脑啡肽

吗啡(Morphine)，属于阿片类生物碱，为阿片受体激动剂。鸦片的主要成分之一，含6%-15%，1806年由斯图奈尔首次从鸦片中分离得到。无色柱状结晶，溶于热水、乙醇、乙醚、氯仿；难溶于氨、苯；易溶于碱水或酸水。通过模拟内源性抗痛物质脑啡肽的作用，激动中枢神经阿片受体而产生强大的镇痛作用，是人类最早使用的一种镇痛剂，也具有强麻醉、止咳、镇吐、缩瞳等作用。但它也可抑制呼吸中枢，降低呼吸中枢对二氧化碳的敏感性，对呼吸中枢抑制程度为剂量依赖性，过大剂量可导致呼吸衰竭。月旭科技根据中国药典2020版开发出了WelchromMOPD C18 小柱，适用于复方甘草口服溶液、复方甘草片中吗啡含量测定的前处理方法，同时利用液相色谱法做了全面的验证，在标准条件下，均能满足检测要求。 # 概述 # 月旭科技开发出的WelchromMOPD C18小柱，采用固相萃取技术，选出最jia萃取条件，极大的简化了样品前处理步骤，获得了良好的测定结果。 # 贮存条件及保质期 # 常温保存，在此条件下有效期为3年。 # 提取步骤 # 取复方甘草口服液0.5mL于10mL小烧杯中，加适量氨水溶液至pH约为9，待净化。 # 前处理过柱步骤 # SPE小柱：Welchrom MOPDC18，200mg/3mL；活化：依次用甲醇-水（3:1）15mL和5mL水活化固相萃取柱，再加入3mL pH=9的氨水溶液冲洗至流出液pH为9；上样：全部上样，用少量pH=9的氨水溶液洗涤小烧杯，流出液弃去；淋洗：用20mL纯水冲洗固相萃取小柱，流出液弃去；洗脱：5%醋酸溶液洗脱小柱，并用5mL容量瓶收集洗脱液并定容至刻度。注：样品溶液过柱时，重力流下或稍微抽真空条件下使其流速约为1滴/秒。 # 色谱条件 # 色谱柱：月旭UltimateXB-C8, 4.6×150 mm，5µm。流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾: 0.0025mol/L庚烷磺酸钠:乙腈=18:18:5；流速：1.0mL/min；进样量：20μL；柱温：30ºC；检测波长：220nm。 # 色谱图及实际样品测试结果 #

近年来,蛋白质组学技术在肽和蛋白质类新型治疗药物的蓬勃发展以及临床新型大分子生物标志物的深入发掘中被日益广泛应用。应用方式的迭代对生物大分子的分析技术提出了更高的要求。基于蛋白质特征肽段检测的自下而上的蛋白质组学技术(bottom up proteomics)是现有研究中具有较高灵敏度与分辨率的蛋白质定性定量方法。开发多肽的生物分析方法是极具挑战的,除了所需的低检出限外,多肽的非特异性吸附性质,使其极易在接触到的材料表面发生吸附,进而导致分析全流程中待测物的丢失或干扰,给定性和定量分析引入巨大风险。例如在蛋白组学研究的质谱数据库搜索中,即使系统中微量肽段的损失或残留亦可能导致假阳性或假阴性结果。而在高灵敏度的多肽定量方法的开发中,肽段的非特异吸附对定量分析的线性、准确度和精密度均有负面影响。低浓度肽段溶液的吸附性质会更加明显,表现形式为标准曲线的非线性,最终导致定量限的不必要升高以及方法的重复性差。已有一些研究在分子水平上解释这种吸附行为,然而目前对其潜在的机制和相互作用仍然知之甚少。Eeltink等基于分子动力学模拟,提出了一种三相分子机制解释肽段从溶液吸附到强相互作用不带电固定相上的原理。Kristensen等研究了样品容器对阳离子多肽吸附的影响,当1 μmoL/L肽溶液在硼硅酸盐或聚丙烯瓶中存储1 h后,肽段的回收率仅有10%~20%。也有研究通过在溶剂中添加有机试剂、酸/碱性溶液、表面活性剂、吸附竞争剂或调整流动相组成等方法减少这类吸附。这些研究论文大多对一组特定的多肽和/或表面材料进行研究,但均未给出可用来预测多肽吸附特性的规律,也未给出通用的解决吸附的方法。本研究选择牛血清白蛋白(BSA)作为模型蛋白质,以其酶解后的肽段作为包含亲水性和疏水性多肽的“典型”多肽组样本。首先通过超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)的测定,分析常见多肽理化参数与上述多肽组的非特异吸附程度的关联性。然后基于超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QQQ-MS/MS)建立对强吸附肽段吸附程度的评估方法,从样品制备至分析测定建立全过程试验设计,考察不同材质的制备、储存耗材对肽段吸附的影响,以及考察不同色谱条件对肽段残留的影响,最终提出多肽全流程分析中减少非特异性吸附的通用型策略。01样品制备方法取10 mg BSA溶于10 mL水中,制得1 mg/mL蛋白储备液,进一步以水稀释为100 μg/mL的工作液。取200 μL上述工作液于蛋白质低吸附离心管中 加入65 μL 500 mmol/L碳酸氢铵和60 μL 50 mmol/L二硫苏糖醇,于60 ℃水浴加热60 min对蛋白质进行还原 放冷至室温后加入120 μL 50 mmol/L碘代乙酰胺,于暗处反应30 min进行烷基化 加入100 μg/mL的胰蛋白酶5 μL,于37 ℃水浴中酶解8 h,加入甲酸20 μL终止反应,12000 g离心15 min后,取200 μL上清置于蛋白质低吸附的进样瓶中作为混合肽段溶液待测。02超高效液相色谱-高分辨质谱方法参数色谱条件:色谱柱采用Waters Acquity Premier Peptide CSH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) 柱温为40 ℃ 流速为0.25 mL/min 流动相A、B两相分别为0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。洗脱梯度为0~1 min, 1%B 1~13 min, 1%B~40%B 13~13.1 min, 40%B~90%B 13.1~16 min, 90%B 16~16.1 min, 90%B~1%B 16.1~20 min, 1%B。进样器温度10 ℃ 进样量5 μL。质谱条件:毛细管电压3 kV,锥孔电压30 V,离子源温度120 ℃,脱溶剂气温度450 ℃,锥孔气流速25 L/h,脱溶剂气流速800 L/h。电喷雾电离(ESI)源、正离子模式下测定,MSE模式采集,扫描范围m/z 50~2000 数据采集时使用亮氨酸脑啡肽校正液进行实时质量校正,以保证采集质量数的准确性与重复性。采集后的数据使用Unifi软件处理。03相对残留量的测定和肽段分级策略将上述混合肽段溶液经上述条件采集、Unifi软件分析后,可得BSA酶解后肽段组的实际肽段组成和每个肽段的响应值Area(供试品溶液)。在进样上述供试品溶液后连续进样3针空白溶剂,以3针空白溶剂中检测到的对应肽段响应之和Area(Blank 1+Blank 2+Blank 3)计为该肽段的残留总量,该肽段的相对残留量为肽段的残留总量与肽段响应值的比值。基于肽段的响应与相对残留量,可将BSA酶解后的肽段组分为如下四类:Class Ⅰ,响应高且无残留的肽段 Class Ⅱ,响应高但有残留的肽段 Class Ⅲ、Class Ⅳ分别为响应低,无吸附和有吸附的肽段。响应的高低以是否大于中位数计,有无残留以Area(Blank 1+Blank 2+Blank 3)是否有检出判断。04超高效液相色谱-三重四极杆质谱方法参数色谱条件:色谱柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C8(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) 柱温30 ℃ 流速0.4 mL/min 流动相A、B两相分别为0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液。洗脱梯度为0~2 min, 2%B 2~5 min, 2%B~60%B 5~5.1 min, 60%B~90%B 5.1~8 min, 90%B 8~8.1 min, 90%B~2%B 8.1~11 min, 2%B。进样器温度10 ℃ 进样量5 μL。洗针液为90%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)。质谱条件:离子化电压5500 V 气帘气压力0.14 MPa 离子源温度500 ℃ 喷雾气、辅助加热气压力0.38 MPa。ESI源正离子模式下测定,多反应监测(MRM)模式采集,12条Class Ⅱ类肽段的离子对、碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)值经Skyline软件协助优化后结果如原文表1所示。文章信息色谱, 2022, 40(7): 616-624 DOI: 10.3724/SP.J.1123.2021.12012张莹1,2, 杨静1,2, 马跃新1,2, 曹玲2*, 黄青2*1.南京中医药大学药学院, 江苏 南京 2100232.江苏省食品药品监督检验研究院, 国家药品监督管理局化学药杂质谱研究重点实验室, 江苏 南京 210019

黄发金箍，腰围虎皮，手举金箍棒一根，足踏云鞋皆相称。各位天命人这两天的游戏体验如何呀？西天取经路漫漫，多亏有大圣的守护，唐僧一行才能渡过九九八十一难，修成正果。但你知道吗，我们的身边也有这样一位“悟空”，用一双金睛火眼，让PFAS无处遁形，默默守护我们的健康。PFAS全称“全氟烷基和多氟烷基化合物”。过去几十年来，人们在纺织、表面活性剂、食品包装、不粘涂层、灭火泡沫等产业中大量使用PFAS致使它的足迹遍布全球每一个角落。随着PFAS种类和数量的不断增加，使用传统靶向方法监测PFAS的工作愈发困难。为此，沃特世开发了一种将ACQUITY Premier与Xevo MRT质谱仪联用的方法对样品进行分析，让PFAS无处遁形。结论● 一步到位：使用waters_connectTM中的UNIFITM应用程序，实现非靶向筛查、发现和定量分析的一体化软件解决方案。● 功能多样：UNIFI筛查和发现工作流程可提供丰富的选项，包括从质量数亏损过滤、PFAS同系物的质量数保留时间过滤到在线数据库和谱库搜索。● 精确可靠：台式Xevo MRT质谱仪分析显示，在m/z 556.2765（亮氨酸脑啡肽）处具有 300 ppb的准确度以及 75K的高质量分辨率。● 操作简便：采用直接进样法进行PFAS鉴定和定量分析，有助于突破使用SPE进行样品前处理的局限性，以及使用传统靶向方法鉴定时对市售标准品的需求。若需提高灵敏度，还可以选择增加进样体积。● 数据合规：生成的数据集可用于靶向定量方法，并且可以针对使用不同数据库来源的鉴定和发现工作流程进行回顾性挖掘。方法通过联用ACQUITY Premier与Xevo MRT质谱仪采集，waters_connect进行处理。LC系统：◎ 色谱：经PFAS解决方案安装套件（P/N：176004548）改进的Waters ACQUITY Premier超高效液相色谱◎ 色谱柱：ACQUITY Premier BEH C18, 1.7 µ m, 2.1 × 100 mm, 90 &angst （P/N：186009453）◎ 样品瓶：聚丙烯自动进样器小瓶，带聚乙烯瓶盖（P/N：186005230）◎ 色谱梯度：表 1. 流动相A：95:5水:甲醇（含2 mM醋酸铵）；流动相B：100%甲醇（含2 mM醋酸铵）MS系统：使用Xevo MRT 质谱仪：图示1.台式多反射飞行时间质谱仪示意图。PFAS分析中，仪器在负离子模式下运行，m/z范围为50-1200 Da，使用MSE采集数据。工作流程：图示2. 饮用水装于15 mL试管中，并分别用两个不同校准浓度的PFAS标准品重复加标，然后，联用ACQUITY Premier液相色谱系统与Xevo MRT，进行校准标准品和样品的分析。使用waters_connect软件平台和UNIFI应用程序进行数据采集和处理。仪器参数：实验结果一步到位：图1：数据处理（图1 A）和数据过滤（图1 B）。数据处理包括峰提取、同位素和加合物聚类以及保留时间校准。数据过滤功能对应一组参数，用于显示符合用户定义标准的组分列表。例如，用于查看满足以下条件的组分的过滤器：在3-5 min之间洗脱、m/z大于500 Da且处于针对PFAS定义的质量数亏损范围内。直观可靠：运用Waters PFAS谱库鉴定PFAS：使用准确质量数( 500 ppb)、保留时间和碎片离子方法进行化合物鉴定。图2：2,000 ng/L混标中的全氟辛烷磺酸(PFOS)标识为 [M+H]+，质量数测量精度 36 ppb。图2A：PFOS（直链和支链）的提取离子流图(XIC)。图2B：低碰撞能量和高碰撞能量下直链PFOS的质谱图（分别为上图和下图）。精确定量：通过直接进样法鉴定并定量了加标饮用水中的PFOS，质量数测量精度为107 ppb。图3：A：20 ng/L混标中的全氟辛烷磺酸(PFOS)提取离子流图(XIC)，B：加标饮用水中PFOS的XIC。在加标饮用水中鉴定出m/z 498.9303的PFOS，质量数测量精度为 ± 100 ppb，信噪比为 ± 17。信噪比采用峰到峰法计算。C：低碰撞能量下离子响应的校准曲线。线性回归拟合采用1/X加权，相关系数为R2 = 0.99327。20 ng/L至5,000 ng/L范围内的PFOS响应呈线性。后记Xevo MRT 质谱仪可以实现： ① 以更高分辨率和灵敏度采集数据，不受采集速率影响，确保您能够分离复杂基质中的分析物② 在生物相关浓度下以高水平的质量精度实现深入探索③ 借助市场前沿的色谱柱填料、分离和创新的相关信息学技术，结合灵活的台式平台中的各种高端技术，缩短获得结果的时间④ 凭借出色的系统重现性和耐用性，提供高质量的实验结果并解决棘手难题⑤ 无论您是需要监测生产过程中引入的PFAS污染，还是检测产品、环境中的PFAS含量，Xevo MRT质谱仪都能满足您的需求。