匀染剂

2019年，BioArt曾解读Nature Reviews Cancer上的一篇观点文章（这篇观点文章是3月发表），讲述了染色体外DNA的（Extrachromosomal DNA，ecDNA）过去和未来（详见BioArt报道：特别推荐丨环状DNA的过去和未来），详细介绍了癌基因在ecDNA上扩增的重新发现的过程，强调ecDNA在肿瘤发病机制和加速癌症进化中的重要性。然而ecDNA的结构如何呢？同年11月21日，美国加州大学圣迭戈分校的Paul Mischel教授团队（注：Mischel正是Nature Reviews Cancer的通讯作者之一另外在2017年，Mischel团队曾发表一篇Nature文章揭示了染色体外癌基因扩增与肿瘤的关系）发表了Nature文章对ecDNA进行了详细解析，利用各种技术手段证明了ecDNA的存在形式是—环状，即ecDNA变成了eccDNA（详见BioArt报道：Nature亮点 | 吴思涵等首次解析肿瘤染色体外DNA的环状结构与功能）。功能上，eccDNA在癌症中扮演了重要的角色，尤其是原癌基因（详见BioArt报道：Nat Genet 丨ecDNA：在癌症基因组图谱上画出浓墨重彩的一笔）；来源上，eccDNA不仅来自于染色体，甚至可以整回到染色体中（详见BioArt报道：再一篇！Nat Genetics报道染色体外环状DNA新功能：驱动神经母细胞瘤基因组重排），那么，还有一个问题，eccDNA是否有序列或位置特异性，表观遗传学领域大佬哈佛医学院张毅教授于今年10月20日在Nature上给出了否定的回答，并提到eccDNA可能是基因组DNA随机断裂产生片段的环化产物（详见BioArt报道：专家点评Nature | 突破！张毅团队揭秘染色体之外环状DNA的前世今生）。再回到癌症，基因扩增对于癌症的发展“功不可没”，其扩增可以分为染色体外扩增（如双微体，double minutes，DM）和染色体内扩增（如均匀染色区，homogeneously staining regions，HSR）。除了DM和HSR，还有一种是巨型标记染色体（giant marker chromosomes）或者新染色体（neochromosomes）。这些概念也说明了癌症基因扩增中演化的复杂性。尽管扩增演化中的部分形式的机制已经相对比较明确了，比如串联重复等，但大部分还是不甚清楚。2021年11月15日，德国科隆大学儿童医院Matthias Fischer在Nature Genetics上发表了文章Chromothripsis followed by circular recombination drives oncogene amplification in human cancer，利用小儿神经母细胞瘤的全基因组测序发现一种新型扩增，并命名为“地震扩增”（seismic amplification，注：这一术语原本属于地质学或者地震相关学科），这一扩增的特点为多重重排和不连续的拷贝数，并且在38种不同类型肿瘤的发生率为9.9%（在38种不同类型肿瘤共计2756例病人中，出现例数为274，占9.9%）。机制上，地震扩增起始于染色体碎裂，产生染色体外环状DNA，之后是环状重组，由此导致原癌基因拷贝数增加、表达升高，从而促进癌症的发生。首先，研究人员检测了79例神经母细胞瘤样本的全基因组数据，对其基因扩增进行了详细分析，并将经历过14次及以上内部重排的扩增子定义为“地震扩增”。根据这一定义，神经母细胞瘤中228个扩增子中有20个属于“地震扩增”，并且影响了79例样本中的19例。其热点区域主要有两个，2p24（内部有MYCN）和12q13/12q15（内部有CDK4和MDM2）。除了神经母细胞瘤，研究人员进一步分析了TCGA上37种不同类型癌症的2677个肿瘤样本，对其“地震扩增”进行了描述。由于染色体碎裂可产生大规模的基因重组，研究人员比对了染色体碎裂和“地震扩增”的区域，发现77.6%的地震扩增子与染色体碎裂区域至少部分重合，其中34.9%是完全重合。同时研究人员排除了断裂—愈合—染色体桥循环（breakage-fusion-bridge cycles）是地震扩增起始事件的可能性。之后，研究人员对重排和扩增事件进行了分析，描述了“地震扩增”的过程模型：1）一个或多个染色体区域发生染色体碎裂；2）将随机片段整合为环状DNA；3）发生环状重组事件（这些环状重组事件与肿瘤细胞高频突变有关）；4）扩增区域或保留在双微体中、或以均匀染色区形式整合进染色体中、或形成新染色体。重要的是，“地震扩增”在肿瘤细胞中是稳定的，而非变化的。总之，该研究定义了一种复杂的基因扩增形式——“地震突变”，并描述了其扩增过程，为理解癌症基因组演化包括染色体外环状DNA提供了新的解读。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41588-021-00951-7

如今研究人员正越来越多的应用3D 细胞培养、微组织和类器官技术来填补2D 细胞培养与体内动物模型之间的差距。这是因为3D 模型能够更好地模拟微环境、细胞间相互作用和体内生物过程，因此相较于生化检测和2D 模型，3D 模型可提供更具生理相关性的条件。此外，其形态学和功能分化程度更高，这也赋予了它们更接近体内细胞的特征，并且从比体内动物模型具有更高的稳定性和可操作性，易于自动化，提高评估效率和准确性。然而，3D 类器官模型面临着诸多挑战，您需要合适的工具才能克服它们。比如在细胞显微成像分析环节，大而厚的细胞样品成像难度极高；同时处理3D 细胞实验产生的海量数据则是最为严峻的挑战——而3D 类器官深层智能高内涵成像分析系统结合近红外荧光探针整合方案，助您看的更深、更准、更快。国内外一线科学家团队典型案例多伦多大学David Andrews 教授团队利用患者活检肿瘤样本，建立PDC 模型，并通过高内涵Opera Phenix 对进行高通量图像采集。除分析常见的细胞活力指标，如细胞核形态、线粒体膜电位和凋亡之外，David Andrews 团队进一步利用机器自学习的优势来深度挖掘药物处理后的表型变化，利用对照药物，研究通过多指标分析定义多种表型，并以此为基础进行临床抗肿瘤药物的药效预测。通过分析药物处理后的PDC 细胞表型，不仅能预测针对特定病人的药物治疗有效性，还能挖掘药物对应的细胞表型，做到了细胞表型-药物相互作用的深度分析。图源：多伦多大学David Andrew 教授中国军事科学院王韫芳课题组，建立微肝球模型 (Liver biomatrices scaffolds, LBSs)，结合高内涵筛选系统Operetta CLS 和多功能酶标仪Ensight，从细胞活力、分化、代谢功能、环境相互作用和药效预测等多个指标上预测药物肝毒性机及其毒理机制研究。图源：中国军事科学院王韫芳教授高分辨率成像设计，助您看清三维每一处细节高内涵成像分析系统专为3D 类器官模型研究而设计，可协助您快速方便地从3D 样品中获取信息量丰富、更具生理相关性的数据：转盘共聚焦成像可快速采集光学切片图像，而且具有优异的信噪比和X-Y-Z 高分辨率。共聚焦转盘上的针孔只允许来自焦平面的光通过，而非焦平面的光信号被阻挡在针孔外，大大提升了获取图像的信噪比。在最小激发光强度下，以极高的帧速进行图像采集，因此转盘共聚焦成像是3D 球状细胞团和活样品成像的理想之选，不仅采集速度快，且光漂白效应极低。水浸式物镜的数值孔径比空气物镜更高，可捕捉到比空气物镜多高4 倍的光信号，因此可在X-Y-Z 方向都提供更高的分辨率。这意味着可以更快地捕捉到更多细节，并能对3D 深层结构进行成像，此外，对脆弱的活细胞样品进行成像时，可将光损伤将至最低。人肝脏微组织图像，类器官以 Hoechst（核，蓝色）和 CellMask™ Deep Red 质膜染料（红，细胞膜）3D 检测方法比传统的2D 检测方法更具挑战性，但这也正是研发过程中至关重要的一部分。其中一个挑战是如何从3D 细胞模型获取高质量图像。因为，诸如细胞核这类对象通常会沿着Z 轴变形，无法被正确分割。如本技术说明所述，当使用相同对象进行测试时，水浸式物镜能够显著改善3D 图像质量并检测到两倍于空气物镜的细胞核。红外荧光试剂，实时监测3D 肿瘤微环境红外 (NIR) 荧光试剂专为体内临床前成像设计。NIR 解决方案对于肿瘤学研究极有应用价值，同一肿瘤模型既可进行体外研究，也可通过异种移植物进行体内研究。靶向和可活化的NIR 试剂，最大激发波长低于700 nm，适用于多种基于高内涵类器官成像为基础的体外肿瘤模型。 为分析肿瘤相关生物标志物组织蛋白酶和基质金属蛋白酶的活性并使低氧区可视化 ，分别使用 100 μM NIR 试剂ProSense® 680 (NEV10003)、MMPSense® 680 (NEV10126)和HypoxiSense® 680 (NEV11070) 对3D 肿瘤组织染色。ProSense 680 试剂（左）显示出对整个微组织的均匀染色。MMPSense 680 试剂（中）在单独的细胞中被强烈活化，并在3D 组织内显示出微弱的荧光信号。HypoxiSense 680 试剂（右）对微组织染色后，核心区域显示出最强荧光，指示肿瘤组织的缺氧状态。NIR探针染色人肿瘤类器官的明场和荧光图像叠加，生成特征性染色图样低氧在恶性肿瘤以及快速发展的肿瘤中是一种普遍的现象，肿瘤内部血液供应不足产生的低氧环境与肿瘤的生理过程息息相关，包括基因调控、血管形成、信号通路的转导等。对于低氧相关通路的研究也是肿瘤治疗的新方向。为了研究低氧条件，在球体形成过程中接种不同数量的细胞，从而产生不同大小的微组织，HypoxiSense 680 荧光探针可指示肿瘤微环境内的低氧状态。扫描下方二维码，即可购买珀金埃尔默荧光探针智能化图像分析，从3D到切片一网打尽Harmony 软件已开发出针对大型3D 高内涵数据集的3D 可视化和分析工具，能够对诸如囊肿、微组织或球状细胞团块等3D 对象进行容量分析。除了此处所示的形态和位置属性， Harmony 还可以计算其他的3D 形态、3D 强度和3D 纹理属性，以对3D 细胞模型进行详细的表型鉴定。此外，为了避免空图像等无用数据，Harmony 的 PreciScan 提供了低倍率的预扫描和高倍率的再扫描自动化工作流程，用于球状细胞团块的目标成像或其他小概率事件。配置Harmony 高内涵软件以及Preci-scan 智能目标扫描模块，该系统可以轻松获取低倍镜扫描结果，自动化智能识别微组织所在位置, 进行居中位置优化后，在高倍镜进行高分辨率X-Y-Z 成像数据采集。智能排除空白区域或不符合采集条件的破损组织区域。这一功极大的节约了采集和分析的效率，让您在单次扫描就可以自由获取不同倍数的多倍率数据信息，是类器官成像分析，稀有细胞事件采集分析的理想解决方案。到目前为止，由于仍无适用于3D 高内涵数据分析的软件，即使是高质量的3D 图像也很难从中提取信息。由于3D 图像分析软件包是为在传统显微镜上采集单个样品而开发，因此通常以单个分析包的形式提供。用这样的软件包处理这种基于微孔板的高内涵数据费时费力，需要大量的用户交互和额外的数据转换步骤。Harmony 软件是一款集3D 图像采集、3D 可视化和3D 分析为一体的单一软件包，省去了采集和分析之间的数据转换。总而言之，配备了水浸式物镜和Harmony 软件的Operetta CLS 高内涵分析系统能够克服3D 分析中最关键的挑战，并为更多生理相关细胞培养模型的3D 成像和3D 表型鉴定提供了理想的一体化软件包。另外高内涵都成像分析系统可兼容组织切片，获得多色全视野组织切片影像数据。凭借其强大的自动化成像光路设计和智能化的Harmony 分析软件，能在快速准确评估多色标记的免疫荧光组织切片，不仅提高了成像效率，同时也可对批量图像数据进行全自动智能化定量分析。图源：多伦多大学David Andrew 教授以上案例进一步证明，无论是针对患者来源的细胞、微器官和组织切片模型，高内涵成像分析系统都凭借其强大的人工智能分析能力，可更快速适应用户自定义的自动化智能化细胞/微器官/组织成像及全方位分析需求，以加速临床前基础研究，促进科研转化和精准用药指导。

DNA不仅可以按其序列编码信息，也可以按其形状编码信息。人类基因组被分割成由染色质纤维折叠成动态的层次结构组成的染色体。这种空间结构（包括许多染色质环）可以将远端元件拉近，并将转录活动组织到不同的区域，从而限制了DNA的调控和转录机制。而在癌症中，这种染色质环境则发生了深远的改变【1】。近年来，编码癌基因的环状染色体外DNA（ecDNA）被证明在癌症中广泛存在，是癌症基因组的普遍特征，也是人类癌症进展的有力驱动因素。ecDNA是共价闭合双链，不同于在健康体细胞组织中发现的千碱基大小的环状DNA，其大小从100千碱基到数兆碱基不等，且被高度扩增【1】。ecDNA缺乏着丝粒，并且在每次细胞分裂后随机分布在子细胞中，使得其可以快速积累，且可以选择具有耐药性或其他适应性优势的ecDNA变体【2】。ecDNAs可以重新整合到染色体中，因此也可能作为某些染色体扩增的前体【3】。ecDNA具有更高的染色质可及性而缺乏更高的染色质致密性，且包含内源性致癌基因增强子元件，这表明癌基因扩增子可能是通过调控依赖性来扩增转录的【1,4】。值得一提的是，ecDNA存在于正常染色体环境之外，但其在细胞核中的空间组织尚不清楚。此外，ecDNA可以在细胞分裂期间或DNA损伤后聚集，但此生物学后果也尚不清楚。2021年11月24日，来自美国斯坦福大学的Howard Y. Chang团队在Nature上在线发表题为 EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression 的文章，研究了致癌ecDNA的空间、表观遗传学和转录动力学，揭示了由聚集在间期细胞细胞核中的约10-100个ecDNA组成的ecDNA“中心”，可以驱动分子间增强子信号以促使癌基因表达扩增，从而作为癌基因协同转录的组合增强子平台。研究人员利用DNA荧光原位杂交（FISH）技术，使用靶向多个细胞系中的ecDNA扩增的癌基因的探针来观察间期细胞核中ecDNA的定位，包括前列腺癌细胞系PC3（MYC扩增）、结直肠癌细胞系COLO320-DM（MYC扩增）、多形性成胶质细胞瘤细胞系HK359（EGFR扩增）和胃癌细胞系SNU16（MYC和FGFR2扩增）。结果显示，在进行实验的所有ecDNA阳性癌细胞中，尽管有数十到数百个单独的ecDNA分子，这些ecDNA的DNA FISH信号在很大程度上都局限于间期细胞细胞核的特定区域，由此表明ecDNA彼此发生了强烈聚集，该特征被称为ecDNA“中心”。这些ecDNA“中心”所占据的空间比相同大小的相邻染色体片段大得多，提示它们由许多紧密聚集在该空间中的ecDNA分子组成。进一步实验发现，ecDNA的聚集可以发生在具有不同癌基因扩增的各种癌症类型和原发性肿瘤中。随后，研究人员通过联合DNA和新生RNA FISH，在PC3和COLO320-DM细胞系中观察MYC等位基因的活跃转录，并计算每个ecDNA分子的MYC转录概率。结果显示，大多数新生的MYC mRNA转录本来自ecDNA“中心”，而不是来自染色体位点。ecDNA“中心”上致癌基因的转录活性明显高于染色体位点，表明当同一细胞中有更多的ecDNA拷贝时，每个ecDNA分子转录癌基因的可能性更大，尤其是以ecDNA“中心”的形式。人类染色体8q24上的MYC癌基因是癌症中体细胞DNA重排的热点，在人类癌症中近30%的MYC扩增以ecDNA的形式存在，通常包含MYC和PVT1（浆细胞瘤变体转录本1，位于MYC 3’端55kb处，是人类癌症的常发断点）的5’端部分。MYC的两侧是超级增强子，以赖氨酸27处的组蛋白H3乙酰化（H3K27ac）和BET蛋白（如BRD4）为标记，MYC转录对抑制剂JQ1置换BET蛋白高度敏感。为了检测活细胞中的MYC ecDNA，研究人员在COLO320-DM细胞中的MYC ecDNA中插入Tet-operator (TetO)阵列，并用TetR-eGFP或TetR-eGFP（A206K）标记ecDNA，以最小化GFP二聚化。实验结果显示，JQ1能有效降低COLO320-DM细胞（含MYC ecDNA）中MYC mRNA的水平，但对COLO320-HSR细胞（染色体MYC扩增子或均匀染色区）中MYC mRNA的水平没有显著影响（注：这两种细胞来自同一患者肿瘤，除了MYC扩增的背景外，具有高度相似的遗传背景）。此外，TetO-GFP COLO320-DM细胞的活细胞成像显示ecDNA“中心”在有丝分裂期间分解成更小的颗粒，之后又重新形成大的“中心”。值得注意的是，有丝分裂后的ecDNA“中心”的组装会被JQ1阻断。这些结果表明，COLO320-DM细胞中ecDNA“中心”的形成、维持和癌基因转录对BET蛋白的溴域H3K27ac相互作用具有独特的依赖性。为了将ecDNA结构与MYC转录调控联系起来，研究人员使用五种正交方法重建了COLO320-DM ecDNA，报告了迄今为止组装的最大的ecDNA结构——一个4.328 Mb的ecDNA，包含PVT1-MYC融合、标准MYC序列和来自多个染色体起源的序列（染色体6、8、13和16）的多个拷贝，并且利用DNA FISH验证了PLUT、PCAT1和MYC基因在重建预测的ecDNA上的共定位。接下来，研究人员确定了与癌基因高表达相关的ecDNA调控元件。来自72,049个COLO320-DM和COLO320-HSR细胞的配对单细胞ATAC–seq和RNA-seq确定了47个与高MYC表达相关的ecDNA调控元件，而目前驱动ecDNA上MYC癌基因表达的PVT1启动子（PVT1p），在ecDNA“中心”内接受了广泛的组合增强子输入。进一步地实验表明，分子间增强子-启动子在ecDNA“中心”激活，同时研究人员证实PVT1p作为一种DNA元件，能够反式激活ecDNA“中心”。那么分子间增强子-基因的相互作用是否可以被精确定位和干扰呢？以SNU16细胞系（它包含两种不同的ecDNA类型：一种来自8号和11号染色体的MYC扩增子和一种来自10号染色体的FGFR2扩增子）为研究对象，实验结果表明FGFR2和MYC ecDNA是共同选择的，因此这两个扩增子上的增强子可协同激活MYC表达。然后，MYC蛋白又可以反过来激活FGFR2的表达。顺式和反式调控元件之间几乎没有重叠，这也证实分子间增强子元件是直接通过反式而非下游效应修改基因表达。而进一步评估独立癌症类型中的分子间ecDNA的相互作用显示ecDNA“中心”内的分子间增强子基因激活发生在不同的癌基因位点和多种癌症类型中。综上所述，ecDNA“中心”内ecDNA的局部聚集促进了新的分子间增强子-基因相互作用和癌基因过度表达（图1）。与偏向局部顺式调控元件并跨越100-300nm的染色体转录中心不同，ecDNA“中心”可以跨越1000 nm以上，且涉及位于不同ecDNA分子上的反式调控元件。毫无疑问，这一发现对于ecDNA如何进行选择以及ecDNA上癌基因调控的重组如何促进转录具有深远的意义。同时，对于ecDNA“中心”促进癌基因转录的认识为癌症治疗提供新的潜在机会。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04116-8