上去都一样。另外基于固定物基质的系统也不允许研究人员精确的判断出样品中某一分子到底来自于哪儿。[/size][/font][font=&][size=14px]来自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士发明了一种称为纳米结构启动质谱(nanostructure-initiator mass spectrometry,NIMS)的新技术,这种技术能以极高的灵敏度分析非常小的区域,从而允许对肽阵列、血液、尿和单个细胞进行分析,而且还能用于组织成像。 [/size][/font][font=&][size=14px]NIMS利用了一种特制的表面,这种多孔硅表面上聚集了一种含氟聚合物,这些分子在受到激光或离子束照射时会猛烈爆发,这种爆发释放出离子化的分析物分子,它们被吸收到表面上,使其能够被检测到。这种方法利用激光或离子束来从纳米尺度的小囊中气化材料,从而克服了一般质谱方法缺少所需的灵敏度和需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷。 [/size][/font][font=&][size=14px]通过这种方法可以分析很多类型的小分子,比如,脂质,糖类,以及类固醇,虽然每一种分析材料需要的含氟聚合物有少许差别,但是这是一种一步法的方法,比MALDI简单多了——后者需要固定组织,并添加基质。 [/size][/font][font=&][size=14px]由于,含氟聚合物不能很好的离子化,因此,会发生轻微的光谱干扰,而且由于离子化过程是“软性”的——就像MALDI,所以NIMS产生的生物分子是整块离子化,而不是片段离子化。不过这种技术对于完整蛋白的检测灵敏度没有MALDI高[/size][/font]
原创与否转贴“人类天生就可以收集大量的视觉信息。”范德堡大学医学院斯坦福·摩尔生物化学主任与质谱研究中心主任Richard Caprioli表示,“我们喜欢图样、我们喜欢照片,我们通过一张简单的照片可以获得大量的信息。”在Caprioli看来,这一点解释了质谱成像技术(MSI)为什么越来越受欢迎。尤其是这项技术可以帮助组织学家获得原本需要数年才能掌握的专业知识。“它采用的不是颜色维度,而是分子维度。但这个事实并不是那么重要,只要分子维度有足够的信息量。”他说。质谱成像技术就像是免疫组织化学的高通量版本,只是没有抗体而已。质谱成像技术并没有为组织切片事先染上特殊标记,它使用质谱仪一次性挑选并绘制成百上千种分子的空间排列。研究者无需提前知道哪个分子比较重要,就可以利用该技术进行绘制挑选,而且速度很快。“我们的仪器有激光,每秒可以做5000个质谱。”Caprioli表示,这一速度足以在一个小时之内扫描包括数百个病患活组织在内的组织微阵列整体。但是,质谱成像技术的应用也存在明显的障碍。比方说,图像分辨率随着光点尺寸的减小而升高,但却降低了离子材料的产量。该技术并没有初步分离的步骤,因此可能会只抽取丰度最高的分子。而在计算方面,研究人员面临的挑战则是如何对数据进行分析,特别是如何能够真正理解这些数据。但是不管怎么说,研究人员正在使用质谱成像技术进行研究,无论是确定亚细胞分辨率下组织切片中的药物代谢产物,证实疾病的生物标记,还是鉴别肿瘤的边界等等。他们甚至正在将该技术引入临床,至少是接近于临床研究。质谱成像技术的策略那么,什么是质谱成像技术?就像是一张标准的数码照片,数字成像的色彩是通过红绿蓝3个颜色通道叠加而成的,屏幕上每个小像素的颜色都是由这三个颜色的密度所构成的。现在,想象一张拥有成千上万个颜色通道的图片。这就是质谱成像技术,Caprioli说,每个通道都是你想要展示的那个分子种类或质谱峰。研究人员将这些不同的通道互相覆盖,便可以产生一个针对组织分子构成和空间分布的彩色绘图,无论是对蛋白质、神经肽、代谢分子还是脂类等组织——显然脂类的需求正在增加。研究人员为质谱成像技术设计了几十套方案,但正如2012年的综述中所说的(J. Proteomics, 75:4883, 2012),只有三种是最常见的。Caprioli的基质辅助激光解析质谱成像技术(MALDI-MSI)通过紫外线激光光栅扫描一个基质包膜的组织切片来建立图像。该技术的像素大小一般近似于1到10个微米,意味着它可以达到亚细胞分辨率。但由于它需要使用MALDI基质和真空环境,所以MALDI-MSI不适用于活体样本。同时,基质是用来吸收激光能量并转移到样本上去,但是这种基质可能会很难在样本上操作并产生大量的小分子量的电离物,这会遮蔽生成光谱的代谢区域。宾夕法尼亚州立大学埃文·普名誉化学教授Nick Winograd采用了第二种方法——次级离子质谱法(SIMS)。这种方法通过在样品表面喷镀离子束让样品产生电离作用(比方说,英国Ionoptika公司的带电C60分子或氩团簇束),不使用激光。Winograd称,这种方法有两大优点,第一个是分辨率:SIMS得出的像素约有300纳米,而MALDI充其量只有1毫米。另一个是通过分子深度剖析,研究人员可以使用碰撞而成的坑痕去“深挖”这个样本,通过三维立体化绘制其分子组成物。第三种是电喷雾解析电离技术(DESI),这种(非真空的)电离技术通过喷射溶剂,将溶剂覆盖在未经处理的组织表面上,溶解表面的分子。然后再继续往上滴溶剂,以使溶解物溅到质谱仪上,进行电离和分析。(Prosolia公司对DESI技术进行商业化,该公司由该技术的发明者、普度大学化学家R. Graham Cooks共同创办。)DESI、MALDI、SIMS这三种技术以及他们的变体都采用阿姆斯特丹FOM研究所AMOLF学院Ron Heeren所谓的“微探针”模式,分辨率随着像素尺寸减小而升高。这里面的问题是如何从尽可能小的光点中最大化样品的电离作用。但是较小的光电也就意味着检测到的离子会更少,且不要说成像时间会更长了(因为里面的像素会变多)。Heeren更喜欢“显微”模式。这种模式可以用散焦像素更快成像,再加上像素检测器如CCD,可以有效地一次性捕获262144(512x512)个光谱。“这就像个相机。”Heeren解释道,“就是一点,我们制造的是分子闪光照片。”Heeren认为这个“质谱显微镜”的关键是Timepix探测器,这个探测器是CCD和飞行时间质谱分析器的结合。(Heeren共同创立的Omics2Image拥有Timepix探测器)。他解释,大多数质谱检测装置将探测器视为一个大的像素,将所有到达表面的离子碰撞整合为一个单一的信号。Timepix将这个信号分成262000个空间分辨的点,这样在探测到成像表面分子时,它们可以保持并记录自己的空间定位,成像速度非常快。有多快?Heeren说,MALDI-MSI仪器可以产生每秒钟一个像素,达到一微米的分辨率。因此在一个100x100毫米的区域中,要想生成1万个像素需要花费2.7个小时。但使用质量显微镜和Timepix探测器,“我们可以在一秒钟内得到这些信息。”显微镜上还有物理电子学TRIFT SIMS-TOF系统,上面还有一个MALDI技术,Heeren团队最近正在使用这一技术探索骨关节炎下的生理变化。“我们甚至可以证实,在蛋白质水平和脂代谢水平上的生理变化以及软骨矿化,会导致软骨机械强度的流失。”他说。常态MSI与MALDI和SIMS相比,DESI和激光烧蚀电喷雾技术(LAESI,由Protea Biosciences推出的激光技术)这些正常大气压下的电离技术拥有一些特殊的优势。最明显的优势是,他们不需要进行样品处理,在正常空气中操作即可,不需要真空。因此,他们可以用在活体样本上,甚至可以在患者身上进行操作。“我自己这辈子的追求就是:用未处理过的样品就可以进行质谱分析。”这是Cooks几十年来的目标。作为一个研究者,Cooks的工作是提取并测定植物生物碱的结构。很长的一段时间内,研究都非常艰辛,他只提取了一点“不纯的生物碱,而且也没有做出结构方面的进展”。直到他遇到了从斯坦福大学来演讲的Carl Djerassi。他说,Djerassi把他的材料样品带回了实验室,并收集它们的质谱,十天后又把结构发了回来。“这让我相信质谱分析法的强大。”Cooks说,“同时,我也发现提取方法学中存在的局限性。”从那以后,他开始从那些在生物上不怎么好操作的技术限制中脱出来,进行质谱分析,发展了正常气压下的电离技术,特别是DESI。2011年,由Cooks和哈佛医学院Nathalie Agar共同领导的团队,使用电喷雾解析电离质谱技术(DESI-MS)来存储脑肿瘤组织,使用脂类特征检测结果帮助电脑区分不同形式和组织病理学分级的神经胶质瘤(一种脑瘤)。对于这种分析来说,脂类是一个古怪的选择。的确,脂类对于MSI从业者来说就是无奈之举,但他们必须从中获取最大的价值。在标准的细胞分析中,研究人员可以分离细胞提取物,并去掉不想要的部分,这其中往往就包括脂类。但是在MSI及其他原位应用中,研究人员必须知道自己面前摆着的是什么。他们面前摆着的主要是脂类。但幸运的是,脂类不仅丰度高,非常容易电离,而且信息量也很大。“如果你只看脂类的话,它的组织特征比蛋白质要好得多。”伦敦帝国学院医疗质谱部门研究员Zoltán Takáts这样说。最近,Cooks和Agar将这一方法应用到5个正在进行治疗的脑癌病人的32个手术标本当中。该系统通过逐个像素报告了肿瘤的亚型、分级以及癌细胞的部分。Cooks说,这些数据可以让他们的团队在绘制肿瘤边界时找出不同组织病理学级别的各个区域,补充MRI数据。他还强调,他们使用的是“最便宜的”质谱分析仪器,Thermo Fisher公司的单级(与串联相对)低分辨率LTQ离子阱。但Agar也指出,这还是一个研究项目,团队不能实时将这些结果传递给外科医生,他们在波士顿收集样本,但真正成像却是在印第安纳州。自那以后,她的团队在布莱罕妇女医院的AMIGO手术室安装了Bruker公司利用DESI技术的amaZon Speed离子阱,用来进行脑瘤案例的测试。该手术室是医院的影像引导治疗国家中心。Agar说,很快他们会研制出乳腺癌测试,但是团队仍然不能指导外科医生真正操刀。这种方法首先必须经过验证,“这最终会需要经过临床试验进行验证。”简化数据分析最终,要想把MSI推向临床,就必须要跨越质谱仪专家,让真正需要使用它的人掌握这门技术。然而,没有几个临床医生能够掌握MSI技术、数据处理和信息学的精妙,而且更没有人愿意花时间学习了。在Cooks看来,如果这项技术“又娇贵,而且这项质谱技术需要博士才能掌握”的话,就很难进行推广,“它需要全自动,仪器也不能那么娇贵,必须要可靠而且相对简单。”对于典型的组织病理学应用来说,这不是什么问题,因为这个系统可以配置成智能盒子(turnkey boxes),只有通过特定的生物标记才能打开。全球的各大临床实验室已经在常规地使用非成像质谱仪,包括Bruker公司的MALDI BioTyper和Sequenom公司MassARRA