加合物

LC-MS 实验室超纯水的处理建议和方法 [摘要]：本文用实验案例说明了实验室环境和纯水的储存对纯水质量的影响，对比 LC-MS 级别超纯水以及瓶装水，阐释了在 LC-MS 实验室应用中 Milli-Q 超纯水的优势。 实验室环境和纯水的储存避免长期储存纯水，并且避免纯水暴露在实验室环境当中。实验室环境中含有多种污染物（有机物质，碱金属，细菌，塑料等），因此纯水暴露在实验室环境中或者使用纯水过程中有多种转移步骤都会导致水质下降。实践证明，长期储存纯水会增加纯水与实验室环境的接触。这一结果会导致高 MS 背景噪音（图 1），金属加合物的产生和信号的抑制（图 2）。图1.超纯水储存和暴露在空气中与新鲜制备的纯水的效果对比上图：某品牌LC-MS级别纯水储存4周，并反复开盖数次。下图：Milli-Q超纯水检测方法：MS：Bruker Esquire 3000+离子阱流速：0.2mL/min温度：25°C进样方式：MS直接进样图 2 钠离子的存在增加了加合物的形成并对信号产生抑制作用 分析方法：样品：500pmol的Glu-Fibrionopeptide溶解于50/50乙腈/水（混合了不同浓度的氯化钠） 分析仪器：Waters Synapt HDMS进样模式：正ESI模式直接质谱进样技术影响• MS产生背景噪音• 质谱图谱变得更复杂• 形成加合物峰• 信号抑制• 灵敏度简单• 增加LOD （Ⅱ）存储容器材质避免塑料储存容器 操作及储存纯水过程中避免使用塑料容器，如塑料瓶或锥形瓶等。塑料容器比较容易引入一些普遍存在的添加剂（抗静电剂，稳定剂和塑化剂），这些都会导致鬼峰，并提高背景噪音（图 3）。建议使用表面特殊处理的棕色玻璃瓶或硼玻璃。标准玻璃瓶中，硅和碱金属的释放会形成加合物（请参考图 2 中钠离子的影响）。图3. 使用聚丙烯瓶储存超纯水上图：棕色玻璃瓶和塑料瓶中储存的超纯水MS谱图下图：棕色玻璃瓶和塑料瓶中储存的超纯水TIC谱图仪器及分析方法：Bruker Esquire 3000+离子阱 ESI+模式，直接进样分析技术影响• LC-MS分析中会出现鬼峰，并对信号产生抑制作用• 灵敏度降低，LOD值增加• 增加背景噪音• 质谱变得更加复杂 （Ⅲ）玻璃器皿的清洗避免使用洗瓶机洗瓶机操作时需要用大量的洗涤剂，其中含有很强的碱和表面活性剂。碱会使碱金属和硅从玻璃中溶解出来，而硅则会附着在玻璃表面。图4. 洗瓶机清洗后的质谱玻璃器皿对质谱的影响：Milli-Q制备的超纯水分别储存在两种不同品牌洗瓶机和LC-MS级别水/乙腈清洗后的玻璃瓶中后的MS谱图及TIC谱图进样方式：直接进MS样，ESI+模式技术影响• LC-MS分析中会出现鬼峰• 灵敏度降低，LOD值增加• 增加背景噪音• 质谱变得更加复杂• 形成加合物 （Ⅳ）纯水系统的使用超纯水使用前弃去前段水滞留在纯水系统中的水会随着时间的推移质量下降。存在在试验室环境中的污染物也会被中端精制器上的滤膜富集在表面，再收集纯水的过程中会使水质污染。因此，在收集纯水之前建议有冲洗纯水系统的过程，例如，周末过后弃掉开始的几升水，每天在收集纯水前弃掉 250-500mL 水。图5A. 长时间未使用（比如，周末），并且没有冲洗流程的超纯水系统收集的超纯水的MS谱图。上述质谱使用的超纯水是经过周末后从超纯水系统中产出的超纯水图5B.冲洗流程的超纯水系统收集的超纯水的MS谱图上述质谱使用的超纯水是超纯水系统使用过一段时间后新鲜制备的图 5C.对比不同时间点 Milli-Q® 超纯水 TIC 谱图对比。上述分析方法：MS：Bruker Esquire 3000+ ion trap MS system,进样模式：ESI+, 直接 MS 进样流速：0.2 mL/min温度：25°C.技术影响• MS背景噪音• MS图谱变得复杂• 信号抑制• 灵敏度降低• LOD 增加 结论：Milli-Q 超纯水系统正确的安装和维护能够满足 LC-MS 实验用水的需求；新鲜的超纯水比储存的超纯水或暴露在空气中的超纯水能得到更好的实验结果。超纯水应使用玻璃容器承装， 并且玻璃容器不能用洗瓶机洗涤。

中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室汪海林课题组在DNA损伤研究方面取得了一系列重要进展。 　　DNA损伤是诱发基因突变、癌症发生和发育畸形的关键因素。由于缺少快速、高通量、广谱的筛选与鉴定手段，数目众多的化学品缺乏DNA损伤的毒性数据。研究人员利用敲除特定抗氧化基因的大肠杆菌增强对DNA损伤的敏感性，发展出一种广谱的细菌传感器，可快速、灵敏地筛选与鉴定过去难以检测的DNA损伤试剂如丙烯醛、卤代苯醌等，显著地拓展了检测范围。该项工作发表在美国化学会期刊Anal. Chem.上(2011, DOI/10.1021/ac200426x)。 　　近年来，他们发展了一种新颖的DNA缠绕分析方法，在此基础上，进一步揭示了修复酶可识别多种化学结构不同的损伤的机制，从而在DNA修复机制方面取得重要突破，有助于发展有效的癌症预防和治疗措施。该项成果发表在国际著名的综合性期刊Proc. Natl. Acad. Sci. USA( 2009, 106,12849)上。 　　在DNA加合物分析方面，他们发展的苯并(a)芘加合物分析新方法检测灵敏度可达6.6 × 10-21mol，比经典的32P放射性后标记方法提高了5400倍(Anal. Chem., 2009, 81, 10285)。这一方法的发展有望解决长期缺乏测定人体痕量加合物的高灵敏分析技术的难题。另外，研究人员还发展了新颖的DNA甲基化分析(Anal. Chem. 2009, 81, 7885)、金属调节-核酸电泳分离分析(Anal. Chem., 2010, 82, 487)以及荧光粒子计数免疫法(Anal. Chem., 2010, 82, 9901)。 　　这些前沿性的工作是在他们独立研制的先进的毛细管电泳-激光诱导荧光偏振检测装置上开展的。现已形成一个较为系统的DNA修饰评价体系，预期在环境与健康、癌症诊断与治疗等领域具有重要的研究和实际应用价值。 　　这一系列工作得到国家自然科学基金、中科院“百人计划”择优项目、中科院重大装备研制项目及环境化学与生态毒理学国家重点实验室基金等的支持。 　　图1 独立研制的毛细管电泳-激光诱导荧光偏振检测装置 　　图2 DNA缠绕-局部解链模型

近期，Analytical Chemistry杂志上发表的一篇文章提出了一项创新性的用于抗体药物电荷异质性表征的分析技术——icIEF-MS。icIEF-MS联用技术平台与传统的SCX-MS对蛋白异质性进行交叉验证，而且更高的灵敏度、更出色的重复性和更低的样品残留，这将为蛋白药物电荷异质性表征提供一种新的策略。 原文见：Anal. Chem. 2023, 95, 4, 2548–2560 蛋白质的电荷异质性是由多种复杂机制所共同作用形成，包括细胞过程、化学降解和制造过程中的生产条件。这些因素中的许多修饰会引起蛋白质等电点 (pI) 值的变化，例如翻译后修饰（PTMs) 的发生，包括 c 端赖氨酸缺失、焦谷氨酸形成、脱酰胺化、唾液酸化和糖基化等，都会导致电荷变异体的形成，从而对药物的稳定性和溶解度产生重要影响。因此，对电荷异质性的可靠表征是评估关键质量属性 (CQA) 的重要步骤，也是确保治疗性mAbs在整个临床和商业开发期间保持一致质量的关键所在。 目前，全柱成像毛细管等电聚焦 (icIEF) 和离子交换色谱 (IEX) 是治疗性mAbs在研发和质量控制中进行电荷异质性分析的两种常用技术。然而，传统的cIEF-MS联用技术在研究蛋白质电荷变异体方面还存在着许多缺陷，如重复性差、操作复杂以及与MS离子源不兼容等问题。 CEInfinite icIEF分析兼制备型全柱成像毛细管电泳系统 基于一体化的icIEF-MS技术平台，使用加拿大品牌艾易尔斯生物科技（AES）开发的分析与制备一体的CEInfinte系统，可实现快速的icIEF分离，并配合使用高分辨率的Thermo Q-Exactive Plus质谱平台对蛋白质的电荷变异体进行鉴定。icIEF分离部分采用了与MS兼容的两性电解质，无需使用甲基纤维素和尿素作为添加的的涂层毛细管柱。通过创新的纳流ESI接口，检测蛋白质药物电荷变异的灵敏度和重复性得到了极大提高，整个icIEF-HRMS分析可在25分钟内完成，比传统cIEF-MS所需的60分钟更加迅速。此外，该平台还可以灵活切换到icIEF馏分收集模式，对蛋白质的电荷变异体组分进行组分收集，并进行深入表征，包括LC-MS肽图分析、IEX-MS 完整蛋白分析、生物相互作用等研究。整合icIEF-MS和基于icIEF的馏分收集将在mAb电荷异质性表征的全新MS策略。图1 icIEF-MS的原理图 利用该icIEF-MS系统对9种不同的治疗性mAb的电荷变异体进行表征，并对icIEF-MS的方法进行了系统验证。同时，我们还使用SCX-MS分析了所研究mAb的电荷异质性。两种手段的分析结果表明，icIEF在分离分辨率、灵敏度、低残留效应和精确分子量测量精度等方面都具有明显优势。我们相信，结合传统的IEC-MS技术平，台icIEF-MS将成为电荷异质性表征领域中的一项重要技术，为研究人员提供更加快速、准确、灵敏和高效的分析手段。 表1 九种单抗的等电点信息和使用的icIEF试剂● icIEF和SCX分离9种单克隆抗体的性能比较 ●在最优化条件下，通过icIEF-UV和SCX-UV分别分离了9种单克隆抗体，并进行了性能比较。两种分离工具均在10分钟内完成了高通量分离，所研究的单克隆抗体获得了相同的峰序列。在icIEF分离中，首先洗脱的是酸性最强的异质体，其次是主峰和碱性异质体，这与SCX分离的顺序相同。然而，对于大多数异质性mAb混合物，icIEF的分离效率显著高于SCX，这是因为iCIEF基于pI差异进行分离，微小pI差异的蛋白质异质体就可以得到高分离度的分离。在某些情况下，如英夫利西单抗，通过icIEF可以实现4种电荷变异体和一个主成分的基线分离，但使用SCX的分离效率却不佳。类似地，对于帕博利珠单抗、阿替利珠单抗和地诺单抗，使用icIEF可以很好地检测出所有电荷变异体；然而，在使用SCX时，一些电荷变体却丢失了。尽管icIEF由于不同的分离机制而比SCX具有更宽的峰宽，但由于其pI的微小差异，icIEF表现出了更好的分离性能。图2 九种mAb的icIEF-UV图谱和SCX-UV谱图● icIEF和SCX串联MS的比较 ●如图3所示，icIEF-S和SCX-MS都可以用于鉴定阿替利珠单抗的电荷变异体。在SCX分离中，MS检测到的酸碱峰顺序与UV一致。而在icIEF分离中，碱性峰首先被纳流泵推向ESI源，因此MS检测中的酸碱峰顺序与UV检测的顺序相反。另一个显著的区别是，由于SCX-MS使用更高的流速，从UV到MS检测，柱外的峰展宽程度都较轻，这意味着UV峰形状与MS峰形状更一致。相比之下，icIEF-MS的较低迁移流速意味着柱外效应对icIEF分离的影响更大，从UV检测到MS检测，峰呈现更为明显的展宽，尤其是主峰，强度更高，并与稍低pI的酸性峰部分重叠。为了进一步提高icIEF-MS的分离度以克服峰展宽造成的分辨率损失，可以使用窄pH的两性电解质、新型的涂层分离毛细管柱和纳流ESI源。图3 以阿替利珠单抗为研究对象，比较icIEF-MS 和 SCX-MS分离效果：UV谱图(左)和MS-TIC谱图(右)。 在分析单克隆抗体时，icIEF-MS的信号响应比SCX-MS高。虽然icIEF-MS的样品载量只有SCX-MS的十分之一，但如图3所示。icIEF-QE Plus MS的TIC强度与SCX-Orbitrap Exploris 240相同（Orbitrap Exploris 240比QE Plus MS具有更高的检测灵敏度）。icIEF-MS比SCX-MS灵敏度高的原因有两个：首先，icIEF-MS的纳流流速（小于5μL/min）远低于SCX-MS的流速（300 μL/min），这导致icIEF-MS的去溶剂化效率和离子化效率较高，从而极大的提高了MS灵敏度和动态范围，即使样品量低至1 ng。此外，在icIEF-MS中，补偿液采用含0.5% FA的50%乙腈，流速为5 μL/min，纳流泵速为50-100 nL/min。在此比例下，进入MS的最终流动相处于酸性条件，而文章中用于SCX-MS的洗脱流动相的pH接近mAb的pI点 (pH 7~10)，洗脱是在中性碱性条件下进行的，而在中性/碱性条件下，蛋白质与质子结合的能力比酸性条件下弱得多。因此，与SCX-MS相比，icIEF-MS在较低的电荷状态下具有更多的电荷数量，从而增加了电离和质谱效率。 总之，icIEF和SCX是两种有效的单克隆抗体分离工具，在高通量条件下分离效率都很高。然而，在icIEF-MS中，由于低迁移流速和酸性流动相的使用，其灵敏度比SCX-MS更高。这些结果表明，icIEF-MS是一种具有优越性能的单克隆抗体分离和表征方法，可以应用于生物制药的研究发现和质量控制。(A)(D) 图4 阿替利珠单抗的高灵敏度icIEF-MS表征分析:不同浓度(0.0 5 ~ 2 mg/mL ) 阿替利珠单抗(A) 的UV谱图，TIC (B) 和 MS(C )谱均为0.05 mg/mL；电荷变异体的浓度与MS响应强度的关系如图(D)所示。 图4展示了icIEF-QE Plus MS 在不同浓度阿替利珠单抗的结果，见图4。从酸性变异体和碱性变异体的 TIC和MS谱图得出，即使在 0.05 mg/ mL的最低浓度 (3倍S/N的UV信号)下，MS仍然检测到所有电荷变异体的明显信号。而SCX-QE Plus MS不能达到0.05 mg/ml的检出限。而在已报道的传统cIEF-MS研究中，典型的蛋白质分析浓度为 0.1~ 2 mg/mL。● icIEF-MS和SCX-MS的质量准确度比较 ●icIEF-MS 不仅在灵敏度上表现更优，而且在质量准确度方面也优于 SCX-MS。质量准确度是 MS 检测的一个关键指标，这取决于 MS 的分辨率。可达到的质量分辨率不仅取决于仪器的质量分辨率极限，还受电离过程的影响。加合物会使离子信号变宽，因为它们不仅来自于多重质子化的分析物，还来自于携带加合物的分析物。因此，更多的加合物会导致较差的分辨率和较大的质量误差（即较差的精度）。虽然源内碰撞诱导裂解（CID）可以减少加合物的形成，但并不是所有加合物都可以被去除。如表2所示，尽管使用了110 V 的源内CID值，但SCX-MS 获得的质谱峰仍然比 icIEF-MS 获得的质谱峰宽，导致SCX-MS 主成分的 MW 偏差（5.4 ppm）大于 icIEF-MS（2.7 ppm）。另一个例子是贝伐珠单抗，在没有脱盐预处理的情况下，SCX-MS 对贝伐珠单抗的 MW 偏差高达33.9 ppm。脱盐后进行分析，贝伐珠单抗的偏差降低到12.8 ppm。而 icIEF-MS，由于加合离子形成较少，即使不脱盐，获得的贝伐珠单抗的偏差也仅为9.6 ppm。表2 阿替利珠单抗的电荷变异体的icIEF-MS和SCX-MS分析结果比较● icIEF-MS和SCX-MS的残留效应 ●相比 SCX-MS，icIEF-MS 的残留效应要小得多。在对阿替利珠单抗分析后，icEF-MS 使用含有4% HR 8.5&minus 9.5 两性电解质的水溶液作为空白样本，而 SCX-MS 使用水作为空白样本。在 icIEF-UV 检测中未观察到明显信号，而 SCX-UV 在阿替利珠单抗峰值处检测到了信号残留。SCX-TIC 和 icIEF-TIC 中有信号峰相对明显，保留时间分别为6.82和21.5 min，。从这两个信号峰提取的 MS 数据通过去卷积得出，SCX-TIC检测到的残余信号是阿替利珠单抗，而 icIEF-TIC 检测到的信号只是两性电解质，这意味着 icIEF-MS 中没有检测到残余分析信号。低残留率使得 icIEF-MS 对微量蛋白电荷变异体的检测更加准确和可靠，避免了假阳性结果。图5 icIEF-MS和SCX-MS的残留效应的比较：SCX-MS (A-C)显示残留阿替利珠单抗信号，而icIEF (D-F)没有残留分析物信号。如图4和图5所示，观察到1500~2500 m/z 的背景信号，MS信息证实它们不是蛋白质，而是来自两性电解质和溶剂背景，背景离子不干扰mAb电荷变异体的鉴定。 ● icIEF-MS鉴定蛋白质的可重复性 ● 针对阿替利珠单抗电荷变异体进行的重复性考察表明，icIEF-MS 平台对其测定表现出良好的重复性。通过 icIEF-MS 对批间蛋白质样品进行鉴定，所有批间检测到的相同电荷变异的质量偏差都很小（表3列出了所有9种mAb的电荷变异体的修饰鉴定结果。酸性变异体的表征比碱性变异体更具挑战性，因为酸性变异体具有更复杂的修饰。虽然这种酸性修饰通常可以通过 pI 来区分，但它们在分子质量上的差异相当小。icIEF在线串联高分辨率质谱可以通过结合完整的蛋白质分子量和测量的pI值来阐明蛋白质的结构信息，为解决酸性电荷变异体的难题提供一个有用的icIEF-MS联用平台。表3 九种单克隆抗体的电荷变异体的iCIEF-MS表征结果在对一系列不同的治疗性单克隆抗体进行电荷变异体表征时，icIEF-MS 和 SCX-MS 可以获得类似的结果。然而，icIEF-MS 在分离分辨率、灵敏度、低残留效应和 MW 测量准确度方面比 SCX-MS 展现出更多的优势。因此，将 icIEF-HRMS 分析与更常见的 SCX-MS 相结合，通过正交的验证，可以为分离和鉴别蛋白电荷变异体提供更加全面的分析策略。 如需进一步了解相关信息，可联系我们获取更多文献。艾易尔斯生物科技（AES）致力于全柱成像毛细管等电聚焦技术（icIEF）技术与质谱的联用、馏分制备以及高分辨分离等领域。