全自动二级

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一、引言含有二硫键的环肽代表了一类具有广泛生物功能的化合物，其功能范围从毒素到重要的激素。1二硫键有助于稳定肽的二级结构和构象，这有利于提高蛋白水解稳定性和目标亲和力。2由于它们具有潜在的治疗价值，对合成含二硫键桥连的环肽的兴趣稳步增长。通过使用正交保护的半胱氨酸氨基酸，如Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH和Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH（图1），可以制备含有二硫键的肽。Cys(Mmt)基团可以使用稀释的三氟乙酉夋(TFA)溶液选择性去保护，而Cys(STmp)基团则使用二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂进行正交去保护。去保护后，使用N-氯琥珀酰亚胺(NCS)作为温和氧化剂，可以选择性氧化Cys巯基形成二硫键。3 在这里，我们报告了使用Liberty BlueTM微波肽合成器全自动合成良好纯度的含二硫键桥连的环肽。一个骨形态发生蛋白受体激活素样激酶3 (Alk3)的肽激动剂THR-1234，在3小时内完成合成，纯度为77%。最后，一种含有两个二硫键的锥蜗牛毒素肽（Conotoxin-SI）5在不到4小时内合成，纯度为67%。将微波能量应用于二硫键桥连肽的合成可以实现更高效的偶联，从而快速合成并达到高纯度（CarboMAXTM）。6图1. 左：Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH；右：Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH二、实验部分HE-SPPS材料和方法：所有肽都是在CEM Liberty Blue&trade 自动微波肽合成器上合成的，使用的是Rink Amide ProTide&trade LL树脂（0.19 mmol/g替换）或Cl-MPA ProTide&trade LL树脂（0.18 mmol/g替换）。使用DMF进行后去保护洗涤，然后采用DIC/Oxyma活化方法进行偶联。肽树脂在CEM Razor® 肽裂解系统上用TFA/TIS/H2O/DODT（92.5/2.5/2.5/2.5）裂解。肽在冷乙酉迷中沉淀，粗品在分析前进行冻干。 分析：粗肽在配备了Acquity UPLC BEH C8柱（1.7 μm, 2.1 x 100 mm）的Waters Acquity UPLC系统上进行分析，该系统装有PDA检测器。UPLC系统连接到Waters 2100单四级杆MS用于结构测定。峰分析是在Waters MassLynx软件上完成的。分离是通过（i）水中的0.05% TFA和（ii）乙腈中0.05% TFA的梯度洗脱进行的。三、结果和讨论A）合成THR-123，CYFDDSSNVLCKKYRS-CO2H选择THR-123（图2）来展示含有C端酸的单一二硫键桥连肽的合成。该肽在10 µ mol规模上使用Cl-MPA ProTide&trade LL树脂（0.18 mmol/g替换）进行合成。第一个氨基酸使用CEM之前报道的氯化物加载循环自动加载。所有其他氨基酸循环使用1分钟/90º C去保护和一次2分钟/90º C与DIC/Oxyma偶联（使用Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于C）。使用2% TFA的DCM溶液进行Cys(Mmt)的去保护。反应在室温下进行1分钟，重复五次。使用25 mM的NCS的DMF溶液实现二硫键的形成。反应在室温下进行15分钟。在Liberty Blue自动微波肽合成器上进行的THR-123的微波增强SPPS产生了77%纯度的目标肽（图3）。图2.THR-123图3. THR-123的UPLC色谱图B) 合成Conotoxin-SI，ICCNPACGPKYSC-NH2选择Conotoxin-SI（图4）来展示含有两个二硫键的环肽的合成。该肽在10 µ mol规模上使用Rink Amide ProTide&trade LL树脂（0.19 mmol/g替换）进行合成。所有氨基酸循环使用1分钟/90º C去保护和一次2分钟/90º C与DIC/Oxyma偶联（使用Fmoc-(S)-Cys(Mmt)-OH用于C；使用Fmoc-(S)-Cys(STmp)-OH用于C）。使用2% TFA的DCM溶液进行Cys(Mmt)的去保护。反应在室温下进行1分钟，重复五次。使用25 mM的NCS的DMF溶液实现二硫键的形成。反应在室温下进行15分钟。使用5% DTT + 0.1 M NMM的DMF溶液进行Cys(STmp)的去保护。反应在室温下进行5分钟，重复三次。最后，使用25 mM NCS的DMF溶液形成第二个二硫键（室温下15分钟）。在Liberty Blue自动微波肽合成器上进行的Conotoxin-SI的微波增强SPPS产生了67%纯度的目标肽（图5）。图4.Conotoxin-S图5. Conotoxin-SI的UPLC色谱图四、结论采用全自动快速合成技术，我们成功高效地完成了含二硫键桥接的环肽的合成，并且实现了较高的纯度。借助CarboMAX&trade 6化学技术，偶联效率得到了显著提升，这不仅极大缩短了合成时间，还确保了产物的高纯度。例如，一个C端带有羧酸的环状二硫键桥接肽——THR-123，在短短不到3小时的时间内就被迅速合成出来，且纯度达到了77%。相比之下，传统的室温合成方法通常需要长达20小时来合成包含两个二硫键的Conotoxin-SI。3而利用微波增强的固相肽合成技术（SPPS），在不到4小时内就制备出了纯度为67%的相应肽。引用1 Góngora-Benítez, M. Tulla-Puche, J. Albericio, F. Chem. Rev. 2014, 114 (2), 901–926.2 Adessi, C. Soto, C. Curr. Med. Chem. 2002, 9 (9), 963–978.3 Postma, T. M. Albericio, F. Org. Lett. 2013, 15 (3), 616–619.4 Sugimoto, H. LeBleu, V. S. Bosukonda, D. Keck, P. Taduri, G. Bechtel, W. Okada, H. Carlson, W. Bey, P. Rusckowski, M. Tampe, B. Tampe, D. Kanasaki, K. Zeisberg, M. Kalluri, R. Kalluri, R. Nat. Med. 2012, 18 (3), 396–404.5 Azam, L. McIntosh, J. M. Acta Pharmacol. Sin. 2009, 30 (6), 771–783.6 CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature.”

2023 年 3 月 30 日 - 珀金埃尔默生命科学和诊断业务（将在2023年第二季度重新命名）宣布与百迈客生物（以下简称“百迈客”）深化合作，助力百迈客打造基于NGS（二代测序）建库的全自动生产线。凭借出色的高通量、智能化和信息化优势，该产线将成为基因测序领域自动化解决方案的行业标杆。作为国内大型测序服务公司之一，百迈客为国内外众多科研院所、制药公司、农业育种公司、医疗卫生机构提供先进的测序技术服务。随着测序业务及多组学业务的增涨，百迈客勇于自我变革，打破传统服务模式，于2021年1月引进国内首套explorer™ G3全自动高通量NGS文库构建系统，打造百灵1000自动化平台，以自动化取代传统的手工实验模式。2022年，珀金埃尔默与百迈客继续深化合作，联合开发百迈客自动化产线II期项目。此次百灵2000的推出，为双方合作开启了新的里程碑。秉承技术先导理念，优化自动化流程解决方案珀金埃尔默依据百迈客的通量需求及实验流程，设计了全新的自动化解决方案，实现包括简化基因组测序技术（SLAF-seq）、长链非编码RNA（LncRNA-seq）以及全长转录组测序（ISO-seq）等流程在内的全自动化。此次推出的百灵2000采用珀金埃尔默plate::handler Flex机械臂与 Green Button Go（GBG）中控软件，整合多台自动化设备，实现NGS样品均一化、文库定量、NGS文库Pooling等流程全自动化，能够实现7 x 24小时不间断运行，具备自动化无人值守、平行任务管理、多任务并行等特点。整个系统采用模块化设计，支持离线和在线使用，并通过条码实现样品的自动化管理以及数据追踪与溯源等功能，有效地控制了成本并优化了人机协作流程。图示：explorerTM G3全自动超高通量NGS（二代测序）文库构建系统提供更适合中国实验室的定制解决方案，加快缩小从研究到临床的鸿沟近日，珀金埃尔默宣布已完成分析与企业服务业务同生命科学与诊断业务的拆分，将专注于生命科学和诊断业务单元，推动对前沿技术和疾病领域的研究、探索和创新，积极打造更健康的世界。自1978年进入中国市场，珀金埃尔默一直秉持“扎根中国，服务中国”的理念，交付适合中国实验室的自动化智能化解决方案，提供基于NGS、药物开发与高通量筛选、合成物学、类器官以及细胞株开发等领域的全流程自动化方案。除百迈客外，珀金埃尔默还与国内多家OEM企业开展合作，加速肿瘤分子检测全自动方案在临床端的实施，以及个性化和精准医疗在临床中的普遍应用。随着自动化与智能化技术发展，珀金埃尔默不断加大国内软件开发投入，于2021年投资成都青软青之共同开发智慧实验室，实现订单、物料以及数据的自动化与智能化。珀金埃尔默大中华区生命科学事业部总经理刘疆表示：“ 我们很高兴能够持续深化与百迈客的合作，助力百迈客推出采用珀金埃尔默自动化解决方案的百灵2000全自动化平台。未来，我们将继续秉承扎根中国、服务中国的理念，通过与中国更多企业合作，提供更适合中国实验室的定制化自动化解决方案，缩小从研究到临床的鸿沟，加快中国生命科学产业的转型升级。”北京百迈客生物科技有限公司创始人兼CEO郑洪坤先生表示：“在珀金埃尔默创新产品和技术的支持下，我们的百灵全自动化平台成功上线并取得显著效益，新推出的百灵2000将有助于我们进一步实现NGS流程全自动化。未来，百迈客将继续与珀金埃尔默携手提升NGS流程自动化与智能化水平，同步搭载百迈客云，提升从样品到文库制备到生信分析的全流程、一站式、整体服务能力，全面提升百迈客测序服务品质。关于珀金埃尔默生命科学和诊断业务公司珀金埃尔默生命科学和诊断业务（将在 2023 年第二季度重新命名）提供端到端的解决方案，帮助科学家、研究人员和临床医生更好地诊断疾病，发现新的个性化的药物。我们拥有 11,000 专业人员，与商业、政府、学术和医疗健康领域的客户保持密切的合作，为之提供试剂、检测方法、仪器、自动化、信息化技术和战略服务，助力客户加快工作流程，并带给其切实可行的洞见，以作出更好的决策。公司也在通过极具活力的 ESG 和可持续发展项目，积极践行企业公民责任。公司2022年营收约为33亿美元，服务于 190个国家和地区，为标准普尔500指数成员。关于百迈客生物科技有限公司百迈客生物成立于2009年，是一家提供基因多组学测序服务和单细胞空间组学仪器设备的国家级高新技术企业。业务包括科技服务、智能制造两大业务板块；全球化的业务布局，在中国、欧洲等地区拥有以博士和硕士为主体的研发及服务团队，先后在《Cell》、《Nature》、《Science》等国际期刊上发表文章上千篇，累计影响因子超8000分；拥有Illumina、PacBio、ONT、AB等最先进的二代测序、三代测序和质谱检测平台，自主创新的百灵实验室全自动生产线、BMKCloud多组学大数据智能交付平台及亚细胞级S系列空间组学产品达到国际领先水平，为全球科研机构、医院、制药公司等提供高品质基因多组学服务和产品。想知道explorerTM G3全自动超高通量NGS（二代测序）文库构建系统如何发挥效果，仪器信息网此前曾在2021年首套系统落户百迈客是进行过采访，详情请见：黑灯实验室里的“智能工匠”。