质谱结构分析

贾伟、陈熙 沃特世科技（上海）有限公司实验中心 氢氘交换质谱法是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。它在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用。随着氢氘交换质谱技术的不断发展，它正在成为结构生物学家及生物药物研发的重要手段。 氢氘交换质谱（HDX MS，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。其原理是将蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氢原子将于重水的氘原子发生交换，而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构信息[1]。这个过程就像将握着的拳头浸入水中，然后提出水面并张开手掌。这时，湿润的手背表明它在&ldquo 拳头&rdquo 的结构中处于外表面，而较为干燥的手心表明它是&ldquo 拳头&rdquo 的内部。除样品制备外，氢氘交换质谱法的主要过程包括：交换反应、终止反应、将蛋白快速酶切为多肽、液相分离、质谱检测、数据解析。其中交换步骤需要在多个反应时长下进行，如0s、10s、1min、10min、60min等，以绘制交换率曲线，得到准确全面的信息。氢氘交换质谱技术在蛋白质结构及其动态变化研究[1]、蛋白质相互作用位点发现[2]、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用[3]。 与经典的蛋白质结构研究方法相比，如X射线晶体衍射（X-Ray Crystallography）和核磁共振（NMR. Nuclear Magnetic Resonance）等方法，氢氘交换质谱不能够提供精确的蛋白空间结构，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白质空间结构的表面位置（包括动态变化中的）、可能的活性位点和蛋白-蛋白相互作用位点等。但是氢氘交换质谱技术有着其他经典方法不具备的优点：首先，可以进行蛋白质结构动态变化的研究是氢氘交换质谱的一个突出优点，包括变化中的活性位点及表位；其次，氢氘交换质谱在蛋白复合体构象的研究中也具有独到的优势；此外，氢氘交换质谱还具有对样品需求量小、纯度要求相对较低、研究对象为溶液环境下的蛋白质的天然构象而非晶体中构象等优势[1,4,5]。自1991年第一篇研究论文发表起，氢氘交换质谱技术不断发展，已经成为结构生物学及质谱技术中一个非常重要的应用领域[6]。但是氢氘交换质谱实验的复杂的实现过程在一定程度上影响了其应用的广泛度。主要的难点有：1、如何避免交换后氘代肽段的回交现象；2、实验控制的高精确性和重现性要求；3、交换后造成的叠加的质谱峰如何准确分辨；4、简易高效的分析软件需求；5、以氨基酸为单位的交换位点辨析。沃特世公司自2005年起，针对以上难点不断进行攻关，推出了目前唯一商业化的全自动氢氘交换质谱系统解决方案&mdash &mdash nanoACQUITY UPLC® HD-Exchange System(图1)。在全世界范围内，这套系统已经帮助科学家在包括Cell、Nature等顶级研究期刊中发表研究论文[7,8]。除科研需求外，沃特世氢氘交换质谱系统也受到众多国际领先制药公司的认可，并用于新药开发中蛋白药物活性位点及表位的研究工作中。 氢氘交换实验中的回交现象将严重影响实验数据的可信度，甚至导致错误结果的产生。要避免回交需要做到两点：尽量缩短液质分析时间和保证液质分析中的温度和pH为最低回交反应系数所要求的环境。沃特世UPLC® 系统采用亚二纳米色谱颗粒填料，较HPLC使用的大颗粒填料，UPLC具有无与伦比的分离度。因此UPLC可以做到在不损失色谱分离效果的要求下，极大缩短液相分析时间的要求[9]。对于对温度和pH控制问题，在多年的工程学改进中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已经实现了对酶切、液相分离等步骤的全程控制[10]。 对氢氘交换质谱实验精确性和重现性的要求是其应用的第二个主要难点。在实验中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多个时间点的数据。如果进行人工手动实验，很难做到对10S-10min等几个时间点的精确操作。再考虑到重复实验的需求，人工手动操作会对最终数据可信度产生影响。而且实验过程重复繁琐，将给实验人员带来非常大的工作压力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通过智能机械臂，精确完成交换、终止交换、进样、酶切等一系列实验过程，而且始终保证各个步骤所需不同的温度环境。这些自动化过程不但保证了实验数据的可靠性，提高了实验效率，也将科学家从繁琐的重复实验中解放出来。 氢氘交换实验的质谱数据中，随着交换时间的延长，发生了交换反应的多肽，由于质量变大，其质谱信号将逐渐向高质荷比方向移动。因此，这些质谱峰可能与哪些未发生交换反应的多肽质谱峰逐渐叠加、相互覆盖。相互叠加的质谱信号，不但影响对峰归属的判断，更会增加交换率数据的误差。因为交换率判断需要通过对发生交换的多肽进行定量，毫无疑问因叠加的而混乱的质谱数据将极大的影响对质谱峰的准确定量。这点对于单纯通过质荷比进行分析的质谱仪来说完全无能为力。但是，这个看似不可能完成的任务却被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。这是因为，不同于其它常见质谱，沃特世的SYNAPT® 质谱平台还具备根据离子大小及形态进行分离的功能（行波离子淌度分离）。在数据处理时，除多肽离子的质荷比信息外，还可以通过离子迁移时间（离子淌度维度参数）将不同离子区分。因此这种SYNPAT独有的被命名为HDMSE的质谱分析技术可以将因质荷比相同而重叠的多肽分离开，轻而易举地解决了质谱信号叠加的问题，得到准确的交换率数据[11,12]（图2）。SYNPAT质谱平台一经推出就夺得了2007年PITTCON金奖，目前已经推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型号，并具备ESI、MALDI等多种离子源。除氢氘交换技术外，SYNAPT质谱系统在蛋白质复合体结构研究中也是独具特色，已有多篇高质量应用文献发表[13,14,15]。 实现氢氘交换质谱技术的第四个关键点，是如何高效分析实验产生的多时间点及多次重复带来的大量数据。人工完成如此巨大的信息处理工作，将消耗科学家大量的时间。沃特世氢氘交换质谱解决方案所提供的DynamX软件可以为科学家提供简便直观的分析结果，并包含多种呈现方式。 在某些特殊研究中，要求对蛋白氢氘交换位点做到精确到氨基酸的测量，这是氢氘交换质谱研究的又一个难点。在常规的研究中采用CID（碰撞诱导解离）碎裂模式，可能导致氘原子在多肽内重排，而致使不能对发生交换的具体氨基酸进行精确定位。SYNPAT质谱提供的ETD（电子转移解离）碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混乱，并具有良好的碎裂信号[16]。 沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System为氢氘交换质谱实验提供了前所未有的简易的解决方案，强有力地推动了氢氘交换技术在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位以及活性位点鉴定方面的应用，正在成为众多结构生物学科学家和生物制药企业必不可少的工作平台。 参考文献 (1) John R. Engen, Analysis of Protein Conformation and Dynamics by Hydrogen/Deuterium Exchange MS. Anal. Chem. 2009,81, 7870&ndash 7875 (2) Engen et al. probing protein interactions using HD exchange ms in ms of protein interactions. Edited by Downard, John Wiley & Sons, Inc. 2007, 45-61 (3) Tiyanont K, Wales TE, Aste-Amezaga M, et al. Evidence for increased exposure of the Notch1 metalloproteasecleavage site upon conversion to an activated conformation. Structure. 2011, 19, 546-554 (4) Heck AJ. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 2008, 5, 927-933. (5) Esther van Duijn, Albert J.R. Heck. Mass spectrometric analysis of intact macromolecular chaperone complexes. Drug Discovery Today. Drug Discovery Today: Technologies Volume 3, 2006, 21-27 (6) Viswanat ham Katta, Brian T. C hait, Steven Ca r r. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1991, 5, 214&ndash 217 (7) Chakraborty K, Chatila M, Sinha J, et al. Chaperonin-catalyzed rescue of kinetically trapped states in protein folding. Cell. 2010 Jul 9 142(1):112-22. (8) Zhang J, Adriá n FJ, Jahnke W, et al. Targeting Bcr-Abl by combining allosteric with AT P-binding-site inhibitors. Nature. 2010,463, 501-506 (9) Wu Y, Engen JR, Hobbins WB. Ultra performance liquid chromatography (UPLC) further improves hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2006 , 17, 163-167 (10) Wales T E, Fadgen KE, Gerhardt GC, Engen JR. High-speed and high-resolution UPLC separation at zero degrees Celsius. Anal Chem. 2008, 80, 6815-6820 (11) Giles K, Pringle SD, Worthington KR, et al. Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 2004, 18, 2401-2414 (12) Olivova P, C hen W, C ha kra borty AB, Gebler JC. Determination of N-glycosylation sites and site heterogeneity in a monoclonal antibody by electrospray quadrupole ion-mobility time-offlight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2008, 22,29-40 (13) Ruotolo BT, Benesch JL, Sandercock AM, et al. Ion mobilitymass spectrometry analysis of large protein complexes. Nat Protoc.2008, 3, 1139-52. (14) Uetrecht C, Barbu IM, Shoemaker GK, et al. Interrogatingviral capsid assembly with ion mobility-mass spectrometry. Nat Chem.2011, 3,126-132 (15) Bleiholder C, Dupuis NF, Wyttenbac h T, Bowers MT. Ion mobility-mass spectrometry reveals a conformational conversion from random assembly to &beta -sheet in amyloid fibril formation. Nat Chem. 2011, 3, 172-177 (16) Kasper D. Rand, Steven D. Pringle, Michael Morris, John R., et al. ETD in a Traveling Wave Ion Guide at Tuned Z-Spray Ion Source Conditions Allows for Site-Specific Hydrogen/Deuterium Exchange Measurements. J Am Soc Mass Spectrom. 2011, in press

单克隆抗体(mAb)是制药行业增长最快的治疗方法之一，mAb的高阶结构(HOS)影响药物与靶标的结合特异性，从而影响治疗效果和副作用。若储存而导致HOS发生变化，例如蛋白质错误折叠和聚集，会导致稳定性降低、功效丧失或可能的免疫原性。因此，监测HOS对保证mAb疗法的有效性和安全性至关重要。X射线晶体学和核磁共振(NMR)光谱可以提供原子级分辨率，但存在费时费样品的缺点；生物物理技术，如差示扫描量热法(DSC)、动态光散射(DLS)、荧光光谱、红外(IR)光谱和圆二色(CD)光谱只能提供低分辨率的整体构象。焦碳酸二乙酯(DEPC)作为亲电子试剂能够修饰溶剂可接近的亲核侧链（Cys、His、Lys、Thr、Tyr、Ser）和蛋白质的N末端，这些残基产生的羧基化产物具有+72.021Da的质量转移，经过蛋白水解消化、液相色谱分离和串联质谱分析后，可以识别和半定量特定的蛋白质修饰位点。将一种条件（例如天然）与另一种条件（例如加热）进行比较时，特定残基处共价标记程度的变化可用于探测蛋白质的HOS变化（图1）。在这篇文章中，作者使用DEPC共价标记联用质谱，以利妥昔单抗作为单抗药物的模型，以期在远低于mAb治疗药物熔点的温度下能够特异性检测细微HOS变化，并通过活性测定进行验证。图1. DEPC 标记与质谱联用分析单抗药物结构的流程在通过共价标记研究热应力（heat stressed）利妥昔单抗之前，作者使用CD光谱、荧光光谱和动态光散射(DLS)来识别加热对蛋白质结构的干扰。发现当在低于其熔点的温度下加热利妥昔单抗4小时时，这三种技术在45°C或55°C时无法检测到显著的结构变化，而在65°C时仅显示出轻微的变化。随后作者团队使用DEPC CL-MS探测利妥昔单抗的细微结构变化。在45°C压力下的利妥昔单抗样品中发现DEPC标记水平的变化较少，大多数变化是由于蛋白质受热去折叠导致的标记增加（图2），且可变区的变化远少于恒定区。超过70%的标记变化发生在Tyr、Ser和Thr残基处，而发生在His和Lys残基处的标记变化始终小于20%。标记变化表明，45°C时的结构变化主要是局部微环境的变化，而非溶剂可及性差异显著的大结构变化，也就是说修饰位点分散在整个蛋白质结构中，而不是集中在蛋白质的某些区域。图2. 45°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。活性测定能反映一定程度的结构变化对利妥昔单抗活性的影响，从而验证DEPC标记结果。桥接ELISA的结果表明，在预热至45°C后，利妥昔单抗的Fc结合活性没有显著变化（图3a），Fc区域的CDC活性估计在45°C热应激后保持不变（图3b），利妥昔单抗的Fab结合活性估计与对照样品没有差异（图3c）。活性测定结果表明蛋白质在45°C时没有发生显著的结构变化。在Fab和Fc区域中标记变化的残基数量相对较少，主要标记对局部微环境变化更敏感的Tyr、Ser和Thr残基。修饰位点分散在整个蛋白质中，对Fab和Fc区域的构象几乎没有影响，与共价标记质谱联用的测定结果相吻合。图3.使用单抗活性测定验证CL-MS实验揭示的结构变化。Fc区的结构完整性通过(a)测量Fc与捕获抗体结合的利妥昔单抗桥接ELISA和(b)测量补体依赖性细胞毒性的Alamarblue测定来评估。Fab区域的结构完整性通过(c)Raji细胞下拉试验评估，测量Fab与B细胞CD20抗原的结合。55°C加热4h后利妥昔单抗所有结构域的残基修饰程度都发生了显著的变化，尤其是Fab区域的VH和VL结构域。（图4）加热至55°C时，His和Lys残基处发生的标记变化几乎是45°C的两倍，表明蛋白质在这些区域展开；Fab区域标记水平发生显著变化，特别是在VH、VL和CL域。这表明利妥昔单抗的Fab区域存在局部结构变化，据报道这也是IgG1分子中对热应激最敏感的区域。Fc区域中没有观察到类似的发生标记变化的残基聚集，Tyr、Ser和Thr处的大多数标记变化为中度或高度变化，这些结果表明蛋白质拓扑结构可能发生变化。图4. 55°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。尺寸排阻色谱(SEC)测量表明在65°C加热条件下存在高分子量物质。将DEPC CL-MS方法应用于65°C热应力的利妥昔单抗后，发现所有利妥昔单抗结构域的标记发生显著变化（图5），主要体现为标记的减少，这可能是因为蛋白质聚集。利妥昔单抗的Fab和Fc区均发现标记减少的残基簇，活性测定结果显示Fc结合和CDC活性的降低（图3），说明了Fc区特别是CH3结构域的标记变化，与DEPC标记结果一致。图5. 65°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。总结DEPC标记技术的结构分辨率和灵敏度足以探测细微的蛋白质构象变化，该技术与质谱联用可在低于Tm的温度下揭示利妥昔单抗中的细微HOS变化，与经典的生物物理技术互补。总体而言，鉴于CL-MS简便、灵敏的特点，该方法将适用其他抗体药物的结构研究。

p style=" text-align: justify " 　　美国威斯康星大学麦迪逊分校的李灵军教授在《美国质谱学会杂志》上发表了题为& quot Faces of Mass Spectrometry”的文章。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 进展1： /strong /p p 　　本月，李教授的团队在分析化学杂志上发表了一篇文章“HOTMAQ: A Multiplexed Absolute Quantification Method for Targeted Proteomics”。 /p p style=" text-align: center " img title=" 1111111.webp.jpg" alt=" 1111111.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201902/uepic/04527389-10d7-4d2c-9392-40078abb0c71.jpg" / /p p style=" text-align: justify " 　　靶向蛋白组学中的绝对定量研究由于复杂背景下的低特异性、有限的分析通量及广泛的动态范围等诸多因素而具有挑战性。为解决这些问题,其课题组开发了一个混合offset-triggered多路复用绝对量化(HOTMAQ)方法。此方法结合了具有成本效益的质量差异和等压标签，能够在MS1前体扫描中同步构建内部标准曲线,在MS2水平上实时识别多肽,并在同步前体选择(SPS)-MS3光谱中对目标蛋白进行质量偏移触发的精确定量。这种方法将目标定量蛋白质组学的分析通量提高了12倍。采用HOTMAQ策略对临床前阿尔茨海默病候选蛋白生物标志物进行高精度验证。HOTMAQ的高通量和定量性能，加上样品的灵活性，使其广泛应用于靶向肽组学、蛋白质组学和磷蛋白组学的研究中。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 进展2： /strong /p p style=" text-align: justify " 　　清华大学欧阳证和瑕瑜教授与普渡大学学者共同在《自然通讯》上发表“Online photochemical derivatization enables comprehensive mass spectrometric analyses of unsaturated phospholipid isomers” 文章。 /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 304" title=" 22222222.webp.jpg" style=" width: 600px height: 304px " alt=" 22222222.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201902/uepic/f219c925-a096-478e-a956-d221f5b56fbd.jpg" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " 　　质谱技术是脂质结构分析的主要工具，但如何在不饱和脂质中有效定位碳碳双键(C=C)以区分C=C位异构体仍是一个难题。本文通过Paterno-Buchi反应与液相色谱-串联质谱联用在线C=C衍生化，开发了大型的脂质分析平台。这为脂质C=C位异构体提供了丰富的信息，揭示了牛肝脏中200多种不饱和甘油磷脂的C=C位，鉴定出55组C=C位异构体。通过对乳腺癌患者和2型糖尿病患者血浆样本的分析，其课题组发现C=C同分异构体的比例受个体丰度的影响较小，这说明同分异构体比例可能用于脂类生物标志物的发现。 /p p & nbsp /p

以毒攻毒，充分利用自然界天然的复杂合成毒素，一直是世界医学界研制开发新药物的有效路径。为开发高效、负担得起的糖尿病或肥胖新药，欧盟第七研发框架计划(FP7)提供600万欧元资助，总研发投入940万欧元，由欧盟5个成员国法国(总协调)、西班牙、葡萄牙、比利时和丹麦，以及跨学科生物化学科研人员和联合制药工业组成了欧洲VENOMICS研发团队。从2011年11月开始，该团队致力于毒蛇毒素新药的研制开发，并取得了积极进展。　　研发团队首先在全球范围内成功优化筛选出“高效毒素”的200余种毒蛇，进行人工培育。采用最新开发的高精度质谱仪技术和其它先进技术，对203种最具活力的毒蛇毒液样本、复杂的生物化合物分子结构开展研究分析，成功分类出4000余种毒素“微蛋白”。根据毒性的峰值，将其应用于各类新药的开发。　　目前，该团队的大部分研发创新活动已转向糖尿病、肥胖症、心血管疾病、人体过敏和癌症等靶向药物开发，其中收集的各项研究数据已证实，毒蛇毒素对抑制和治疗糖尿病或肥胖具有明显疗效。新药物的发现和定性定量通常需要2-3年时间，尚需10年或15年时间进行临床试验、产品认证和商业开发，最终才能进入市场。

大家好，本周为大家介绍一篇发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，Transient Structural Dynamics of Glycogen Phosphorylase from Nonequilibrium Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry，文章作者是英国埃克塞特大学的Jonathan J. Phillips。　　变构调节指在蛋白质的正构位点上的变化通过蛋白质内部传递，最终影响到变构位点的结构，从而调整白质功能。理解蛋白质功能转换背后的特定结构动态变化对于分子生物学和药物发现领域至关重要。尽管变构现象自从提出以来已有广泛的研究，但是关于信号如何在蛋白质内部长距离传递的具体机制仍然不甚清楚。很大程度上是由于缺乏能够在时间和空间上高分辨率测量这些信号的生物物理方法。糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，GlyP)是研究变构调节常用的标准蛋白，GlyP与II型糖尿病和转移性癌症的治疗密切相关。GlyP作为一种典型的变构酶，其活性受磷酸化修饰、多种天然配体和药物的调控。本文旨在通过开发和应用非平衡毫秒级氢/氘交换质谱(neHDX-MS)技术，来精确定位GlyP在变构激活和抑制期间的动态结构变化。这项技术能够提供蛋白质在毫秒时间尺度上的局部结构动态信息，有助于揭示变构调节过程中的瞬态结构特征，从而为理解蛋白质的动态行为和设计变构调节剂提供重要的结构信息。　　作者首先确定了能够完全激活或抑制GlyP的条件。25 mM 的AMP能实现GlyPb的最大激活(图1A)。32 mM咖啡因足以完全抑制GlyPa(图1B)。并且观察到50ms内AMP和咖啡因能够达到最佳激活/抑制状态(图1C和1D)。　　图1.糖原磷酸化酶b的变构激活和糖原磷酸化酶a的抑制。　　随后作者通过neHDX-MS捕捉由AMP引起的GlyPb变构激活过程中的局部结构扰动。通过激活过渡态与未激活和激活状态之间的HDX差异，作者将这些肽段分成了七个类群。其中重点值得关注的类群是c、d(其他类群对应区域及趋势不在此详细介绍)，因为他们的HDX行为与未激活和激活时的稳定态都有明显差异，这些局部区域的结构变化是过渡态的独特体现(图2A)。其中，c类群主要涵盖了tower helix区(图2B)，说明该区域在从未激活到激活状态的过渡态中，表现出相较于前后二者皆较高的动态性。d类群涵盖活性位点，说明活性稳点结构在因结合发生了结构稳定化现象。为了从原子水平理解这些瞬态结构变化，研究人员使用了一种基于Energy Calculation and Dynamics(ENCAD)的方法，Climber，来模拟从非活性状态到活性状态转变过程中的过渡态内部作用变化。结果显示，tower helix在激活过程中经历了氢键先断裂后形成的变化，这与观察到的HDX增加相一致(图4A)。　　图2.GlyPB中表现不同结构动力学行为的类群。　　图3.局部区域HDX动力学。　　图4.GlyP在活性和非活性状态之间的结构插值。　　随后作者探讨了咖啡因如何通过变构抑制影响GlyPa的结构动态。同样作者也比较了抑制过渡态与未抑制和抑制状态之间的HDX差异，分成了七个类群。在这几组类群中，仅有m表现出较未抑制和抑制状态都较明显的氘代上升趋势(图2C、图3C&D)。m区域涵盖了tower helix区(图2D)，说明该区域在未抑制状态到完全抑制状态的过渡阶段内，发生了局部去结构化现象。此外，在280s loop和250′ loop区域也表现出类似的瞬时去稳定化现象。结合AMP激活实验中的现象表明，尽管咖啡因和AMP作用于GlyP的不同位点，但它们都可能通过类似的变构路径(即tower helix的去稳定化)来引起GlyP的变构调节，从而实现对该蛋白功能的调控。同样在Climber分析中，可以观察到对应区域发生了氢键重排，与neHDX-MS结果呼应(图4B)。　　本文讨论了GlyP的变构调节中间态涉及的局部结构动态变化，并通过毫秒级neHDX-MS揭示了这些变化。结果表明激活和抑制过渡态都涉及到tower helix的氢键断裂和局部结构重排，这是两个途径的共同特点。本研究的亮点在于开发了一种新的neHDX-MS方法，能够在毫秒时间尺度上观察蛋白质的变构结构动态。这种方法不仅对理解GlyP的变构机制具有重要意义，而且可以广泛应用于不同蛋白质的变构研究，为理解蛋白质的变构调节提供了新的视角和工具。　　撰稿：罗宇翔　　编辑：李惠琳　　文章引用：Transient Structural Dynamics of Glycogen Phosphorylase from Nonequilibrium Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry　　参考文献　　Kish, M. Ivory, D. P. Phillips, J. J., Transient Structural Dynamics of Glycogen Phosphorylase from Nonequilibrium Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 2023, 146 (1), 298-307.

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在 Journal of the American Chemical Society上文章，Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes1。该文章的通讯作者是美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的Joseph A. Loo教授。非变性质谱(native MS，nMS)通常用于揭示蛋白及其复合物的分子量大小和化学结合计量比，但若要进一步阐明深层次的结构信息，则需要与串联质谱结合，即非变性自上而下质谱（nTDMS），通过对母离子进行二级甚至多级碎裂可获取额外的序列、翻译后修饰(PTMs)以及配体结合位点信息。此外，nTDMS能以构象敏感的方式断裂共价键，这样就可以从碎片模式推断出有关蛋白高级结构的信息。值得注意的是，使用的激活/解离方式会极大地影响得到的蛋白质高阶结构信息。电子捕获/转移解离(ECD、ETD或ExD)和紫外光解离(UVPD)等快加热的活化方式因其能够在保留蛋白整体结构的情况下先对共价键进行断裂而被广泛应用于nTDMS分析中。而慢加热的活化方式如碰撞活化解离(CAD)会在断键前进行能量重排，导致一些较弱的非共价相互作用先发生破坏，例如：亚基的释放和展开，因此对高阶结构表征没有帮助。而此次Joseph A. Loo课题组的研究结果显示使用基于orbitrap的高能C-trap解离(HCD)同样也可以从天然蛋白复合物的中直接获得序列信息，并且碎片模式可以提供有关其气相和溶液相高阶结构信息。此外，CAD还可以生成大量的内部碎片(即不包含N-/ C-端的片段)用于揭示蛋白质复合物的高阶结构。为了研究蛋白复合物HCD的碎裂化情况，作者比较了酵母来源的乙醇脱氢酶四聚体（ADH）在Complex-down MS (psedo-MS3)和nTDMS两种分析策略下的碎片模式。如图1所示，在Complex-down MS分析中，ADH经源内解离（ISD）释放出单个亚基，该亚基经HCD碎裂生成肽段b/y离子。而在nTDMS分析中，肽段离子则可以从复合物中直接获得。如图2（上）所示，在Complex-down MS分析中总共获得了24个b离子和18个y离子，能够实现11.8%的序列覆盖率。近乎相等数目的b、y离子表明Complex-down MS分析中释放的ADH亚基N-端和C-端均具有较高的表面可及性，即亚基发生去折叠。此外，碎片模式也揭示了N-端乙酰化、V58T突变体以及Zn2+结合位点等信息。相比之下，nTDMS分析则更反映ADH的高阶结构，如图2（下）所示，在nTDMS分析中主要检测到b离子，几乎没有亚基信号，说明b离子是直接由复合物中共价键断裂产生的。ADH的nTDMS分析共产生了60个N-端b离子和3个C-端y离子（17.6%序列覆盖率）。由HCD产生的大量N端碎片类似于ADH基于电子和光子解离技术产生的nTDMS产物。将这些片段映射到ADH的晶体结构上可以看出，N端区域比C端区域更容易暴露于溶剂，而C端区域主要形成复合物的亚基-亚基界面。ADH的碎片离子中来源亚基界面断裂的仅占8%，大部分碎裂都发生在溶剂可及的N-端。图1 Complex-down MS和nTDMS分析流程图1 Complex-down MS（上）和nTDMS（下）碎片模式比较ADH的nTDMS分析充分展现了CAD在蛋白复合物高阶结构表征上的潜力，为了进一步验证，作者还选择了其他的蛋白复合物进行实验，如醛缩酶同源四聚体、谷胱甘肽巯基转移酶A1二聚体、肌酸激酶二聚体等。这些蛋白复合物在n-CAD-TDMS分析中都产生了与结构对应的碎片离子，说明基于CAD的nTDMS分析是具有普适性。当然也会存在一些例外，膜蛋白水通道蛋白(AqpZ)同源四聚体在nTDMS分析过程中产生了高丰度的单体亚基、二聚体、三聚体信号，这应该归因于AqpZ四聚体亚基之间的弱疏水结合界面，导致亚基的释放发生在共价键断裂之前，因此产生的b/y离子无法反映蛋白复合物的空间结构。相较而言，以盐桥为主要稳定作用的蛋白复合物，如ADH、醛缩酶等则更容易在nTDMS分析中产生肽段碎片离子。此外，基于CAD的nTDMS分析中还发现了大量的内部碎片，ADH产生的大部分内部碎片来源于溶剂可及区。尽管内部碎片难以辨认，但可以大幅度提高序列覆盖率，提供更精细的结构信息。一个从小分子裂解衍生到大分子解离的假设是，在实验的时间尺度内，由碰撞引起的激活是完全随机化的，并以沿着最低能量途径引导碰撞诱导的解离。然而，这些假设没有考虑到熵的要求，缓慢重排可能是释放亚基所必须的，例如重新定位盐桥将一个亚基与其他亚基相连。在碰撞次数或每次碰撞能量不足以碰撞出能释放亚基的罕见构型的情况下，以释放出更小的多肽碎片(具有更少的约束) 代替重排可能具有更高的竞争性。总之，本文展示CAD在nTDMS分析中的应用，无需基于光子或电子的活化方式，CAD可直接从蛋白复合物中获得肽段离子，并且该碎裂离子能够反映蛋白复合物的空间结构。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes参考文献1. Lantz C, Wei B, Zhao B, et al. Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes. J Am Chem Soc. 2022 144(48): 21826-21830.

随着生命科学研究的深入开展,科学界对解析复杂生物大分子结构以揭示生命现象的渴望日益增加。在各种结构生物学技术快速发展的背景下,结构质谱技术凭借其独特的优势,日益成为连接静态结构与动态功能、实现从分子到细胞的跨尺度研究的重要手段。在12月12-15日即将召开的“第十四届质谱网络会（iCMS 2023）”同期，特别新增了“结构质谱新方法”主题专场,来自全国的顶尖科学家团队将汇聚一堂,围绕氢/重氢交换质谱、化学交联质谱、原位质谱等前沿技术,报告他们在蛋白质结构生物学研究中的最新进展。本次主题会议的召开,恰逢结构质谱技术发展的重要机遇,必将推动该领域技术的重要突破及交叉创新,开启生命科学研究的新篇章。热忱欢迎质谱界的科技工作者报名参会交流、了解前沿动态、开拓合作视野。部分报告预告如下，点击报名  》》》会议主持人：中山大学 教授 李惠琳中山大学药学院教授，博士生导师。主要从事生物质谱新技术的开发及应用，侧重于（1）开发整合结构质谱技术（包括native top-down MS, HDX-MS, CX-MS等），用于药物作用分子机制及蛋白复合物结构研究；（2）Middle-down/top-down蛋白质组学新技术的开发及应用。共发表SCI收录论文40篇，其中第一作者或通讯作者15篇，主要发表在Nat. Chem.、Anal. Chem.等期刊；2014年获得American Society of Mass Spectrometry Postdoctoral Career Development Award；2019年入选“珠江人才计划”青年拔尖人才；主持国家自然科学基金项目3项。报告人：香港理工大学 教授 姚钟平报告题目：氢氘交换质谱揭示β-内酰胺酶与抑制剂相互作用的动态构象复旦大学学士及硕士,香港科技大学博士,香港理工大学应用生物及化学科技学系教授。长期从事质谱、分析化学、化学生物学、组学的交叉学科研究，主要发展和应用质谱技术解决化学、生物、食品安全、信息科学等领域的基础和应用问题，在Nature Communications, PNAS, JACS等期刊发表论文100多篇。现任香港研究资助局专家委员会委员、深圳市中药药学及分子药理学重点实验室副主任、中国化学会有机分析专业委员会委员、Frontiers in Chemistry副主编以及Analytica Chimica Acta, Rapid Communications in Mass Spectrometry,《中国质谱学报》,《分析测试学报》等期刊编委。会上,姚钟平教授将作主题为《氢氘交换质谱揭示β-内酰胺酶与抑制剂相互作用的动态构象》的报告。利用氢氘交换质谱（HDX-MS）并结合原态离子迁移质谱（Native IM-MS）以及分子动态(MD)模拟，发现不同亚型的A型β-内酰胺酶在几个主要的结构域存在显著的动态构象差异。进一步研究了A型β-内酰胺酶与抑制蛋白结合界面的动态结构变化，结果揭示了H10区域是一个可调节β-内酰胺酶抑制作用的别构部位。报告人：浙江大学 研究员 周默为报告题目：非变性质谱剖析异质性蛋白复合体结构和功能信息浙江大学首位“求是实验岗”研究员，分析化学专业，长期从事前沿生物质谱技术和仪器的开发工作。2008年本科毕业于武汉大学，2013年博士毕业于美国俄亥俄州立大学，之后两站博士后分别在美国FDA和西北太平洋国家实验室PNNL。2018年成为PNNL的研究员开展独立研究，培养多名博士后和学生。2023年加入浙江大学。截至目前共发表60余篇学术论文，代表作包括在Angewandte Chemie, Nature Communications, Analytical Chemistry等期刊的论文。现任自上而下蛋白组协会（Consortium for Top Down Proteomics）的青年委员会主席，曾担任美国质谱协会（ASMS）的出版委员会委员、短课程讲师、评审委员等学术任职，努力推动新分析测试技术的开发和跨学科领域的应用研究。本次会议中，周默为研究员将为介绍题为《非变性质谱剖析异质性蛋白复合体结构和功能信息》的报告。精准表征生物大分子的微观结构对各类生物工程、生物医药领域的研究至关重要。由于大部分质谱检测到的分子量范围有限，在分析之前生物大分子需要先被剪切为分子量更小的片段。但是剪切和碎片化的过程中会丢失一些关键的结构信息。前沿质谱技术提高了仪器的分子量上限，使非变性条件“自上而下”研究完整的生物大分子更加容易。我将以具体案例，阐述自上而下非变性质谱技术在异质性蛋白质复合体结构和功能解析中的贡献，以及与其他方法的互补性。报告人：北京大学 研究员 王冠博报告题目：生物样本中蛋白高级结构的质谱分析北京大学生物医学前沿创新中心研究员。北京大学学士，美国马萨诸塞大学博士，曾于荷兰乌特勒支大学暨荷兰蛋白组学中心从事博士后研究；曾任南京师范大学教授、博士生导师。主要从事免疫反应相关蛋白质的高级结构及相互作用研究，以生物质谱为核心工具，结合新型分析设备研发，应用于生物物理学、蛋白质药物分析等领域。长年与国际药企合作研发新型药物表征技术并应用于新药研发。获国际国内授权专利，出版《Mass Spectrometry in Biopharmaceutical Analysis》等专著、译著、合著多部。任中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业分会委员、国际学术组织Consortium for Top-Down Proteomics青委会委员。本次会议中，王冠博研究员将围绕生物样本中蛋白高级结构的质谱分析主题分享报告。生物质谱已成为蛋白质多次结构表征的重要工具。为将蛋白结构质谱技术的应用拓展至生物样本乃至临床样本中，我们针对背景基质复杂、糖基化等修饰异质性高、超大分子量颗粒结构层次多样等问题，以非变性质谱等质谱手段为核心工具开发了一系列组合策略，提供生物样本乃至临床样本中的蛋白高级结构和相互作用关系信息。报告人：中国科学院大连化学物理研究所 研究员 王方军报告题目：高能紫外激光解离-串联质谱仪器研发和应用2011年于中科院大连化物所获博士学位，师从邹汉法研究员。研究工作致力于生物大分子质谱新仪器、新方法及其在生命健康领域的应用研究，搭建了世界首台50-150 nm可调波长极紫外激光超快解离-串联质谱；提出了位点光解离碎片产率和原位化学标记效率定量表征蛋白质结构变化的两种质谱分析新原理，实现亚微克蛋白质复合物序列和结构变化单氨基酸位点分辨表征；发展了蛋白质-纳米材料界面相互作用精细结构的质谱分析新方法等。在Nat. Protoc.，J. Am. Chem. Soc.，Cell Chem. Biol.，Chem. Sci.，Anal. Chem.等期刊发表论文130余篇，他引5000余次。本次会议中，王方军研究员将分享题为《高能紫外激光解离-串联质谱仪器研发和应用》的报告。高能/真空紫外激光解离是表征生物大分子序列和动态结构的前沿结构质谱表征技术，但相关仪器和理论都亟待发展。报告人将介绍近年来自主研发的皮秒脉冲极紫外激光解离装置和蛋白质原位光化学标记仪器的原理、主要参数、与商品化质谱对比、及在蛋白质瞬态结构表征、蛋白-蛋白识别和相互作用机制分析等方面的应用情况。报告人：中国科学院大连化学物理研究所 研究员 赵群报告题目：活细胞内蛋白质原位构象和相互作用规模化解析新方法研究中国科学院大连化学物理研究所研究员，博士生导师。本科毕业于西北大学化学基地班。同年进入大连化学物理研究所攻读博士学位，师从张玉奎院士和张丽华研究员，2014年获得理学博士学位。毕业后留所工作至今，主要从事蛋白质组定性定量及相互作用分析新技术研究，共发表学术论文62篇，其中近五年以通讯/第一作者（含共同）在Nat. Commun., Angew. Chem. Int. Ed.，Anal. Chem.等SCI期刊发表论文23篇；已获20项发明专利授权。作为课题负责人承担国家重点研发计划，作为项目负责人承担国家自然科学基金面上基金等，2023年获国家自然科学基金优秀青年基金支持；2018年入选大连市科技之星，2020年入选中国科学院青年促进会会员，2023年获中国化学会菁青化学新锐奖；兼任《色谱》青年编委、中国化工学会理事、中国蛋白质组学会青年委员、中科院青促会沈阳分会委员等。本次会议中，赵群研究员将围绕题为《活细胞内蛋白质原位构象和相互作用规模化解析新方法研究》的报告。作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合体等形式行使其特定的生物学功能。不同于细胞外的离体环境，细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合体的结构和功能起着至关重要的作用。因此，实现细胞内蛋白质相互作用的精准解析对于深入研究其生物学功能，进而理解生命现象本质具有重要意义。近年来，化学交联质谱技术已逐渐成为蛋白质复合物解析的重要手段。它是利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质内/间的氨基酸以共价键连接起来，再利用质谱对交联肽段进行鉴定，进而实现蛋白质相互作用的组成、界面和位点的解析。现有化学交联技术主要用于解析体外表达纯化的或细胞裂解液中的蛋白质复合物，而在细胞内蛋白质复合物的原位构像解析方面仍处于起步阶段。 针对上述问题，我们团队发展了一系列新型高生物兼容性的可透膜多功能化学交联剂，实现了活细胞内蛋白质复合物构像的原位交联捕获；建立了多种高选择性的低丰度交联肽段的富集方法和高可信度的交联肽段鉴定方法，显著提高了原位交联信息的鉴定灵敏度、覆盖度和准确度；进而，通过靶向富集特定亚细胞器内的交联蛋白质复合物，实现了亚细胞器空间分辨的蛋白质相互作用精准解析；在上述基础上，利用基于化学交联距离约束的分子动力学技术获得了蛋白质复合物的动态系综构像，实现了活细胞微环境下蛋白质复合物组成、相互作用界面及作用位点的规模化精准解析，为规模化地揭示蛋白质复合物功能状态下的结构调控机制提供了重要的技术支撑。为了分享质谱技术及应用的最新进展，促进各相关单位的交流与合作， 仪器信息网与北美华人质谱学会（CASMS）将于2023年12月12-15日联合举办第十四届质谱网络会议（iCMS2023）  。以上仅是部分报告嘉宾的分享预告，更多精彩内容请参加会议页面：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/iCMS2023/ （点击下图去报名）》》》

四极杆质谱仪QMSQMS是最常见的质谱仪器，定量能力突出，在GC-MS中QMS占绝大多数。优点： 结构简单、成本低、维护简单； SIM功能的定量能力强，是多数检测标准中采用的仪器设备。缺点： 无串极能力，定性能力不足； 分辨力较低（单位分辨），存在同位素和其他m/z近似的离子干扰； 速度慢，质量上限低（小于1200u）。飞行时间质谱仪TOFMSTOFMS是速度最快的质谱仪，适合于LC-MS方面的应用。优点： 分辨能力好，有助于定性和m/z近似离子的区别，能够很好的检测ESI电喷雾离子源产生多电荷离子； 速度快，每秒2～100张高分辨全扫描（如50～2000u）谱图，适合于快速LC系统（如UPLC）； 质量上限高（6000～10000u）。缺点： 无串极功能，限制了进一步的定性能力； 售价高于QMS； 较精密，需要认真维护。三重四极杆质谱仪QQQQQQ质谱给四极杆质谱仪在保留QMS原有定量能力强的特点上，提供了串级功能，加强了质谱的定性能力，检测标准中常作为QMS的确认检测手段。优点： 有串极功能，定性能力强； 定量能力非常好，MRM信噪比高于QMS的SIM是常用的QMS结果确认仪器； 除一般子离子扫描功能外，QQQ还具有SRM、MRM、母离子扫描、中性丢失（Neutral loss）等功能（离子阱不行）； 对特征基团的结构研究有很大帮助。缺点： 分辨力不足，容易受m/z近似的离子干扰； 售价较高； 需要认真维护。四极离子阱，QTrap 技术上而言，在传统QQQ的四极杆中加入了辅助射频，可以做选择性激发；或者就功能而言，为QQQ提供了多级串级的功能。优点： 同时具备MRM、SRM、中性丢失和多级串级功能，非常适合于未知样品的结构解析。缺点： 分辨力还是低了点。离子阱质谱仪ITMS离子阱质谱仪是最简单的串联质谱，常用于结构鉴定。优点： 成本比QQQ低廉，体积小巧； 具备多级串级能力，适合于分子结构方面的定性研究，能够给出分子局部的结构信息，比QQQ好； 有局部高分辨模式（Zoom Scan），分辨力比四极杆质谱高数倍，达到6000～9000，适合于确定离子质量数。缺点： 定量能力不如QMS和QQQ，所以大多数GCMS不采用离子阱质谱； 不能够像QQQ一样做母离子扫描和中性丢失，在筛选特征结构分子的时候能力不足。线性离子阱，Linear Ion Trap传统3D离子阱的增强版本。优势： 相对于传统3D离子阱，灵敏度高10倍以上多级串级质谱。缺点： 相对于QQQ，还是不能做MRM、中性丢失等特征基团筛选功能四极杆飞行时间串联质谱QTOFQTOF以QMS作为质量过滤器，以TOFMS作为质量分析器。优点： 能够提供高分辨谱图； 定性能力好于QQQ； 速度快，适合于生命科学的大分子量复杂样品分析。缺点： 成本高。离子阱-飞行时间质谱，Trap TOF 需要仔细维护； 以3D离子阱作为质量选择器和反应器，结合了离子阱的多级质谱能力和飞行时间质谱的高分辨能力。优点： 同时具有多级串级和高分辨能力，适合于未知样品的定性工作，如糖蛋白的定性。缺点： 由于离子阱容量限制，对于混合样品的灵敏度欠佳； 定量能力弱。线性离子阱-飞行时间质谱，LIT-TOF 以线性离子阱为质量选择器和反应器，结合了线性离子阱的高灵敏度多级串级能力和飞行时间质谱的高分辨能力。如直接耦合线性离子阱-飞行时间串联质谱。优点： 高灵敏度、高分辨、多级串级； 定量能力强。缺点： 功能复杂，维护复杂。磁质谱Sector MS磁质谱的定量能力是各种质谱中最强的。现在已较少使用，仅用于地质元素和痕量二恶英的检测。优点： 技术经典、成熟，NIST等MS库采用的仪器； 分辨力非常好（100k，m/&Delta m FWHM），干扰少； 灵敏度高，定量能力是各种质谱中最好的。缺点： 体积、重量大； 售价很高，速度慢； 维护复杂，很费电。傅立叶变换质谱仪FT-ICR-MSFourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer 傅立叶变换质谱仪的分辨能力最高，常作为高端科学研究的装备； 在蛋白组学和代谢组学起到了超强作用。优点： 能够做多级串级，定性能力极好； 分辨力极高，灵敏度很好； 可以有不同的电离源联用实现对不同极性的化合物进行检测。缺点： 体积重量大，售价极高，速度较慢； 维护费用非常昂贵。静电场傅立叶变换质谱，Orbitrap优点： 高分辨，60k～120kFWHM，质量精度高； 相对FT-ICR而言，价格稍低（～450kUSD）。缺点： 不能单独做串级； 分辨力、灵敏度、质量稳定性等离FT-ICR还有距离。

p 　　近来，结构生物学领域发现了研究蛋白质机构和相互作用的两种非常互补的分析技术——交联质谱(XL-MS)技术和荣获诺贝尔奖的冷冻电镜(cryo-EM)技术，两种技术被结合应用于蛋白质机构和相互作用的研究中。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 253px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/1db47922-dd4e-4a74-9689-d8dc5825a5c3.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" width=" 450" height=" 253" border=" 0" vspace=" 0" / /p p 　　作为一对“强大”的技术，XL-MS和cryo-EM在结合运用中在共同弥补着各自的缺点不足。当cryo-EM图像中分子区域定义不太清晰明确时，XL-MS就会介入，提供关于特定氨基酸残基关键信息，从而可以识别蛋白质并准确推断蛋白质结构。以下，让我们详细探讨一下这两种技术的发展情况，以及它们如何共同推动结构蛋白质组学领域进入一个新的时代。 /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong 蛋白质结构：“组装机器的计划蓝图” /strong /span /p p 　　蛋白质及其复合物是生物细胞的生物“主力”，调节着细胞功能不可或缺的过程，如细胞生长、细胞死亡以及细胞生命周期的各个阶段。 /p p 　　“我喜欢将蛋白质结构与组装机器的蓝图进行比较，”荷兰格罗宁根大学高分辨率cryo-EM实验室助理教授Cristina Paulino在最近的一次采访中谈到，“虽然遗传学和生物化学有助于理解蛋白质的生理作用，但结构生物学揭示了这些纳米机器的外观以及它们的连接方式。” /p p 　　因此，对这种“连接方式”的了解为科学家们提供了修复、设计和复制蛋白质，或潜在地阻断蛋白质功能的机会——蛋白质组学的应用，预计将成为个性化医学和现代药理学不可或缺的组成部分。 /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong 关于XL-MS技术应用 /strong /span /p p 　　生物学的一个基本原理是蛋白质由氨基酸残基通过肽键连接形成多肽。除了肽键外，还存在非共价键，如范德华力、静电和疏水相互作用。在结构生物学中，这些键很难检测到，在原子水平上研究蛋白质结构时增加了额外的复杂性。在过去的十年中，蛋白质组学领域见证了MS技术逐渐增加丰富的一系列令人深刻的技术，其中。XL-MS技术是已证明对结构蛋白质组学不可或缺的技术之一。[1] /p p 　　图1总结了典型XL-MS的工作流程，其中，蛋白质(或其邻近)之间的非共价键相互作用(或接近它们)通过用交联试剂溶解天然蛋白质转化为人工共价键。由于赖氨酸残基的广泛存在、在水溶液中的稳定性和高反应活性，赖氨酸残基的伯胺基团或蛋白质的N-末端是交联剂的常见靶标。最常用的是同位功能交联剂包括辛二酸二琥珀酰胺(DSS)和辛二酸(磺基琥珀酰亚胺基)。[2]在交联阶段之后，蛋白质被蛋白酶加工成肽段。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/05df0100-7766-418e-b884-48a3df737aec.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 图1：通用XL-MS工作流程。图片来源：乌得勒支大学Heck实验室Richard Scheltema /span /p p 　　“随后通过MS测量混合物进行鉴定——在大多数情况下，可以指定交联中涉及的氨基酸，用间隔臂的长度和两侧链的长度定义的距离进行约束” 乌特勒支大学Heck实验室Richard Scheltema博士解释说，“这些距离限制提供了关于蛋白质如何折叠(两种来自相同蛋白质的肽段)或蛋白质相互作用的有价值的信息，以及这种相互作用的界面位于何处(两种来自不同的蛋白质肽段)。” /p p 　　通常情况下，XL-MS实现的结构分辨率在15-50埃米，其分辨率无法与X射线晶体学、核磁共振(NMR)光谱学、cryo-EM等其他结构生物学技术的分辨率相匹敌。因此，这些技术必须相互补充使用。[3] /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong cryo-EM：提供的进一步解决方案 /strong /span /p p 　　冷冻电镜(cryo-EM)是由透射电镜(TEM)发展而来的，它通过二维(2D)图像投影来确定三维(3D)结构，同时保持样品的完整性和结构接近原始状态。这是通过研究玻璃化状态下的样品来实现的。在玻璃化状态下，样品的薄片迅速浸入液态乙烷溶液中，低温保存并保护其免受TEM内的真空和辐射损伤。[4]Paulino也进一步讨论了cryo-EM与其他结构生物学技术相比的优势。 /p p script src=" https://p.bokecc.com/player?vid=2D0A61DE3EBDEABB9C33DC5901307461& siteid=D9180EE599D5BD46& autoStart=false& width=600& height=490& playerid=5B1BAFA93D12E3DE& playertype=2" type=" text/javascript" /script br/ /p p img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/df940b25-54db-4467-9ea6-bf2efb791961.jpg" title=" 0.jpg" alt=" 0.jpg" style=" max-width: 100% max-height: 100% " / br/ /p p 　　近年来，cryo-EM技术已经取得了长足的进步，这意味着许多样品现在可以用近原子分辨率(通常为3-5埃)进行分析。[5]不幸的是，在这个分辨率范围内，科学家们仍然难以区分和表征蛋白质复合物中所有氨基酸侧链，这意味着重新构建模型是一项复杂的任务。“cryo-EM的使用正在大幅增加，从这项技术记录的蛋白质结构轮廓来看，很难确定哪些蛋白质相互关联，以及它们在整个结构中是如何排列的。而这就是XL-MS介入的地方。 /p p 　　XL-MS中的交联数据描述了肽段中两个特定氨基酸残基之间的最大距离。将提出的蛋白质结构模型及其结构域插入由cryo-EM重构获得的三维体中，并整合交联数据，以验证蛋白质复合物内特定肽的位置和方向。 /p p 　　将蛋白质整合到三维体中是一项艰巨而复杂的任务，需要对所涉及的蛋白质复合物及其子成分有透彻的理解。因此，Sali团队开发了集成建模平台(IMP)，这是一个希望将XL-MS和cryo-EM结合起来的研究人员的通用工作流程平台。 /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong XL-MS和cryo-EM在结构生物学中被配合应用 /strong /span /p p 　　最近，Henry等人确定了载脂蛋白E4(ApoE4)的活性结构和结合机制。ApoE4与阿尔茨海默病(AD)和心血管疾病(CVD)有关，是载脂蛋白(ApoE)的脂质化同种型，ApoE是一种蛋白质，通过充当细胞表面受体的配体，促进富含胆固醇的脂蛋白的内化。采用结合XL-MS，cryo-EM和生物信息学建模工具的混合方法，Henry等表明ApoE4存在于两种不同的确证中，指向依赖于调节其受体结合区可及性的激活机制。作者指出，这些发现可能对于解释蛋白质在AD和CVD中的作用以及随后潜在治疗方法的发展具有重要价值。[6] /p p 　　Schmidt和Urlaub在2017年全面综述中概述了类似的令人印象深刻的研究，包括Lü hrmann和Stark组对剪接体的结构表征。 /p p 　　2019年1月，荷兰科学研究组织(NWO)向一个名为“细胞中蛋白质社会行为的监测和可视化”的项目拨款160万欧元的资助，其中XL-MS和cryo-EM技术以及其他分子方法，被综合使用。项目可视化了蛋白质之间的相互作用，该项目的主要研究人员包括Albert Heck、John van der Oost、Alexandre Bonvin、Friedrich Foerster和Scheltema等人。 /p p 　　“在这个项目中，我们的目标是使用(一种cryo-EM的专门应用)，在选定的一组嗜热菌中不偏倚地发现所有的蛋白质复合物。在这里，XL-MS被用来提供识别复合物内蛋白质的身份、空间顺序(通常不能直接从断层扫描数据中得到答案)，以及结构模型来填补最终的空白。” Scheltema说，“之所以选择嗜热菌，是因为这些微生物是具有生物化学用途的蛋白质复合物的潜在宝库。” /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong 重新定义限制，继续前进 /strong /span /p p 　　总之，XL-MS和cryo-EM为结构蛋白组学领域提供了巨大的发展潜力。然而，每种技术都面临着自己的局限性，必须克服这些局限性才能形成完美的配合使用。 /p p 　　“Cryo-EM不断重新定义其局限性，但我们仍然面临着一些挑战，”Paulino评论道，“对于X射线晶体学来说，获得完全可操作和维护的同步加速器束流线基本上是免费的，而cryo-EM的高成本和操作显微镜所需要的专业知识水平便成为一个障碍。” 在一定程度上(但并非全部)，政府实施对Cryo-EM设备的补贴政策的解决了这一问题。 /p p 　　“冷冻断层扫描提供了一种相对较低分辨率的蛋白质复合物视图，直接解释很困难。” Scheltema补充说，“另一方面，来自XL-MS的数据提供了解决方案中包含所有空间信息的视图。然而，我认为将这两者联系起来是最大的挑战，因为XL-MS提供了样本中所有蛋白质的信息， 这需要以某种方式过滤掉由断层扫描揭示的复合物内的蛋白质。” /p p 　　 strong 参考文献 /strong /p p 　　1. Rappsilber, Juri. 2011. The Beginning of a Beautiful Friendship: Cross-Linking/Mass Spectrometry and Modelling of Proteins and Multi-Protein Complexes. Journal of Structural Biology. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2010.10.014. /p p 　　2. Yu and Huang. 2017. Cross-Linking Mass Spectrometry (XL-MS): An Emerging Technology for Interactomics and Structural Biology. Analytical Chemistry. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b04431. /p p 　　3. Schmidt and Urlaub. 2017. Combining Cryo-Electron Microscopy (Cryo-EM) and Cross-Linking Mass Spectrometry (CX-MS) for Structural Elucidation of Large Protein Assemblies. Current Opinion in Structural Biology. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2017.10.005. /p p 　　4. Murata and Wolf. 2019. Cryo-Electron Microscopy for Structural Analysis of Dynamic Biological Macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2017.07.020. /p p 　　5. Lyumkis. 2019. Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis. Journal of Biological Chemistry. https://doi.org/10.1074/jbc.REV118.005602. /p p 　　6. Henry N., et al. 2019. Lipidated apolipoprotein E4 structure and its receptor binding mechanism determined by a combined cross-linking coupled to mass spectrometry and molecular dynamics approach. Plos Computer Biology. doi: 10.1371/journal.pcbi.1006165. /p

什么是 PFAS？它具有哪些功能？又存在哪些危害？1PFAS 即全氟/多氟烷基类物质，是一系列人工合成的有机化合物，主要由碳原子和氟原子构成。2凭借其优异的高热稳定性和化学稳定性，PFAS 在纺织、表面活性剂、食品包装、不粘涂层、防水涂层和灭火泡沫等领域广泛使用。3“成也萧何，败也萧何”，PFAS 进入环境之后，由于极其稳定，几乎不被生物降解，它可在环境中持久存在。而作为一种典型的内分泌干扰物，极微量的 PFAS 暴露就可能带来健康风险；同时考虑到不同人的体质，其安全水平难以预测。已经成为重点关注的环境新污染物之一。PFAS 监测的难点是什么？1目标化合物的数量庞大，已经报告的超过 6000 多个；且标准品不易获得；2涵盖不同的挥发性、极性和官能团。无法使用一种设备或者一个方法分析所有化合物；3浓度低（通常为低 ppt 和亚 ppt 级），要求设备有较高检测灵敏度；虽然高倍富集可以提高检测灵敏度，但同样会带来严重干扰；4实际环境中存在的 PFAS 化合物的种类和含量尚不清楚。安捷伦 7250 气相色谱-高分辨质谱联用仪具有灵敏度高、扫描速率快，高分辨抗干扰，精确质量数采集定性准确的特点，非常适合环境样品当中挥发性和部分半挥发性 PFAS 化合物的检测。因此安捷伦公司与美国加州大学戴维斯分校用户合作建立了包含上百种不同类型的 PFAS 化合物的气质高分辨谱库，包含全氟烷基碘化物（PFAIs）、氟聚物碘化物（FTIs）、氟聚物醇（FTOHs）、含氟聚物烯烃（FTO）、含氟聚物丙烯酸酯（FTAC）、含氟聚物甲基丙烯酸酯（FTMAC）和全氟烷基羧酸（PFCAs）等（图 1）。除了化合物高分辨质谱图、每个碎片的精确质量数及对应化学组成，谱库当中还包括了每个化合物的分子式、结构式、特定分析条件下的保留时间等信息（图 2）。图 1. 不同类型 PFAS 化合物的高分辨质谱图 图 2. 谱库当中 PFAS 化合物的高分辨质谱图、分子式、结构式、保留时间等信息基于 PFAS 气质高分辨质谱库、7250 SureMass 算法和安捷伦未知物分析软件，对饮用水和土壤样品当中的 PFAS 化合物进行了检测。图 3 显示的是样品高分辨质谱图经解卷积后通过与高分辨质谱库比对和保留时间辅助确认，对样品当中包含的 PFAS 化合物进行准确定性的结果（分别以一个化合物示例）。图 3. A：土壤当中检测到乙基全氟丁基醚；B：饮用水当中检测到甲基全氟辛酸数据结果表明：7250 高分辨气质和 PFAS 化合物高分辨质谱库的配合使用相得益彰，能够显著降低对 PFAS 这类复杂化合物的分析难度，提高定性准确性，加快分析速度。结 语 在上述实验过程中，7250 工作的扫描范围是 50-1200m/z，在这样宽广的范围内采集的质谱数据的分辨率和准确性不会受到影响，方便对环境当中各种类型的污染物进行大范围的筛查检测。利用 7250 这一优势，除了 PFAS 化合物，上述水样当中还检测到了包括消毒副产品、个人护理产品中的化学品、药物、杀虫剂等环境污染物，真正体现了 7250 高分辨质谱“一网打尽”的强大能力。

2022年7月12日，由天津市色谱研究会主办，南开大学分析科学研究中心和中山大学药学院共同协办，仪器信息网承办的”首届中国结构质谱前沿论坛”在线上盛大开幕。会议旨在促进我国结构质谱领域科研人员的交流与合作，展示我国在结构质谱领域的最新研究成果，探讨为实现我国追赶全球发达国家结构质谱研究水平做出重点支持的方向。会议将举办5期分论坛，首日邀请了中国科学院大连化学物理研究所张玉奎院士、南开大学化学学院朱守非院长、南开大学邵学广教授、南开大学庞代文教授、威斯康星大学李灵军教授、清华大学瑕瑜教授、南开大学李功玉教授、香港理工大学姚钟平教授、中国科学院大连化学物理研究所李海洋研究员、中国科学技术大学黄光明教授、中山大学李惠琳教授、北京大学白玉副教授、宁波大学化学院唐科奇院长、南开大学张新星研究员等多位业内专家参与特邀讨论环节并进行学术进展报告分享。会议吸引了超过3000人次线上观看并参与互动。会议伊始，由中国科学院大连化学物理研究所张玉奎院士、南开大学化学学院朱守非院长分别致开幕辞，南开大学邵学广教授主持会议。学术报告分享前，威斯康星大学李灵军教授、清华大学瑕瑜教授主持了“中国结构质谱发展现状与未来探讨”的开放讨论环节。多位专家学者就“结构质谱定义”“仪器技术与结构质谱研究的关系”等前沿话题进行了热烈的讨论。接下来的学术报告环节，会议共邀请了香港理工大学姚钟平教授、中国科学院大连化学物理研究所李海洋研究员、中国科学技术大学黄光明教授、北京大学白玉副教授、宁波大学材料化学学院唐科奇教授等6位专家进行了精彩的报告分享。《Protein Mapping and Data Storage:When Peptides Meet Mass Spectrometry》香港理工大学 姚钟平教授人类文明的发展史同时也是信息或数据存储技术发展的历史。而现在的时代是一个大数据的时代，每天产生大量的数据，数据增长的速度也越来越快。这些数据通常以数字的形式存储于光电磁装置，不仅需要较大的物理空间，还不能保存很长时间，因此需要开发耐久而且高密度的数据存储新方法。使用分子来存储数据，是解决此问题的一个方案。比起现在广为报道的利用DNA分子结构进行数据存储的DNA存储技术，多肽可供选择的单体更多，包括20种天然氨基酸及其他非天然氨基酸，因而其产生的序列可提供更高的存储密度；而且多肽比现有的存储媒介及DNA耐久性更好，例如在有数百万年历史的古生物样本中，DNA已经完全降解，而多肽及蛋白质仍可被检测到进而进行科学研究。多肽合成工业也已很成熟，可以以较低价格合成各种各样的多肽；过去二十多年蛋白质组学的迅猛发展，带动了相关硬件和软件的日趋完善，现有质谱技术已可在短时间内对很低量的成千上万条多肽进行测序，这些为利用多肽序列存储数据创造了条件。报告主要介绍了姚钟平与合作团队共同开发的新方法，使用多肽和串联质谱（MS/MS）来存储和读取数据。《高分辨离子迁移谱技术及应用》中国科学院大连化学物理研究所 李海洋研究员近年来,随着大气压样品进样、离子源和离子操控等技术的发展,离子迁移谱已从化学战剂、爆炸物和毒品的专用检测技术迅速发展成为一种在分析领域广泛使用的技术。随着检测对象越来越复杂,对离子迁移谱的分析性能提出了更高要求,特别是对超高分辨能力的需求。报告围绕结构质谱学与离子迁移谱IMS、IMS仪器的研发及应用等方面的内容进行了深入介绍。《Direct Mass Technology 在超大分子结构分析中的应用》赛默飞 黄敏博士电荷检测质谱（CDMS）通过同时测量单个离子的质荷比和电荷数，进而计算获得离子质量m。因此，相较于其他类型质谱，CDMS技术的关键是如何准确地测量单个离子的电荷。目前，电荷检测质谱技术多是能够自行开发质谱仪器硬件，或自行改编FTMS软件的专家才能进行这样的实验。基于此2022年的ASMS会议上，赛默飞重磅推出了直接分析质谱技术（DMT），并将其结合在了Orbitrap上，这使得超大分子量的复杂蛋白的直接质谱检测成为了可能。报告重点介绍了赛默飞直接分析质谱技术在超大分子结构分析中的应用情况。《单细胞代谢组：原位质谱新技术及其应用》中国科学技术大学 黄光明教授近年随着分析手段的不断提高，人们越来越意识到细胞具有个体差异性。即使在相同条件下培养的同源细胞，其在形态、基因表达水平以及生长特性上都存在一定的差别。如果能够在细胞层面上对参与生理病理过程的一些关键生物化学成分进行描述，将有助于了解细胞实现可塑性和稳定性的特定机制。单细胞代谢组学为解答这些问题提供了很好的机会，但对于单细胞代谢组学来说，单细胞样品制备、鉴定细胞内代谢产物和数据分析都需要复杂的技术和模型来进行，相关分析方法也面临许多挑战。报告介绍了黄光明课题组针对分析方法面临的挑战，建立的单细胞质谱分析平台，具有可分析单细胞、高通量、可同时获得化学和生物信息等特点，并进一步介绍了其团队针对单细胞代谢物的质谱应用分析进展。《常压离子化质谱新技术及其生物检测新应用》北京大学 白玉副教授常压质谱由于其高通量、敞开环境下取样、基质的耐受性强等特点，为复杂体系高通量、原位分析提供了可能和机遇。报告介绍了白玉课题组基于常压电离质谱开展的研究进展，包括构建了多种新型常压离子源仪器部件，解决了小分子化合物分析的离子源通用性难题，为生物标志物分析奠定基础。不仅如此，其团队也构建了多维度有机质谱流式分析平台，实现了单细胞中蛋白质和代谢物多维分子信息的同时获取，为肿瘤细胞精准分型及肿瘤耐药等研究提供创新性工具。《高分辨离子迁移谱质谱与分子结构解析应用的探究》宁波大学材料化学学院 唐科奇院长/教授离子迁移谱根据其操作原理可分为弱电场离子迁移谱(IMS)和高场非对称离子迁移谱(FAIMS)两大类，它和质谱(MS)的联用有效的克服了单一质谱技术难以测定分子结构的问题。由于离子迁移谱质谱这项复合技术具有同时确定分子成分和结构的能力，目前已被各大国际质谱公司采用并开发出了相应的商用产品，在分析化学，生命科学等多个领域里得到了广泛应用。报告介绍了各类迁移谱技术的发展和机理，并探讨了如何实现超高分辨率离子迁移谱的技术和方法，包括将高场非对称离子迁移谱和弱电场离子迁移谱复合组成二维迁移谱的可行性。首届中国结构质谱系列线上会议的第一期分论坛成功举办，下一期分论坛将于7月19日（周二）13:30-17:30召开，届时敬请关注。点击下方链接报名参会！点击了解会议：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/structuralmass2022.html

在癌症研究领域，质谱成像(MSI)技术是前景广阔，但目前该技术的运用还受原始数据预处理、图像精确度及图像识别能力等诸多问题的限制。 　　现在，来自英国帝国理工学院(Imperial College London)的研究人员在《PNAS》杂志上报告称，他们开发出了一种新方法，可有效解决上述问题。新方法将改变病体组织的检测方式，从而推动癌症组织分析进入数字时代。 　　质谱成像技术主要是利用质谱直接扫描生物样品，分析化学成分在细胞或组织中的结构、空间与时间分布信息。这种成像方法不局限于特异的一种或几种蛋白质分子，可在生物组织样本中找到每一种蛋白质分子，并提供它们在组织中空间分布的精确信息。早在几年前，就有科学家提出利用该技术来确定生物组织类型的构想，但却一直没有设计出实用有效的方法。 　　而这项最新方法利用解吸电喷雾电离技术来优化数据预处理，提高图像精确度，并通过提取生物组织特定的分子印记来强化不同生物组织类型的生化特性，以增强图像识别能力。 　　研究人员表示，利用新开发的集成生物学信息平台，可将质谱成像技术获得的大量人体组织的具体信息数据，用于构建各种类型的组织数据库。通过多样本分析，并与传统的组织学分析结果进行比较，计算机就可以学习识别不同类型的组织，从而使癌变组织的解析变得相对简单高效。他们将自己设计的工作流程用于直肠结肠癌组织的检测，效果良好。 　　与标准组织学动辄几周才会得出完整结果的检测手段相比，利用质谱成像技术进行单一检测，仅需几小时即可获得更详尽的信息，不仅会显示组织是否发生癌变，还会显示癌症是哪一种类型和亚型。这些信息对于医生们选择最有效的治疗方法十分重要。 　　研究人员指出，自 19 世纪后期染色技术用于显示组织结构以来，对组织病理学样本的分析方法鲜有变化。直到今天，染色法依然是医院组织学分析的主流手段，并且变得越来越复杂，耗费也越来越高。而质谱成像技术可能改变组织学的基本范式，科学家将不再根据组织的结构，而是根据它们的化学成分来定义组织类型。将来的检测不再依靠专家的眼睛，而是以海量数据为基础，仅一个检测所得到的信息就远比多个传统组织学检测所得到的更多。 　　他们表示，新研究克服了一些质谱成像技术实际应用所遇到的障碍，将成为创建下一代完全自动化的组织学分析手段的第一步。

蛋白质是生命的物质基础，通过与不同生物分子间的相互作用在生物体内执行着各项重要工作，其功能与结构直接相关。因此，解析蛋白质及其复合物高阶结构对于深入理解蛋白质功能、生理现象及药物研发具有重要意义。过去的60余年，随着X-射线晶体衍射(X-ray)、核磁共振(NMR)以及冷冻电镜(cryoEM)等技术的出现和不断发展，蛋白质结构解析取得了长足发展。然而，如何在分析蛋白质时使其保持近似自然生理环境的非变性状态，对其动态、异质性、相互作用等属性的研究是结构生物学领域的热点和难点。　　质谱技术的不断发展使其在蛋白质结构表征领域发挥了越来越重要的作用。非变性质谱(native MS)兴起于20世纪90年代，是一种可以分析蛋白高阶结构的生物质谱方法。与传统的破坏蛋白质立体结构和弱相互作用力的方法不同，非变性质谱采用质谱兼容的近生理pH值的溶液体系(主要为醋酸铵)和更温和的电离方式，使生物大分子在气相中能够最大程度地保持自然折叠状态、非共价相互作用和相关的生物学功能。因此，非变性质谱可以提供分子质量、寡聚态、构象(折叠vs 去折叠)、异质性、配体结合、靶蛋白-小分子亲和力以及复合物中蛋白亚基的相互作用网络关系等更具生物学意义的重要信息，为蛋白质“序列-结构-功能”关系提供分子基础，已成为结构生物学不可或缺的互补工具,在生物制药、蛋白一配体、蛋白一蛋白复合物结构分析等诸多领域具有广泛应用。　　近年来,蛋白质结构研究领域经历着剧烈的技术迭代。2021年人工智能(AI) AlphaFol2横空出世,将蛋白质3D结构预测的精度从60%提升到90%以上,在给传统结构解析技术带来冲击的同时,也为结构质谱的发展提供了契机。　　未来,非变性质谱技术的发展需要简化样品处理,提升仪器的灵敏度、分析通量和鲁棒性,实现内源性蛋白复合物样本的直接或原位分析,推动其在生物医药表征、蛋白多聚态等领域的更广泛应用。非变性质谱技术与离子消度(MS)、自上而下串联解离(top-down)、电荷检测质谱(CDMsS)等创新联用技术和方法的不断开发及完善,将极大地提升结构信息的广度、丰富度及精确度,补充生物物理学方法缺失的结构信息。同时,非变性质谱与cryoEM1、氢完交换质谱(HDX-MS)、交联质谱等技术联用将更加常态化,这些实验数据与AI结构预测算法的进一步整合将有效解决蛋白及蛋白复合物结构预测存在的精度问题,推动结构生物学发展,助力新药研发。　　此外,非变性质谱技术的应用发展将更加关注:1)蛋白复合物结构一功能关系的研究,通过与计算机模拟(MD)、HDX-Ms、cryoEM等技术联用,揭示标志物蛋白在人类疾病发展过程中的作用,推动靶向药物设计和精淮医疗 2)通过研究小分子与靶蛋白的相互作用获取二者结合的亲和力信息,加速靶向药物筛选 3)翻译后修饰(PTMS)、突变等因素导致的蛋白高度异质性及其对蛋白或亚基折叠动力学、构象及构象变化、结合计量比等造成的结构和功能影响 4)蛋白与其他生物分子(配体、DNAA/RNA、金属离子等)之间的相互作用。　　李惠琳，中山大学药学院教授，博士生导师。主要从事生物大分子质谱新技术的开发及应用，其研究主要侧重于1)开发整合结构质谱技术，并对蛋白质机器结构、功能和动态变化及靶向药物作用分子机制进行深入研究2)开发middle-down/top-down蛋白质组学技术，探索蛋白翻译后修饰在生命过程中的调控机制。承担国家自然科学基金项目3项，荣获美国质谱学会颁发的Postdoctoral Career Development Award (2014) ，入选珠江人才计划(青年拔尖人才，2019)，其研究成果发表在Nature Chemistry, Analytical Chemistry, J. Am.Soc.Mass Spectrom.等杂志。　　"非变性质谱技术研究与应用"专栏共收录7篇论文,既介绍了非变性质谱技术的样品制备、离子源、质量分析器、联用技术等基础内容,也涵括了样品提取、样品引入、离子化及电荷操控等方式,以及在蛋白结构及构象解析、蛋白・蛋白相互作用等领域的应用,代表了国内非变性质谱技术的发展现状。希望本专栏能成为《质谱学报》广大读者颇有价值的科技文献,同时也希望更多的学者加入到非变性质谱研究领域,推动我国结构质谱技术的创新发展。

要说近年来被公认增长最快的分析仪器，毫无疑问非质谱仪莫属。据美国acs网站统计，目前国际上排名前十的仪器厂商中，有七家都在从事质谱仪的研发和生产。就中国而言，对质谱仪的需求也在快速增长。质谱分析是一种测量离子质荷比（质量-电荷比）的分析方法。首先通过电离源将样品中各组分电离成离子，接着在高真空的质量分析器中，在电磁场的作用下主要根据质荷比（带电离子质量/所带电荷的数量）将离子进行分离，使这些离子最后在探测器上产生可以被互相区分的信号。对于不同的组分，电离生成的离子不同——故而质谱可以被用于鉴定样品中的不同组分。质谱仪基本结构示意图质谱技术发展至今已逾百年，质谱工作者们站在彼此的肩头，将一个简单的物理现象在理论和实践上推到如今的高度，使其成为了分析领域最重要的方法之一。目前质谱已不仅是常规化学分析中的重要手段，逐渐也开始被用于生命科学、国土安全、食品安全、临床医学检测和空间技术等热门领域。质谱技术的应用领域越来越广泛但我们知道，传统的实验室台式质谱仪昂贵、耗能、连接气路管道、需要强力真空泵，并且经常需要前端的分离系统，机体往往庞大笨重。若要应用于临床、机场安检、食品安全等原位现场测量场景，仪器必须小型化。不过，说小型化就小型化，你问过真空系统的意见了吗？没错，在小型化质谱仪的设计中，最大的一个挑战在于真空系统。上面在简介质谱仪工作原理的时候，已经提到，“真空”是质谱仪内部工作的必要条件。保持高真空度可以防止分子、离子、电子之间发生碰撞，避免噪声的产生。也就是说，真空度越高，质谱仪的信噪比越好。 遗憾的是，真空系统往往比较笨重，小型质谱仪也只能选择小型的真空泵，而泵速的下降，会直接导致系统真空度降低，这会严重影响质量分析器及探测器的正常运行。而从目前的研究结果来看，质谱的背景噪声主要来自探测器端，这源于一个叫离子反馈的作用。 常见的质谱探测器（如mcp、电子倍增器/em）都是将离子转化为电子；电子被电场加速、倍增并最终检出。而加速的电子会和残余气体分子碰撞，产生正离子。这些正离子在电场中会反向运动，再次轰击产生电子，这个过程称为离子反馈（ion feedback，ifb）。由于正离子反向运动是需要时间的，所以离子反馈所产生的信号与真实信号本身并不会叠加，反而成为了噪声/杂峰的重要来源。离子反馈（ion feedback，ifb）过程示意图而低真空度下较高浓度的气体分子是客观存在的，因此相比于控制离子生成，更为明智的做法是控制生成离子的走向。但如今四级杆及离子阱质谱仪一般采用的电子倍增器（em），却并没有办法解决这一问题。 新探测器技术的出现，成为了质谱仪小型化的一个关键。 小质谱仪不要慌，滨松gen3 mcp来了微通道板（mcp）也是应用于质谱仪中的一种常用探测器，特别是tof-ms。但传统的两片结构的mcp（见下图a）和电子倍增器（em）等其他传统质谱探测器一样，残留的气体分子也会发生电离生成正离子，并返回mcp形成离子反馈。不过，滨松最新推出的拥有三级结构的mcp，通过实现控制离子走向的策略，成功解决了上面说到的问题。传统两片结构（bi-planer mode）和滨松最新三级结构（triode mode）mcp的结构和电位对比滨松最新推出的适用于小型质谱仪的gen3 mcp 滨松gen3 mcp采用了这样的结构设计：在mcp出口和打拿极之间加入栅网电极构成三级结构，栅网电极作为阳极（负高压模式下接地），后端打拿极和mcp入口则被设置为等电位，这样残留的气体分子电离生成的正离子会从栅网电极向打拿极运动，并被打拿极俘获。这种三级的创新结构设计可以避免电离正离子返回mcp，从而在源头上解决了暗电流的问题。下图是三级结构的滨松gen3 mcp和传统两级mcp电流输出结构在不同真空度下的实验数据对比。传统两片结构（bi-planer mode）和滨松最新三级结构（triode mode）mcp的实测噪声（暗电流）对比 可以明显的看出，在105增益下，传统的2片mcp电流输出型组件在真空度高于10-3pa的情况下即会发生离子反馈。而对于三级结构的gen3 mcp，即使真空度降低到1pa，仍然不会发生离子反馈。凭借在低真空度下的优异表现，加上小巧的尺寸（有效面积直径：14mm），滨松gen3 mcp将会大大释放束缚在质谱仪真空系统上的缰绳，方便开发者开发更为灵活便携、功耗更低、更适合现场使用的小型质谱仪。滨松gen3 mcp有效面积直径：14mm滨松致力于光电技术探索60余年，在质谱探测器的研究也已有40余年的历史，可为质谱应提供mcp、em、离子化光源等产品。2018年我们推出了，并也将继续推出更多应用于质谱的新品（文章底部的小编传送门中，有部分新品链接）。希望通过探测技术的原始创新，从最底层技术出发，稳定而坚实地推动最终质谱应用的发展。

p 　　在癌症研究领域，质谱成像(MSI)技术是前景广阔，但目前该技术的运用还受原始数据预处理、图像精确度及图像识别能力等诸多问题的限制。 /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/806a5453-baab-47e2-9e92-be078e5686fe.jpg" / /p p 　　质谱成像技术主要是利用质谱直接扫描生物样品，分析化学成分在细胞或组织中的结构、空间与时间分布信息。这种成像方法不局限于特异的一种或几种蛋白质分子，可在生物组织样本中找到每一种蛋白质分子，并提供它们在组织中空间分布的精确信息。早在几年前，就有科学家提出利用该技术来确定生物组织类型的构想，但却一直没有设计出实用有效的方法。 /p p 　　而这项最新方法利用解吸电喷雾电离技术来优化数据预处理，提高图像精确度，并通过提取生物组织特定的分子印记来强化不同生物组织类型的生化特性，以增强图像识别能力。 /p p 　　研究人员表示，利用新开发的集成生物学信息平台，可将质谱成像技术获得的大量人体组织的具体信息数据，用于构建各种类型的组织数据库。通过多样本分析，并与传统的组织学分析结果进行比较，计算机就可以学习识别不同类型的组织，从而使癌变组织的解析变得相对简单高效。他们将自己设计的工作流程用于直肠结肠癌组织的检测，效果良好。 /p p 　　与标准组织学动辄几周才会得出完整结果的检测手段相比，利用质谱成像技术进行单一检测，仅需几小时即可获得更详尽的信息，不仅会显示组织是否发生癌变，还会显示癌症是哪一种类型和亚型。这些信息对于医生们选择最有效的治疗方法十分重要。 /p p 　　研究人员指出，自 19 世纪后期染色技术用于显示组织结构以来，对组织病理学样本的分析方法鲜有变化。直到今天，染色法依然是医院组织学分析的主流手段，并且变得越来越复杂，耗费也越来越高。而质谱成像技术可能改变组织学的基本范式，科学家将不再根据组织的结构，而是根据它们的化学成分来定义组织类型。将来的检测不再依靠专家的眼睛，而是以海量数据为基础，仅一个检测所得到的信息就远比多个传统组织学检测所得到的更多。 /p p 　　质谱成像技术无疑是完全自动化的组织学分析手段的新征程，而科学家不断研究的新技术，也在逐渐完善质谱成像技术实际应用所遇到的新课题。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/928073e4-589a-4fe5-a89d-b3ab900444a3.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　融智生物的新一代全谱可定量飞行时间质谱技术 /p

沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）近日在北京成功举办了以“质谱技术在蛋白表征及高级结构中应用”为主题的技术研讨会，吸引了60余位来自国家蛋白质组中心、中国食品药品检定研究院、中国科学院、清华大学、北京大学、军事医学科学院、中国农业科学院等知名高校、科研院所、分析测试平台及生物制药企业等相关领域的研究人员参加了会议。 研讨会的主旨为 “提升国内蛋白表征领域对蛋白高级结构研究的认知”，涵盖三大议题：蛋白药物深度结构表征所需要的质谱技术与生物信息学软件、氢氘交换（HDX）技术及IMS在结构生物学特别是表位学研究、蛋白质相互作用研究领域的最新进展及SONAR技术在蛋白质鉴定和非标记定量蛋白质组学研究中的进展。 会上国际知名学者、日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士指出，氢氘交换质谱（HDX MS）逐渐成为蛋白质高级结构研究不可或缺的技术，并介绍了氢氘交换质谱技术及其在表位学和蛋白相互作用研究上的具体应用 。同时对其最近发表在Nature Communication上的题为《Haem-dependent dimerization of PGRMC1/sigma-2 receptor facilitates cancer proliferation and chemoresistance》论文的研究成果进行了汇报，获得了与会科研学者的一致高度评价。 日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士做大会报告 沃特世（Waters® ）总部制药业务部高级市场拓展经理Asish Chakraborty博士对生物制药行业普遍关注的宿主蛋白残余测定进行了报告演讲，并介绍了使用通用型UPLC/MS分析对生物治疗性蛋白质中的HCP进行全面鉴定和定量。此分析方法采用在线二维液相色谱法分离多肽，然后利用高分辨率、高质量准确度的质谱仪进行蛋白质鉴定和定量。另外，Chakraborty博士对当前氢氘交换质谱方案的新进展也作了更新介绍。 沃特世公司总部Asish Chakraborty博士做大会报告 来自沃特世亚太区的高级科学家陈熙博士作了题为“非变性质谱技术及IMS行波离子淌度质谱技术在蛋白质高级结构研究上的应用进展”的精彩报告，介绍了行波离子淌度高分辨质谱技术在生物药分析上的最新应用进展，成熟的行波离子淌度分离技术为常规高分辨质谱增加了更多一个维度的分离能力，在蛋白质药物常规结构表征如二硫键错配、氢-氘交换质谱技术进行蛋白质药物高级结构和动态变化研究以及HCP(宿主细胞蛋白)残留的鉴定和定量上发挥着重要作用。 沃特世亚太区高级科学家陈熙博士做大会报告 沃特世中国应用科学家殷薛飞博士作了 “最新DIA质谱技术-SONAR在非标记定量蛋白质组学研究中的应用”的报告。殷博士介绍的 SONAR数据采集模式于今年9月发布，科学家们只需执行一次进样即可完成更准确的定性和定量分析，对复杂样品中脂质、代谢物和蛋白质的定量和鉴定，可免去采用MS/MS方法分析时通常需要额外进行方法开发的麻烦。 大会还邀请了来自美国Genentech的蛋白质化学部科学家甘雨田博士分享了她运用蛋白质组学思路进行生物药物研究开发的思路与实践，甘博士还介绍了她今年8月发表于Nature Biotechnology上的ISDetect快速自动蛋白末端质谱检测法，引起与会人员的强烈兴趣。 会议最后 ，沃特世中国生物制药高级经理宋兰坤女士作了“LC/MS平台化方案助力生物药研究开发”的报告，并对会议进行了总结。宋经理说：“质谱技术是蛋白质研究中不可取代的工具，其在蛋白质常规表征及高级结构研究中均有很好的应用方案及研究文献, 为揭示生命科学的奥秘发挥着越来越重要的作用。作为全球生物制药领域解决方案顶尖供应商，沃特世公司为生物药物产业界及蛋白质研究相关科学领域提供先进的仪器和技术。希望本次会议的议题可以激发与启迪科研工作者的思路，为生物药物产业的从业人员搭建一个学术讨论与经验分享的平台。 会议同期展出的蛋白科学研究先进生物技术墙报

石油化工行业在国民经济发展中具有重要意义，是我国的支柱产业之一。而石油化工产品的品质如何，就需要分析检测技术来把关。因此，分析检测技术成为石油化工行业高质量发展的重要支撑。石油、化工相关的产品种类丰富，各类指标参数复杂，涉及到名目繁多的检测方法，如色谱法、质谱法、光谱法等。因此，在即将召开的第七届石油化工分析技术及应用新进展网络会议，特别邀请了多位嘉宾分享色质谱分析及其新技术在石化中的应用。部分报告预告如下：中国石油大学（北京）教授 韩晔华报告题目：《面向石油分子工程的石油组学分析》点击报名韩晔华，教授，博士生导师。毕业于北京大学分析化学专业，美国加州大学伯克利分校联合培养博士。现就职于中国石油大学（北京）化学工程与环境学院，重质油国家重点实验室，校青年拔尖人才、青年骨干教师。专业领域为质谱分析、石油分子工程。作为负责人主持9项国家级、省部级自然科学基金。在分析化学、能源化学领域的国际知名期刊发表学术论文45篇，包括多篇TOP期刊论文及封面论文，撰写英文专著篇章2部，担任《Separation Science Plus》副主编、《石油科学通报》 副主编、《Petroleum Science》青年编委。报告摘要：本报告分析石油组学研究所遇到的研究瓶颈，并介绍通过分析方法的创新将石油化学、催化化学、地球化学在分子层面进行有效链接并获得新发现、新认知。石油组学的本质是分子表征与构效关系研究，报告人通过质谱离子化方法的创新，使得更多未知的重组分“被看见”；利用石油分子的序列性，创新性的提出复杂体系中分子结构的集总表征；开发多种数据统计及可视化模型，建立与反应网络的关联。在此基础上，报告人在不同成熟度及海、陆相原油中发现了新型生物标志物，为地质演化及油藏勘探提供新视角；依托新建立的分子表征方法设计分子离子反应、研究实际工艺体系的反应路径，揭示了石油催化加氢脱硫反应机理、催化剂失活机理等，为油品清洁生产及定向转化提供指导。中海油化工与新材料科学研究院高级工程师 黄少凯报告题目：《重油中杂原子化合物分子组成分析方法研究》点击报名黄少凯，博士，高级工程师，现任中海油化工与新材料科学研究院分析表征首席工程师，主要研究领域为原油分子水平表征、原油评价、重油组成与结构分析、重油结构与加工性能研究以及高酸原油腐蚀特性等。2005年3月至2017年1月，在中石化石油化工科学研究院第一研究室工作，历任工程师、高级工程师及课题组组长；2017年1月2022年6月，任中海油炼油化工科学研究院分析表征首席工程师；2022年7月至今，任中海油化工与新材料科学研究院分析表征首席工程师。工作期间，主持2项集团公司级科研项目、12项地级科研项目，参与2项国家自然科学基金科研项目、2项集团公司项目；发表论文12篇，获得软件著作权3项，参与1项石化行业标准（排名第5）和1项炼化公司标准制定等。报告摘要：介绍工作内容。采用酸/碱改性固相萃取柱分离重油中含氧、氮（中性氮与碱性氮）化合物，采用甲基衍生化方法将硫化物转化为强极性的甲基锍盐分离重油中含硫化合物；然后采用超高分辨率的傅里叶离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）结合电喷雾电离源（ESI）得到杂原子化合物的精确分子量，进而获得化合物的分子式，由化合物的质谱峰强度归一化计算得到相对含量。试验结果表明，采用样品预处理技术结合超高分辨率的FT-ICR MS可以得到重油中杂原子化合物的分子组成数据；采用上述分离方法对含氧、氮和硫化合物进行分离富集，其回收率分别为90%以上、80%以上和80%以上；FT-CRT MS测试含氧、氮和硫化合物的相对标准差小于5%。中国石油石油化工研究院工程师 郑方报告题目：《基于色谱质谱技术的石油卟啉形态研究》点击报名郑方，工学博士、理学博士；中国石油石油化工研究院工程师；致力于从分子水平认识石油，尤其是重质油的分子组成，研究石油分子在分离过程中的走向及化学加工过程中的转化规律。在Fuel、Energy & Fuels、Petroleum Science、《燃料化学学报》等期刊发表论文10余篇。报告摘要： 全面认识石油中金属卟啉类化合物的结构形态可以为完善石油加工工艺提供科学依据，有助于认识石油沥青质的分子组成，也可以通过解析石油卟啉的演化过程更加深入了解石油成因等地球化学信息。岛津企业管理（中国）有限公司系统气相专员 李学伟报告题目：《岛津色谱特色技术助力石化高效分析》点击报名李学伟，岛津企业管理（中国）有限公司 系统气相专员，从事气相色谱相关工作十余年，在石油化工领域系统气相定制方案上有着丰富的工作经验。现主要负责岛津系统气相产品线技术支持和应用方案推广工作。报告摘要：主要介绍岛津气相色谱自动进样系统、检测器系统、数据处理软件等特色技术在石油化工领域的应用，以及超临界流体色谱（SFC）和GC-FID联用技术，实现各种油品中烃族组分的高效分析。北京莱伯泰科仪器股份有限公司应用工程师 刘石磊报告题目：《热裂解在石油化工分析中的应用》点击报名刘石磊，北京莱伯泰科仪器股份有限公司应用工程师，主要负责莱伯泰科旗下品牌CDS热裂解产品线的应用研究与技术支持。 从事分析仪器应用等相关工作15年，工作经历主要围绕GC、GCMS的应用支持。报告摘要： 主要介绍热裂解仪在石油化工材料分析中应用，和热裂解仪在石油化工催化裂解中应用。SCIEX中国首席应用专家 李立军报告题目：《SCIEX 液质技术在石油化工行业有效成分分析与表征的典型应用案例分享》点击报名李立军，毕业于北京大学医学部，作为国内最早一批技术专家进入质谱分析行业，在食品、环境、药物及法医毒物市场等小分子领域拥有超过35年应用技术工作经验。报告摘要：主要介绍SCIEX液质技术在石油化工行业有效成分分析与表征的典型应用： 1、SCIEX QTOF液质技术靶向、半靶向、非靶向化合物鉴定流程介绍；2、油田开采过程中钻井液聚合物有效成分的分析；3、石油钻井液样本中表面活性剂分析；4、PET（聚对苯二甲酸二乙醇酯）解聚反应产物定性分析。第七届石油化工分析技术及应用新进展网络会议为促进石油、化工企事业单位高质量发展，推动分析检测技术进步，促进科技成果转化，同时也给石油化工相关工作者提供一个学习交流的平台，仪器信息网将于2023年5月31日-6月1日举行第七届石油化工分析技术及应用新进展网络会议，力争把最新的政府决策、最前沿的行业信息、最新的技术进展与研究成果呈现给大家。会议主办方：仪器信息网参会指南：1、点击会议官方页面（https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/petrochemical2023）进行报名。扫描下方二维码，进入会议官网报名2、报名开放时间为即日起至2023年6月1日。3、报名并审核通过后，将以短信形式向报名手机号发送在线听会链接。4、本次会议不收取任何注册或报名费用。5、会议联系人：高老师（微信号：iamgaolingjuan 邮箱：gaolj@instrument.com.cn）6、赞助联系人：周老师（微信号：nulizuoxiegang 邮箱：zhouhh@instrument.com.cn）

大家好，本周为大家分享一篇李惠琳课题组最近发表在Mass Spectrometry Reviews上的综述，Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes1。结构生物学的快速发展极大地促进了蛋白结构表征工具的开发。其中，基于质谱的分析方法凭借其快速、灵敏、高通量的优势从中脱颖而出。相比于原子水平的高分辨结构表征工具如X-射线晶体学、核磁共振（NMR）、冷冻电镜（Cryo-EM）等，基于质谱的分析方法能够有效地补充蛋白动力学结构变化的信息，并且不受蛋白纯度、分子量大小的限制。而相较于低分辨的蛋白表征工具如圆二色光谱、动态光散射等，基于质谱的分析方法能够提供更高的肽段或残基水平分辨率，获取额外的序列、翻译后修饰（post‐translational modifications, PTMs）、局部空间结构等信息。常见的结构质谱包括：氢氘交换质谱（hydrogen‐deuterium exchange MS, HDX-MS）、交联质谱（cross‐linking MS, CX-MS）、表面标记质谱（covalent labeling MS, CL-MS）等。已有相当多的文献对这些方法进行了详细的介绍2,3，在此不再赘述。而此篇综述将重点介绍非变性至上而下质谱（native top‐down MS, nTDMS）在蛋白及其复合物结构表征中的应用。在过去的十年，非变性质谱（native MS, nMS）特别是nTDMS发展迅速。nMS作为一个桥梁将蛋白质组学与结构生物学相连，其保留非共价相互作用的特性使其广泛用于蛋白复合物四级结构表征，如推断亚基组成、化学计量比、亚基排布等。然而，对于一些深层次的结构信息，如氨基酸序列、PTMs、配体结合位点、亚基结合界面等，仅靠单一的nMS是无法获取的。与之对应的，变性条件下的自上而下质谱（TDMS）能够在完整蛋白水平下直接获得序列以及PTMs信息，虽然有助于PTM的准确定位以及蛋白、蛋白异质体（Proteoform）的鉴别，但却丢失了涉及非共价相互作用的高级结构信息。受限于质谱仪器的发展，在早期，nMS与TDMS通常在两个独立的实验中进行，随着质量分析器以及多种活化/碎裂方式的开发，nMS与TDMS的能够有效的结合，充分发挥各自的优势，在实现多层次结构信息获取的同时，也在不断挑战更加复杂的生物体系，如核糖体、膜蛋白、内源蛋白混合物等。实验设计nTDMS已成为表征蛋白质和复合物的初级到高级结构的重要工具。随着蛋白质样品的大小和复杂性的增加，用于nTDMS的仪器不仅需要符合某些特定标准，还需要不断提高其性能以满足这些增加的需求。nTDMS分析中几个关键的步骤包括：样品前处理、ESI离子化、二级碎裂、质量检测以及数据处理。样品前处理为了维持蛋白的自然状态，通常需要在生理环境中进行nMS分析。然而，缓冲液中的非挥发性盐会产生大量盐簇并与蛋白离子形成非特异性加合物，从而抑制离子信号、降低检测的准确度和灵敏度。因此，样品前处理过程中最重要的环节就是除盐。然而适当的离子强度有助于维持蛋白的三维结构，所以通常的步骤是对蛋白进行缓冲液置换，将蛋白置换至醋酸铵或碳酸氢铵等挥发性盐溶液中。目前已开发了多种在线或离线的除盐方法，详细内容的可在综述原文中查看，此处不再赘述。除了使用非挥发性缓冲盐，减小ESI喷针孔径大小也可以提高系统耐盐能力。碎裂/活化方式二级碎裂方式是实现nMS到nTDMS的关键。常见的活化方式按照原理可分为三类：基于碰撞（CID, SID）、基于电子（ECD, ETD, EID等）以及基于光子（UVPD, IRMPD）的活化/碎裂方式。值得注意的是，CID与IRMPD都属于慢加热的活化方式，能量累积的非常慢，以至于在发生碎裂之前已经进行了能量重排，一些较弱的或者不稳定的键会优先发生断裂，最终导致非共价相互作用在活化的过程中被破坏。而SID、ExD与UVPD则属于快加热的活化方式，碎裂发生在能量重排之前，非共价相互作用得以在这一过程保留下来，碎片化程度受到非共价相互作用的限制，因此可被用于表征蛋白的空间结构。此外，将多种活化方式的结合或与离子淌度技术串联也是获取多层次结构信息的关键。质量检测与变性条件下的质谱分析相比，蛋白复合物在天然环境下通过电喷雾电离产生的电荷数相对较少，因此需要具有较大m/z 范围的质量分析仪（高达m/z = 20,000 Da甚至更高）。最初，nMS分析高度依赖基于飞行时间（time of fight, TOF）质量分析器，因为TOF具有理论上无限的m/z范围。近年来，高分辨质量分析器如轨道阱（Orbitrap）和傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）为生物大分子的nTDMS分析带来了新的活力。在综述中，我们简要介绍了每种质量分析器的最新进展，并重点强调了FTICR和Orbitrap在nTDMS分析中的发展和应用。数据处理除了基本的硬件设施，配套的数据处理软件也十分重要。nTDMS数据处理流程通常包括以下4个步骤：同位素峰选取、去卷积、数据库搜索、验证和可视化。正文中，我们对每个步骤进行了简要描述，并重点介绍用于数据库搜索和异质体鉴别的软件。多层次结构信息的获取得益于多种活化/碎裂方式的开发，nTDMS分析可同时获得多层次的结构信息（图1）。主要有以下两种策略：第一种策略，完整蛋白复物（MS1）首先被CID或SID碎裂至亚基（MS2），亚基可进一步碎裂肽段（MS3），在MS1及MS2中可获蛋白复合物结合计量比、拓扑结构、蛋白异质性等信息，在MS3阶段则可获取蛋白序列、PTMs定位以及异质性来源等信息。第二种策略则是完整蛋白复合物（MS1）直接被UVPD或ExD碎裂成肽段（MS2），受益于UVPD以及ExD独特的碎裂方式，发生碎裂的区域主要位于蛋白复合物的表面可及区，而未发生碎裂的区域可能位于蛋白复合物的核心区域或参与亚基相互作用界面。不同的碎裂情况反映不同的空间结构，带有配体的肽段碎片可以用于配体结合位点的定位。综述中，我们详细阐述了如何利用nTDMS获得蛋白复合物的多层次结构信息以及如何将碎片信息与结构信息相关联。图1. nTDMS可提供的多维度结构信息复杂生物体系中的应用蛋白质的空间结构决定了其生物功能，而蛋白质-蛋白质/配体相互作用是大多数生物进程的基础。通过突变、翻译后修饰、或者与金属、小分子配体、蛋白质、DNA、RNA等分子发生共价或非共价的相互作用，蛋白质功能在活细胞中不断受到调节。随着MS仪器、方法的不断开发和数据处理软件的逐渐成熟，nTDMS已被广泛应用于各种生物系统，从小蛋白质、蛋白质-配体复合物到大分子组装体，如膜蛋白、蛋白酶体、核糖体、病毒衣壳，甚至是内源性蛋白混合物。它们中的许多都是极具挑战性的体系，即便是采用NMR、X-射线晶体学或Cryo-EM等生物物理方法分析也是非常困难的。因此，来自nTDMS的见解对于理解这些蛋白质和复合物至关重要。在这里，我们总结nTDMS在所有生物体系中的应用实例，旨在全面了解nTDMS在解决生物学问题方面的潜力。小蛋白的结构表征和区分最初，nTDMS主要用于50 kDa以下单体蛋白的结构表征，大部分的研究都是围绕蛋白质气相结构与溶液相结构对比展开的。根据nTDMS的碎裂情况，推断蛋白的气相空间结构，并与NRM获得的溶液结构进行对比。此外，如果在二级碎裂前增加离子预活化有助于蛋白分子的展开，以便研究蛋白气相展开路径以及获取蛋白质内部空间结构信息。得益于碎片离子对蛋白空间结构的高度敏感性，nTDMS还被用于区分不同蛋白亚型、蛋白突变体的结构差异。蛋白-小分子配体相互作用随后，nTDMS应用到了蛋白-配体复合物中，不同的配体类型适合不同的活化/碎裂方式，除了金属离子、RNA/DNA等以静电作用为主的蛋白配体能够在CID活化时存活，大部分复合物的碎裂都需要选择ECD或UVPD等方式。nTDMS可用于蛋白-配体结合计量比、亲和力、结合位点、作用机制、结构动力学/变构效应的研究。它是一种强大的结构表征工具，其在抑制剂筛选、酶催化监控、RNA-蛋白质互作机制的应用实例在正文中已有详细的介绍。蛋白-蛋白相互作用随着仪器设备的快速发展，nTDMS已应用到更大的体系如蛋白-蛋白复合物，通过组合不同的活化/碎片化技术，在一次实验中可以获得多层次的结构信息。nTDMS可以帮助区分不同的蛋白异质体，并在完整复合物、亚基、肽段三个水平上确定异质性的来源。蛋白的异质性与其生物学功能密切相关，通过调整蛋白的异质性可以实现蛋白功能的转变，具体的应用案例已在正文详细介绍。除此之外，nTDMS还可以用作蛋白-蛋白复合物结合界面、气相展开以及深层次结构探索。治疗性抗体和抗原-抗体复合物在过去的几十年中，治疗性抗体已成为最受欢迎的候选药物之一，它们的高特异性和低副作用促进了治疗性抗体的快速增长。在综述中，我们还详细地介绍了nTDMS在治疗性抗体和抗原-抗体复合物体系中的应用。nTDMS可用于抗体可变区的测序、具有不同药物计量比（DARs）的抗体耦联药物的结构表征、以及抗体-抗原复合物中互补决定区及抗原表位区的鉴别。膜蛋白无论是对于传统的结构表征工具如：X-射线晶体学、NMR还是nTDMS，膜蛋白的结构表征一直以来面临着诸多困难。膜蛋白具有低丰度以及低溶解性等特点，最常见的方法是利用与nMS兼容的膜模拟物如：去污剂胶束、纳米微盘等去溶解膜蛋白，在nTDMS分析时再将膜蛋白从胶束中释放出来，释放出的蛋白可在nTDMS中进一步碎裂获取结构信息。具体的实验流程和应用实例可在综述正文中查看。大分子组装体正文中，还介绍nTDMS在极具挑战性的大分子组装体如：核糖体、蛋白酶体、病毒衣壳中的应用实例，这些生物体系普遍存在的问题是分子量非常大（接近MDa），且具有较高的异质性。对这些大分子机器进行nTDMS分析要求仪器具有较高的质量范围以及分辨率。大分子机器的结构表征充分说明nTDMS方法无论在深度还是广度上都有极大的提升。Native top-down MS蛋白质组学值得注意的是，当质谱前端结合非变性分离技术，如native GELFrEE，尺寸排阻色谱，毛细管区带电泳，离子交换色谱等，nTDMS还可以在靶向模式或发现模式下用于复杂蛋白质组的高通量分析，如内源性蛋白混合物。nTDMS分析最大的优势在于它能区分不同的蛋白异质体，并对每种蛋白异质体进行结构表征，这是其他在肽段水平进行分析的结构质谱法如：HDX-MS, CL-MS所无法实现的。总结与展望总之，在这篇综述中我们重点介绍了nTDMS的最新进展和在不同生物体系中的应用，强调通过nMS与TDMS结合可以获得额外的多层次结构信息。新技术的出现以及仪器的进步使nTDMS能够应用于结构生物学中日益复杂的生物样本体系，包括蛋白质配体、多聚蛋白复合物、大分子组装体和内源性复合物。尽管这样，nTDMS分析仍面临着的挑战，包括但不限于前端的样品分离、离子化、去溶剂化、高质荷比分子传输、异质性样本的分析以及软件的开发。未来nTDMS将与其他的一些结构表征方法相结合以获取更加全面的结构信息。正文中对未来发展趋势进行了讨论并提到了其他一些令人兴奋的创新技术如：基于MALDI离子源的质谱成像技术用于蛋白原位分析、电荷检测质谱（CDMS）用于异质性样本分析，多重技术的结合将为蛋白质复合物的nTDMS研究开辟新的道路。我们希望这篇综述能让读者更好地理解nTDMS提供的独特结构信息，并推动该方法的广泛应用。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. 参考文献1.Liu RJ, Xia SJ, Li HL. Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. Mass Spec Rev. 2022 e21793. https://doi.org/10.1002/mas.217932.Britt HM, Cragnolini T, Thalassinos K. Integration of mass spectrometry data for structural biology. Chem Rev. 2022 122(8):7952-7986. 3.Liu XR, Zhang MM, Gross ML. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: fundamentals and applications. Chem Rev. 2020 120(10):4355-4454.

截至2020年，全球共有76个多肽类药物被批准上市，7000多个活性多肽被发现，约150个多肽药物进入临床试验，在过去20多年中，平均每年被批准的多肽药物约3个。微球、脂质体、聚乙二醇（PEG）修饰等方法的深入应用解决了多肽药物稳定性差、体内易降解、半衰期短等成药性差的问题，促进了多肽药物的开发利用。多肽药物药效广泛，临床上以慢性病治疗为主，例如罕见病、肿瘤、糖尿病、胃肠道、骨科、免疫、心血管疾病等。国内外药典将合成多肽类药物列入化药的范畴进行杂质的控制。欧洲药典规定合成多肽含量在0.5%以上的相关杂质需进行定性分析，对含量在1%以上的相关杂质进行定量分析并考察其毒副作用。2007年国家食品药品监督管理局发布了《合成多肽药物药学研究技术指导原则》，指出合成多肽原料药中工艺杂质的来源和一般化学药物有所不同，其可能的工艺杂质如：缺失肽、断裂肽、去酰胺多肽、氨基酸侧链的不完全脱保护所形成的副产物、氧化肽、二硫键交换的产物、非对映异构的多肽、低聚物和/或聚合物及合成中所用的毒性试剂和溶剂等。 多肽含有二硫键、裸露的氨基和羧基，容易因分子间二硫键或氨基羧基间脱水形成共价聚合物。共价键形成的聚合物杂质可能存在较大免疫原性风险，在多肽类药物制剂质量研究和新药申报中应予以重点关注。质谱分析、氨基酸组成分析和氨基酸序列测定是合成多肽药物及杂质结构确证最常用的技术手段。 岛津解决方案 ● 分析仪器岛津液相系统Nexera LC-40 +高分辨质谱仪LCMS-9030 ● 分析条件流动相为水：乙腈：TFA=60:40:0.2流速：0.5 mL/min等度洗脱柱温：25℃质谱：离子源：ESI（+）扫描范围：m/z 100 ~5000 多肽药物应用案例一STN聚合物杂质结构鉴定图1. 注射用STN破坏样品HPLC色谱图（UV 210 nm）图2. STN聚合物杂质可能的聚合方式 通过STN聚合物杂质精确质量数预测其分子式，结合多肽的质谱峰归属对STN聚合物杂质进行结构推测（如图2）。STN结构中含有一对二硫键，综合判断其聚合位点为分子间二硫键。 多肽药物应用案例二TJN聚合物杂质结构鉴定图3. 注射用TJN破坏样品HPLC色谱图（UV 214 nm） 图4. TJN聚合物杂质MS2质谱图 使用岛津精确分子式预测工具Formula Predictor对TJN聚合物杂质进行分子式预测，其分子式预测结果恰好相当于两分子TJN脱水，因此推测其聚合位点为两分子TJN的氨基端和羧基端缩合生成肽键。TJN为20肽，其游离氨基端为苯丙氨酸，游离羧基端为亮氨酸。结合TJN二聚体的推定氨基酸序列进行二级质谱碎片归属，TJN聚合物MS2质谱图中识别出多种特征碎片。特别是y19和b21碎片的存在证明聚合位点为亮氨酸（L）和苯丙氨酸（F）缩合而成的肽键。 结论随着我国成为国际人用药品注册技术协调会（ICH）成员国，药品的技术标准逐步与国际接轨。同时随着我国药品一致性评价工作的全面开展，合成多肽药物杂质结构鉴定将面临巨大的技术挑战。岛津公司采用尺寸排阻色谱法建立合成多肽药物的聚合物分析方法，并通过高分辨质谱LCMS-9030测定聚合物的准确质量数推测其分子式，同时结合MS/MS特征碎片推测聚合物杂质的结构。本文展示LCMS-9030在多肽药物的两种主要聚合方式（二硫键和肽键）鉴定中的应用。岛津液相色谱四极杆飞行时间串联质谱LCMS-9030具有高质量准确度，高分辨率的性能优势，是合成多肽药物杂质一级结构鉴定的强有力工具。 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Microfluidic Platform for Time-Resolved Characterization of Protein Higher-Order Structures and Dynamics Using Top-Down Mass Spectrometry [1]，文章的通讯作者是北京大学生物医学前沿创新中心的王冠博教授和中国科学院深圳先进技术研究院的门涌帆副研究员。　　蛋白质的高阶结构和动力学特性对理解蛋白质的生物学功能和揭示其潜在机制至关重要。自顶向下质谱法(Top-down MS)在完整蛋白水平和肽段碎片水平都能获得结构信息。非变性Top-down MS可以分析蛋白质复合体的结构以及完成亚基鉴定和修饰分析。自顶向下氢/氘交换质谱(Top-down HDX MS)为构象或结合界面分析提供了高空间分辨率，并实现了构象特异性表征。微流控芯片可以为这些质谱工作流程的前端反应提供优越的平台。然而，目前大多数质谱微芯片装置是为Bottom-up或Top-down蛋白质组学设计的。本文中，作者提出了一种用于蛋白质高阶结构和动态Top-down MS分析的芯片设计策略。它适用于时间分辨的非变性质谱和HDX质谱，该设计旨在有效电离完整的蛋白质复合物，灵活控制多种反应物流动，并在较大的流速范围内精确控制反应时间在亚微升/分钟。本文通过对单克隆抗体、抗体-抗原复合物和共存蛋白构象等体系的分析来验证该装置的性能。　　TDK-MS(Top-down and kinetic MS)芯片的结构如图1A所示，该方法可以有效电离完整的蛋白质，包括单克隆抗体(mAb)和抗体-抗原复合物(图1 B, C)。　　图1. 完整蛋白质和蛋白质复合体在非变性条件下的高效电离　　虽然分析蛋白质组合化学计量学和监测构象变化需要保持蛋白质高阶结构和非共价相互作用的完整性，然而为了推导结构信息或在串联MS中展开蛋白质以提高碎裂效率，往往需要不同程度的变性来产生亚复合体，因此变性剂的浓度和变性的时间对变性程度至关重要。本文中，作者采用交错人字微结构(Herringbone microstructure, HM)(图2A, B)，并对其性能进行了评估(图2C−E)。如此高的混合效率为进一步微型化芯片混合模块提供了可能。在监测Mb的变性时，作者使用TDK-MS芯片和商用混合三通管平行混合holo-Mb溶液(5 μM)与乙腈(ACN)，并比较它们在混合比例变化时的响应(图2F)。TDK-MS芯片在非变性和变性条件之间切换的快速响应通过NIST mAb的变性得到了证明，在向NIST mAb溶液中添加甲酸后，响应时间小于5分钟(图2G)。　　图2. 高效混合和快速响应的流体控制　　微芯片的灵活通道设计允许引入独立控制的溶液。例如，尽管酸和有机溶剂都能诱导变性，但这两种变性剂同时存在时，对变性途径的影响是不同的。Mb和Hb是血红素蛋白，其中血红素基团分别非共价连接在1条多肽链和4条非共价组装链上，因此这是研究共存复合体解离动力学和亚基构象变化的理想模型。将5 μM holo蛋白溶液与ACN和FA按一定的混合比例依次混合，可以通过解离产物的出现和蛋白质离子电荷态分布的变化来表征复杂的解离和蛋白质的展开。在固定ACN浓度下，随着FA浓度从0.01增加到0.3% (v/v)，依次观察到的主要现象是血红素丢失、apo-Mb展开以及折叠的holo-Mb转化为展开的apo-Mb(图3A)。相比之下，在FA浓度恒定的情况下，当ACN从1增加到50%时，Mb主要表现为血红素损失，只有中等程度的apo-Mb展开，这可能是由于展开的部分迅速聚集(图3B)。　　图3. (A)增加FA浓度，固定ACN浓度和(B)增加ACN浓度，固定FA浓度时获得的Mb和Hb的质谱图。　　在HDX MS检测中，TDK-MS芯片提供了快速和有效的氘代及淬灭，精确控制HDX反应时间，并在2H-标记形式下高效电离完整蛋白质(图4)。　　图4. 2H标记完整的(A)Mb、(B)Hb α亚基和(C)Hb β亚基在不同反应时间下的HDX质谱图　　由于过大的流速不利于电离效率，并且有可能会增加堵塞或流动中断的风险，因此流速应保持在最佳范围内，这又限制了混合通道中HDX时间的可调节范围，从而影响了HDX动力学分析的灵活性。为了解决这一问题，作者设计了一个具有多个不同长度反应通道的混合模块，在不更换芯片的情况下，除了改变流速外，还可以通过通道切换在更大范围内调整反应时间。在原型芯片中，5个不同长度的通道可以在对蛋白质电离和流动稳定性都最优的流速下，产生从几秒到几分钟不等有效的HDX时间(图5)。　　图5. Top-Down HDX MS 分析　　本文中作者开发的策略将有利于生物大分子结构的精细分析，并有助于质谱微芯片的方法开发。

伴随着医学技术的迅猛发展，质谱技术快速走进人们的生活，特别是在医学中的应用越来越广泛，质谱技术在临床中快速鉴定细菌的成果颇为显著。近年来，全国各大检验室大力引进前沿的检测技术，主要针对微生物领域进行精准检测，质谱技术检测具有操作步骤简单、程序自动化和结果准确率高的优点，能够有效对微生物进行鉴定，此外，质谱技术具有高通量、高灵敏度和高特异性，基于此特点，该技术应用在临床微生物检测上，取得了惊人的效果。总而言之，质谱时代已经到来，打破了传统的微生物鉴定局限，为我国的医疗临床事业作出了巨大的贡献。一、质谱技术的应用原理及优势大量实验研究结果显示，质谱技术的工作原理很复杂，主要是对被检测的标本离子质荷比进行详细测定，采用标本与激光辐射基质混合点相结合形成结晶的方式，力争将标本通过基质分子吸附的方式将其电离，形成完全不相同的带电离子。同时，在带电离子的动能加速下，快速形成聚焦，从而进入质谱技术分析仪器科学分析。在微生物的检验中，质谱技术在一定程度上具有明显的优势，其主要优点在于检验时对标本的要求很低，不像传统的检验需要将标本进行分离甚至是提纯，质谱技术可以直接进行点样。与此同时，质谱技术检验微生物的准确性非常高且操作方便快捷。二、质谱技术在鉴定检测中的具体应用（一）细菌鉴定检测质谱技术应用于临床检验时可以对原始的样本进行检测，也可以对已经分离的纯菌落进行检测。实践证明，临床检验标本时采用质谱技术进行检测，其标本可以是原始样本，还可以是通过相关技术已经分离的纯菌落。临床上，质谱技术在对革兰氏阳性、阴性细菌进行检验鉴定时，其检验结果的准备性很高，但是，同样的标本采用原始检验方法进行对比，其结果相差很明显。在用原始方法与质谱检验方法检验革兰氏细菌的结果对比中，质谱技术检验结果明显比原始技术检验结果准确度高，同时采用质谱技术检验获取结果的时间更短，二者检验结果的差值在统计学上具有一定的存在意义。除此之外，质谱技术在细菌鉴定检测中还有一个特殊的优势，即能够将相同或相近的菌株准确区分开，从而快速鉴定出多种细菌的不同类型、各自的属性及种类等，最主要的是其准确率相当高，能够达到90%-95%左右，此外，在细菌鉴定中还有发现新型病原菌的可能。（二）真菌鉴定检测针对于真菌鉴定检验，质谱技术检验结果对比传统技术具有很高的精准率。在二者的真菌鉴定检测结果中，质谱技术检验结果要明显比传统检验方法更准确，且检测时常较短，其检验结果存在较大的差异性，在统计学上具有重要的存在意义。分析结果表明，因为真菌本身很干燥，不轻易挑选菌落，这种情形能够导致靶点涂菌分布不均匀，再加上检验人员如果在涂菌时涂得过薄，最后影响结晶不能完好形成，基于此特点，原始方法鉴定真菌，其鉴定检测结果与真实结果差异是非常大的。（三）药物敏感性检测临床上，质谱技术还可以对药物的敏感性进行检测，其检测结果具有极高的准确率，而且针对于药物敏感性的检测，质谱技术检验结果用时要比传统技术短很多，可以大幅度降低技术人员的劳动成本。质谱技术与传统技术在药物敏感性的检测中，除了在检测时间和检测结果上有很大的差异性外，在检测范围上也有所不同。传统技术检验范围具有一定的局限性，能够检测极少数的细菌，而质谱技术恰恰相反，可检测的范围十分广泛，且具有检测人工成本低和资源节约的作用。三、质谱技术的发展前景临床上，血液感染时一种十分严重且常见的感染性疾病，该疾病经常需要使用抗生素来治疗，但是由于抗生素使用的不规范，加上不间断的侵入性治疗方案陆续实施，导致每年因血液感染的发病机率持续升高，引起了医学界的高度关注。在过去应用传统的方法检验临床数据时，血培养鉴定结果经常需要很长的时间，进而严重影响治疗的最佳时间，因此，质谱技术应用在微生物检验上，解决了以往医疗上的大难题。大量的临床数据研究结果指出，根据目前的医疗科学技术能够把血液中的致病细菌大量提取出来，然后应用质谱技术检验细菌，对比之前的平板培养技术，其结果更加精准且耗时短。专家指出，有相关学者利用常规技术和质谱技术鉴定血培养结果，得出针对于血培养结果的鉴定还是质谱技术更准确、更快速，且具有明显的统计学意义。四、质谱技术存在的缺陷目前，在现代微生物检验技术中，质谱技术有着诸多优势，对比传统的检测技术，最明显的优势就是检验结果精准且用时很短，同时具有操作简单便捷、程序自动化的特点，但是在临床大量的实际检验中，质谱技术还是存在一定的缺陷，值得相关人员去大力研究。临床上，质谱技术是无法精准检验结构较为特殊的微生物菌种，例如罕见的菌种、新出现的菌种、复杂混合的菌种或与图谱极为相似的菌种，在检验结果上存在着一定误差。质谱技术检验细菌出现这种结果的原因是目前已有的数据库并不完善，现有数据库中已有的标准菌株图谱是有限的，质谱技术的数据库还需要持续不断的完善，因此在微生物鉴定的结果中会产生一定的差异，更无法对新型菌种和特殊菌种进行准确鉴定。除此之外，由于质谱技术刚刚在国内兴起，是一项新型高新技术，在微生物鉴定过程中要求技术人员的操作能力比较强，因技术员的相关知识匮乏、器械不充足或检验手法不熟练等因素都有可能对检验结果形成一定的差异，导致结果不准确。同时，质谱技术检验微生物是一种新型的技术方法，检验时需要采购相应的仪器，价格高昂的检验仪器导致市场推广难以进行。近年来，科学技术的高速发展有效推动了我国社会的进步，其中，作为重要的鉴定技术之一，微生物鉴定技术可以帮助医疗人员进一步实现对于病原微生物的合理理解与充分认识，基于此，医疗工作者在临床过程中可以进一步结合相关结果对于患者的健康情况进行全面分析，对于后续治疗方案的合理制定具有良好的促进意义。近年来，在科学技术的引导下，质谱技术在我国临床微生物鉴定工作中展现出了良好的应用价值，从而受到了广大医疗行业从业者的高度关注。总的来看，与传统微生物鉴定技术相比，质谱技术具有良好的应用优势，可以进一步提升微生物鉴定工作的效率与准确性，然而，该技术仍存在一定的发展空间，因此，为了更好地应用该技术为医疗行业服务，相关研究人员仍需结合大量临床实践合理做好对于质谱技术的探索与改良。

仪器信息网讯，2009年11月7日，由中国质谱学会有机质谱专业委员会与中国分析测试协会联合举办的“2009年中国有机质谱年会”在北京成功召开，会议为期三天，出席会议人数达300人。仪器信息网作为特邀媒体也应邀参加。 　　此次质谱年会为与会代表准备了丰富的报告内容，内容涉及生命科学、医学、药学、环境科学、食品安全、毒物分析中的质谱应用研究以及质谱仪器研发的新技术、新进展等。仪器信息网将进行系列报道。 　　中国科学院大连化学物理研究所许国旺研究员的研究关注的是内源性代谢，代谢组学研究就是用一系列分析化学手段，如色谱、质谱、核磁共振、光谱等，将代谢产物进行分离，然后用数据分析方法把有用的信息进行提取，最后对信息进行生物学解析。与基因组学、蛋白质组学相比，代谢组学研究的是已经发生的改变，而前两者研究的是可能发生的改变，因此在这个意义上说，代谢组学更接近于临床。 中国科学院大连化学物理研究所许国旺研究员 　　但是，目前代谢组学研究面临以下挑战：其一，到目前为止，任何一种分析工具都只能分析代谢组中15%的代谢物 其二，代谢物的结构鉴定一直是一个没有解决的问题。许国旺研究员认为，代谢组学研究要取得进展，分析测试平台首先要取得突破，而其中色谱和质谱是最有前途的技术。 　　依据此思路，许国旺研究员在代谢组学分析手段方面进行了大量的研究，课题组搭建二维色谱-质谱联用仪器，使得代谢产物中亲水化合物与疏水化合物同时分离，并且提高了分辨率，使得以高分辨质谱为核心的集成方法解决代谢组学中未知化合物的定性问题。

质谱分析是通过对待测样品进行电子束、激光等方法照射，使待测样品的原子、分子发生离子化，通过测定质荷比，对待测样品中包含原子、分子的种类、数量、分子结构等进行精密分析的方法。 回顾质谱分析技术的发展历史，不难看到，新的离子化法不断创造着质谱发展的新趋势，让横跨100多年的质谱技术研究，一直充满着活力。具有跨时代意义的离子化方法的诞生，也与质谱分析飞跃性的进步，甚至是业界的繁荣息息相关。 例如基质辅助激光解吸电离法（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization，即MALDI）自上世界80年代末问世以来，将质谱应用提升了一个新台阶，成为目前生物质谱领域研究必不可少的工具，也是当下的一个热门关注点。质谱分析结构示意MALDI法是将能吸收激光能量的低分子有机化合物（下称Matrix）与待测样品混合，通过激光照射，对待测样品进行离子化的方法。在质量分析的同时，可实现对待测样品的成分、分布状态进行图像化的质谱成像。 不过想利用MALDI法进行质谱成像，在与Matrix（有机化合物）的调和、涂布、干燥的前处理的阶段，大概要耗时30分钟，且需要将Matrix在待测样品上均匀涂布。前处理显得十分费时费力。 滨松在5月推出了新研的离子化辅助基板DIUTHAME（Desorption Ionization Using Through Hole Alumina Membrane，是的它的名字hin长̷叫它“丢森”好了~）。这个小东西是利用200nm左右多孔氧化铝（贯穿的、细小的孔呈规则状打开的氧化铝）开发的，面向质谱成像分析的离子化辅助基板。其最大的特点，就是能够大幅缩减质谱成像分析时，待测样品进行离子化所需的前处理时间（仅需3分钟左右），且操作简单。 将待测样品加载到DIUTHAME上，利用毛细血管现象（在细管内侧，液体从管子中上升的现象），使待测样品的分子上升到表面，通过激光照射使其离子化而不破坏分子结构，实现在不使用Matrix的情况下，进行质谱成像分析。MALDI法使用DIUTHAME进行离子化 DIUTHAME是由滨松与日本光产业创成大学院大学的内藤康秀副教授共同研制的。一经面世，就收到了较大关注，并常常被用于和MALDI以及SALDI法的比较。那到底是出于什么样的原因开发了这个产品？除了大大缩短前处理时间外， 相对于MALDI法DIUTHAME在质谱成像分析中还有哪些优势？为何说DIUTHAME是质谱成像分析离子化的新方法？内藤副教授从开发者的角度，为我们进行了解读。 内藤康秀副教授问：DIUTHAME在质谱成像分析中还有哪些优势？解决了MALDI法中的什么问题？ 在开发DIUTHAME前，我一直致力于质谱成像分析分辨率的提高。虽然希望通过提高设备分辨率来实现高分辨率的目标，但这个方法也是有极限的。 为什么这么说呢？因为在质谱成像分析中，以往普遍采用的离子化方法为“基质辅助激光解吸电离法（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization，即MALDI）”。而无论怎么提高设备的空间分辨率，分辨率都无法超过Matrix结晶的尺寸。若要实现质谱成像分析的高分辨率，必须要摆脱对使用Matirx的离子化方法的依赖。而DIUTHAME的诞生，就打破了这一点的限制。 DIUTHAME的开发一开始就是以质谱成像分析为目标应用，它并不需要与Matrix的调和、涂布、干燥的前处理。在提高操作便利性（3分钟左右可完成前处理）的同时，其高质量的数据，有望取得良好的重现性。 另外，使用MALDI法进行离子化时，也会出现因待测样品成分的性质原因，而难以与Matrix共同结晶的情况；以及待测样品中包含盐、添加剂等杂质的浓度过高时，阻碍Matrix结晶的情况。在这样的情况中，使用DIUTHAME则不会有这样的困扰，能够获得很好的效果。 DIUTHAME还可对工业材料、兴奋剂禁药等MALDI法无法测定的小分子进行高精度的测量。 问：明明和SALDI的原理类似， 为何说DIUTHAME是一种新的方法？ 目前有一种叫表面辅助激光解吸电离（SALDI）的离子化方法，它与DIUTHAME作用原理相同，市场上也有多类SALDI基板的商品。但是，目前市场上的SALDI基板并没有通孔的结构，在质谱成像分析中并不适用。在此意义上，使用DIUTHAME可以说是不同于SALDI的新型离子化办法。 将在DIUTHAME的哪些性能上进行继续开发？ 多数的生物分子是通过质子化来生成离子的，针对这些待测样品，DIUTHAME的灵敏度并不如MALDI法。这是因为，MALDI中的Matrix可以给样品分子提供质子，而DIUTHAME却没有该项作用。 想拥有更广泛的应用，这个小家伙就必须具备更高的灵敏度。因此，我们也会对它的性能进行持续的开发。此外，DIUTHAME的工作原理之谜仍未完全解开，而在继续研究摸索的同时，我们也希望能够不断地提高它的灵敏度。滨松致力于光电技术探索60余年，在质谱探测器的研究也已有40余年的历史，可为质谱应提供MCP、EM、离子化光源等产品。除了DIUTHAME，2018年滨松还推出了一系列应用于质谱的新品，并在2018年ASMS中有所展示（包括在研品），如可解决小质谱低真空问题的三级结构的GEN3 MCP、适用于TOF-MS的MCP+AD、适用于Q-MS\IT-MS的管道型EM等等。滨松希望通过探测技术的原始创新，从最底层技术出发，稳定而坚实地推动最终质谱应用的发展。

近日，中国科学院大连化学物理研究所生物技术研究部生物分子结构表征新方法研究组研究员王方军团队发布了表征蛋白质-纳米材料界面相互作用精细结构的赖氨酸反应性分析-质谱（LRP-MS）实验手册。　　微/纳米材料在生命科学、医药健康、生物催化等领域广泛应用，探讨蛋白质与材料之间的界面相互作用分子机制对生物医用材料的安全性评价、纳米药物的毒性评估和理性设计、生物-无机功能杂合体的改性和催化活性提升等具有重要意义。然而，现有光谱学等方法只能表征材料引起的蛋白质结构整体变化情况，蛋白质-材料界面相互作用分子细节的探测面临挑战。　　赖氨酸残基通常定位于亲水性蛋白质表面，其侧链伯氨基的化学标记反应性取决于其溶剂可及性和微环境非共价相互作用。当蛋白质表面与微/纳米材料结合时，结合界面上赖氨酸的溶剂可及性和反应性均随之降低。因此，王方军等提出了赖氨酸的反应性变化是探测蛋白质-微/纳米材料复合体中蛋白质定位方向、相互作用序列区域、关键结合位点、材料结合引起蛋白质结构变化的有效指标。该团队发展了在蛋白质—微/纳米材料复合体活性和变性条件下的两步同位素二甲基化标记的标准化策略，结合质谱定量分析实现蛋白质上赖氨酸反应性的全面分析，研究通过材料结合前后赖氨酸标记反应性的显著性差异确定蛋白质-材料的界面序列区域和关键位点。　　王方军团队长期从事生物大分子结构质谱尖端仪器和创新方法研究，所发展的LRP-MS策略近年来已应用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子、蛋白质-微/纳米材料的界面相互作用分子机制解析，取得了系列研究进展。　　近日，相关研究成果以Structural Characterization of the Protein-Material Interfacial Interactions Using Lysine Reactivity Profiling-Mass Spectrometry为题，发表在《自然-实验手册》（Nature Protocols）上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金和大连化物所创新基金等的支持。大连化物所发布蛋白质-纳米材料界面相互作用的结构质谱表征实验手册

距离上一年度罗氏的半年报中公布了比较多的临床质谱方案细节后，又过去了半年时间，按其规划，2024年底将会在欧洲率先上市。　　随着上市时间的临近，按着新品上市的一般推进流程，罗氏公司也不断对外公布了一些最新细节，使得其质谱方案的神秘面纱也一层一层的逐渐揭开。　　在临床质谱火热之际，我们之所以如此关注罗氏公司的质谱项目，还是基于业界对罗氏公司全自动质谱方案的高度期望，尤其在科学仪器巨头赛默飞世尔(Thermo Fisher)公司全自动质谱一体机Cascadion项目以失败告终之后，我们更期待IVD巨头的解决方案。　　看从IVD企业的方向是否可以走通，彻底解决临床质谱自动化，推进临床质谱进入临床检测科室，完成临床质谱普及的最后一公里路。　　本文仅为分享临床质谱相关知识、探讨质谱自动化方案，以期质谱技术在临床端的进一步发展。质谱技术的普及，需要各级别企业的共同努力，有大象起舞，也有蚂蚁雄兵。文中内容仅为技术探讨，是对公开信息的进一步学习、推测和探讨，如有理解偏差、不准确的地方，请仅以罗氏公司未来官方资料及解释为准。我们敬重头部企业罗氏这么有创新的技术尝试且需保护相应的专属设计，也期待各家质谱相关公司凭借独立的创新精神取得各自的突破。　　上市计划进展　　简言之，如期推进!　　落地时间与之前公布的信息没有变化，侧面证明在欧美地区的注册工作顺利、项目的研发按期望进展。　　2024年1月9日，在第42届摩根大通医疗健康大会(JPM 2024)上，罗氏公司CFO Alan Hippe 以Entering the next growth cycle(进入下一个增长周期) 为题汇报了罗氏公司的一些主要进展，其中有两页提到了诊断部的质谱项目，确定其对未来增长的重要性，并再次提到其上市计划，2024年底CE欧盟区域落地，2025年预计美国FDA获批。　　2024年2月初发布的2023年财报中，在诊断部CEO Matt Sause的报告部分，也看到他把i601全自动质谱系统在2024年CE落地作为他的首条关键任务。　　　　我们还注意到，2023年5月，在意大利罗马举行的第25届国际临床化学与检验医学大会(IFCC WORLDLAB)暨第25届欧洲临床化学与检验医学大会(EUROMEDLAB)上，罗氏也将其质谱系统进行了揭幕，为欧洲市场的上市预热。　　关于中国的上市时间，按业内推测及罗氏新产品在中国上市的规划传统，预计在2026年争取拿到国内上市资质。　　值得提及的一件事情，在2023年12月国家卫健委临检中心第二届临床质谱的培训班上，很高兴的看到罗氏公司RA注册部相关人员也来学习质谱相关内容。　　质谱技术对于罗氏公司也是一项新技术、新方法，为了做好相关注册工作、确保注册进度，相关人员主动学习相关知识，值得认可肯定!　　设备整体结构　　从左到右依次为进出样单元(含STAT急诊端口)、加样及磁珠前处理部分、色谱质谱部分。总体的尺寸并没有相关资料公布，但参照图片里其他模块的尺寸(e801及进样模块尺寸)，按比例可大致估算，整体的设备长度约3.8米(含进样单元)。　　其中色谱质谱部分从图中可以看出比e801(含MSB样本缓冲区)尺寸略短一些，我们姑且按1.4米算。　　关于重量，我们也做个大概估算：考虑到色谱质谱部分有泵单元、分子涡轮泵、质量分析器等重量较大组件，整体重量应大于等于e801的730公斤，所以三者相加(190+730+730)整体重量应在1.7吨上下。　　设备的整体结构，可以理解为进样单元，加上e801系统(含MSB样本缓冲区、无ECL电化学发光的检测系统)，后面再加一个液相色谱及质谱分析仪部分。　　此系统的e801部分，负责样品的进出样，传输，样品的加入，试剂的加入，基于磁珠的前处理等的流程，最后转移至液相色谱部分，进行液质分析相关步骤。　　质谱试剂产线　　在公布了质谱系统的型号i601之后，质谱的试剂盒也有了它的名称：Ionify(已注册商标)，并形成Ionify® reagent line。很显然，这个词来自于离子的词根，这也正是质谱的工作原理，使物质离子化，测量待检物的质荷比M/Z。　　至此，我们又可以大胆的猜测i601质谱系统这个cobas i系列的命名起源，那就是也是源于Ion离子这个词，与其免疫系统的e来自Electro ChemiLuminescence (ECL)elecsys电化学发光系统、临床生化的c来自Clinical Chemistry形成家族化命名逻辑，共同组成cobas中心实验室的主力机型系列。　　试剂盒形式沿用cobas生化、免疫系统的cassettes式设计，即试剂多联包形式，从截图可看出也为3组分、尺寸与免疫e green package一致，这也使得其能兼容使用免疫系统e801的试剂处理单元，享用在线装卸载试剂功能。　　若如猜测与e pack green试剂盒大小一致且试剂仓一致，则单模块也可以放置48个试剂。　　我们可以对比下罗氏的质谱试剂与赛默飞世尔的Cascadion质谱系统的试剂，从临床使用角度，罗氏的即开即用、成分整合、可高度自动化的试剂更符合临床工作人员的喜好。　　样本前处理工作流程　　质谱检测与生化免疫等其他间接检测(检测器隔检测杯读值、非直接接触待检物)不同，其待检物质是被吞进检测单元的，是直接读取待检物M/Z质荷比的一种技术，无需标记物。　　但血清中的成分非常复杂，有大量的磷脂、蛋白等基质杂质成分，待检成分只是非常少的一些物质，所以质谱检测是需要进行样本纯化后才能进样的，尽可能纯的待检物质可降低基质干扰，提升检测的灵敏度和准确性。样本前处理工作由于步骤复杂，目前是临床质谱分析的一个难点和重点，也是各家临床质谱自动化方案主要需解决的关键步骤。在众多的前处理方法中，磁珠法(或称萃取磁珠法)是最有希望实现高通量、自动化、标准化的，国内也有很多公司在这个方向下取得了卓有成效的进展。　　这里我们看到罗氏采用的是磁珠法的方案，其过程简要整理如下:　　此部分用到的各类试剂应主要来自Ionify的试剂包部分，从图中可大致判断罗氏的磁珠方案为正向抓取待检物的模式，磁珠依靠binder正向结合、抓取待检物质，最后洗脱下待检物质与内标物，进行后续检测。　　这里稍微补充一句，磁珠法其实也能做除杂的方式，即沉降基质等成分，用上清部分作为为后续待检样品。　　色谱质谱部分　　前处理纯化后的样本转移到色谱部分，经过色谱柱，再到质谱检测器进行检测，得到信号。　　为了提高检测通量，罗氏方案中设计了8个色谱柱单元，柱子放在cartridge中，这是一种特殊盛放色谱柱的弹夹式结构的装置，它还具有RFID标签。　　此种设计与Cascadion的Quick Connect Cartridge有相似的设计理念，都是为了使其安装更换更加便捷，易于临床客户上手。　　我们在上一次解读中提及到其设计检测通量可达到100个样品/小时，有过质谱使用经验的都知道，若按传统的单线程标准过色谱柱模式，要实现此速度非常困难。　　罗氏采用了多线程模式，即有8根色谱柱可供样本通过，后面将顺序出锋而陆续进入质谱检测。　　为便于理解整个实验流程，附简易功能模块示意图。　　布局仅为推测，最终布局请以官方公布为准。　　还有个非常重要的细节我们从图中可以看出，8个色谱柱单元长短并不一样，其中5个短柱子，3个长(常规)柱子区域。　　从如此高的检测通量设计来推测，短柱子是做单项目(或小组合)测试的，这类柱子应与常规的色谱柱不同，是为这些快速检测项目而设计的，如激素类单项。　　在结果界面的截图中，我们看到睾酮的色谱图里，单个测试是36秒的检测时间(注：色谱质谱系统里，30秒处为保留时间或出峰时间)，按此检测模式恰好可以达到标称的100标本/小时(3600秒/36秒)的速度。　　而对于长柱子(相对于短柱子的称呼)，应该与传统色谱系统中的常规柱子更接近，预估是做一些联检类的项目，会有较长的检测时间来处理套餐类的项目组合。具体哪些是组合项目和色谱柱具体工作模式，还请大家静待罗氏公司的最终公布吧。　　在设备的下方，则应是流动相溶剂等液体耗材部分及质谱仪部分(右侧)。　　分析软件　　检测流程的最后一部分，将会对数据进行自动处理，软件应用复杂的算法对结果进行验证，然后传输至LIS系统。这相比于传统的质谱分析软件有很大的改善，减少了很多人为参与、调整、确认结果的过程。　　在软件界面我们可以看到峰型整合和结果验证的细节，如这个睾酮结果的界面中，分别显示了内标物与待检物质的响应值与峰型情况，依靠峰面积得出待检物的浓度。　　在这个过程中，将自动完成待检物质与内标物的峰型质量检查、质谱仪与色谱仪的状态确认、整合与定标质量的确认、结果确认。　　项目菜单　　检测菜单也是质谱项目是否能成功的重要因素，罗氏公司一直以规划检测项目见长，这次在项目规划上也进行了大量的前期调研和顾问工作。　　按规划i601将有一个超过60多个项目、全面的试剂套餐组合，分两批上市。　　项目大类为以下5类：类固醇类激素类、维生素D类、TDM药物浓度检测、免疫抑制剂药物检测、滥用药物类检测。　　未来质谱模块的灵活配置　　模块化的设计一直是罗氏诊断产品的特点，从最早的Modular时代开始，到cobas 6000/8000。　　作为cobas Pro的一个模块，罗氏的质谱方案同样拥有灵活的配置形式，在以下图片中我们可以看到i601可以进行双模块的拼接，以便进一步的扩展检测通量和项目数。　　当然，还有几种与cobas Pro里其他模块的联机，与免疫模块e801的连接、与生化模块c503的连接，及与生化、免疫混合模块的连接 同样在今年落地的高速生化分析模块c703作为cobas Pro方案里的一员，未来也应可以参与到质谱模块的灵活配置中。　　但请注意，在官网的标注中，明确的告知：在上市初期，将仅以单模块形式提供，所有其他的包括生化、免疫的配置将会在随后的日期提供。　　一个有意思的探讨: 一套i601质谱系统算几个模块?　　我的猜测是算2个，那么一个线体分支就最多可连接2个i601(4个模块)，为什么?　　视频里的2个i601联机展示图可作为依据吗? 不是仅仅从这里。　　我的考量如下：通量的需求、设备长度、系统的复杂度、人员动线、通讯的限制、标本周转时间等等。　　但需要进一步的官方消息确认，仅作猜测探讨。　　补充知识：罗氏的多模块联机方案中，cobas 8000及Pro系列的模块连接数量，最多可扩展至4个。　　我们再看一下罗氏公司的一个整体规划图，这是一套CCM2.0的流水线系统，颇为壮观，从图中可以看出P系列前处理+后处理、日立的轨道系统与生化、免疫、质谱、分子、尿机、血球、凝血组成的强大多学科布局，i601质谱系统作为一个新学科模块，占据着极为重要的战略意义位置。　　写在最后　　近些年，临床质谱一直是热门赛道，资本方、客户端、企业端，一直期待这一技术在精准医学中大展拳脚，但其发展速度一直不如预期，这里面有很多的因素限制。　　我们非常期待有更多的企业在解决诸多困难中取得实质性突破，带我们进入临床质谱的新维度、新时代。　　如罗氏官网中质谱项目的标题：Are you ready to enter a new dimension in mass spectrometry?　　你准备好进入质谱分析的新维度了吗?　　作为相关从业者中的一员，也意识到，临床质谱的普及除了产品维度外，还需要更多的质谱相关知识的推广，让大家理解这一检测利器，最终懂它、用它，真正发挥其作用。　　希望今天的分享能起到一点点的作用。作者：IVD崔哥

《RISE大招》前情回顾：这是一个荡气回肠的相遇、相知、相恋、相爱的故事。本系列前两集讲述了RISE从传统扫描电镜“心有余而力不足”的分析困境下一跃而出到它对于无机相鉴定和金属夹杂分析的武功路数，相信大家对RISE电镜-拉曼一体化系统已经有了基本了解。（然而小编还是无比体贴的放上了前两集链接：点击下列文字即可快速阅读）。01 “我的前半生”结束了，后面的科研之路就靠它了！02 无机材料分析，RISE还有这些大招！科研无涯，却无需苦作舟。路即在此，英雄闻声而至。话不多说，今天呢，接着上次的招式，给大家讲讲RISE在无机材料结构分析和结晶度分析上的套路。无机材料之结构分析对于无机材料来说，经常会碰到同分异构的情况。但是仅仅通过扫描电镜和能谱，我们只能得到形貌和成分数据，而没有办法对样品进行准确的结构分析。而结构作为物质的基本特性，极大的影响着热、力、光、电、磁等性能，因此也是微区表征不容忽视的方面。而目前在SEM系统中，能够进行结构表征的也只有EBSD，但是前提依然是要有严格的样品制备，局限性很大。而成分相同结构不同的同分异构材料的拉曼光谱，往往表现出较大的差异，因此拉曼光谱分析手段是很好的表征结构的手段。因此，通过SEM+EDS+Raman (RISE) 的综合分析手段，我们就可以对同分异构材料进行全面准确的形貌、成分和结构分析。 如下图，试样为TiO2粉末，TiO2有锐钛矿和金红石两种结构，并且两者表现出完全不同的拉曼光谱特征。因此在RISE系统中通过拉曼光谱的面扫描分析，可以轻易的区分出蓝色区域为锐钛矿结构，红色区域为金红石结构。再例如下图，通过EDS数据知道电镜分析区域为Sm2O3 ，然后在此基础上进行拉曼面分布分析。虽然试样并不平整，完全不够EBSD的测试要求，但是RISE系统依然可以发现其中红色区域为立方结构的Sm2O3 ，蓝色区域为单斜结构的Sm2O3 。无机材料之结晶度分析对于无机材料来说，结晶度也是重要的参数。目前能够很好的表征结晶情况的主要是XRD，并且是基于宏观分析，能在微区尺度对结晶度进行表征的手段则很少。而无机晶体材料的结晶度却会对特征拉曼峰产生较大的影响。结晶度程度高，特征拉曼峰高而尖锐；反之，若结晶度低，则特征峰会变宽。因此，可以通过特征拉曼峰的宽度来对结晶度进行评判。由此可见，原位一体化的RISE对微区领域的结晶度分析提供了新的途径。如下图，用SEM-FIB双束电镜在硅表面进行图形加工。由于Ga+离子的注入效应、热效应等会使加工区域的硅产生一定程度上的非晶化。仅凭形貌是无法知道非晶化程度的。而在此区域用RISE进行拉曼面扫描，并用每一个测试点的Si的特征拉曼峰的半高宽为依据进行RISE成像，红色区域为半高宽较窄，蓝色区域为半高宽较宽。由此形成的RISE图像，对于研究FIB加工产生的非晶化一目了然。RISE七十二般武艺，招招新奇，但一招一式，每一个路数都为更好的帮助您的科研分析而生。除了切实突破并解决了传统扫描电镜分析能力薄弱的问题，针对传统意义上的电镜-拉曼联用系统的种种分析弊端，RISE系统采用了扫描电镜-拉曼光谱一体化的硬件和软件设计，使得综合分析更加行之有效。 故事刚开始，我们已相遇，还有相知、相恋、相爱̷̷跑远了，下面请收看“下集预告”：《RISE大招》下集看点：无机材料之微量元素分析、取向分析、取向应力分析。关于TESCANTESCAN发源于全球最大的电镜制造基地-捷克Brno，是电子显微镜及聚焦离子束系统领域全球知名的跨国公司，有超过60年的电子显微镜研发和制造历史，是扫描电子显微镜与拉曼光谱仪联用技术、聚焦离子束与飞行时间质谱仪联用技术以及氙等离子聚焦离子束技术的开拓者，也是行业领域的技术领导者。关注TESCAN中国官方微信“TESCAN公司”，更多精彩资讯。↓ ↓ ↓ 观看RISE大招全系列，请戳：01 “我的前半生”结束了，后面的科研之路就靠它了！02 无机材料分析，RISE还有这些大招！

2020年10月29日，由中国出入境检验检疫协会主办的“新精神活性物质的现场查验和实验室快速分析及安全防护”培训会在杭州召开，北京清谱科技有限公司（以下简称清谱科技）携Mini β小型质谱分析系统参展，清谱科技宋蓓为与会者带来了《芬太尼等新精神活性物质的小质谱现场快检技术》的报告。中国出入境检验检疫协会郗军老师主持了本次大会并为大会致辞，中国药物滥用防治协会张锐敏副会长、清华大学精密仪器系欧阳证教授、杭州市公安局禁毒支队沈坚等为与会者带来了精彩的报告。 会议现场 清华大学精密仪器系欧阳证教授报告题目：毒品现场检测之质谱技术发展欧阳证教授表示新型精神活性物质的管控是一场分析化学家与有机化学家的“对决”。清华大学精密仪器系、上海市公安局物证鉴定中心、上海市刑事科学技术研究院达成三方友好协议，在共同关注领域，比如毒品、管制药品、新精活性物质等快速鉴定技术研究及其它共同关注的领域开展战略性合作。质谱对于毒品检测具有高确定性，尤其是离子阱质谱仪的小型化对毒品的现场快速检测更是利好。欧阳证教授对目前市场上质谱仪中离子分析器的类型、离子阱分析器小型化的技术发展和原位电离技术等进行了讲解，并介绍了小型质谱分析系统在芬太尼监管和术中检测的应用。北京清谱科技有限公司 宋蓓报告题目：芬太尼等新精神活性物质的小质谱现场快检技术本报告就芬太尼等新精神活性物质的小质谱现场快检技术进行了详细的介绍。借助质谱检测的高可拓展性和原位电离技术，清谱科技的Mini β小型质谱分析系统极大的降低了质谱分析的复杂性，突破现场人员、场地的限制，无需样品前处理、第一时间完成芬太尼类及其他管制成分的快速准确识别检测。与此同时，还配备极具官方性的新型合成毒品及新精神活性物质二级质谱数据谱库，其中数据库中包含的芬太尼类物质及其前体远远超过了国家管控的25+3种，且具备检测上万种芬太尼及其变体的能力。Mini β小型质谱分析系统精准可靠，能够快速识别管制成分，支持痕量采样，具有高灵敏度和高可拓展性，提升了现场检测结果的准确性。Mini β小型质谱不仅能看到管控成分的质量信息，还可以推断出结构信息，这种双重保障能够提升定性结果的准确性，减少误判几率。随后，报告也列举了Mini β小型质谱分析系统的部分应用案例，包括食品中管制成分的检测、海关执法现场对通关人员或行李物品表面的痕量样品进行快速采样检测等。清谱科技展台Mini β小型质谱分析系统 Mini β小型质谱分析系统无需样品前处理，约1分钟生成检测报告，突破了检测场地、检测时间和专业人员的限制，实现一键式操作快速自动分析。采用PCS原位电离样品盒进样和非连续大气压接口（DAPI）技术，其精准可靠的质量分析系统提供了高动态范围和多级串联质谱测量能力，性能强劲的射频系统极大拓展了小型质谱的质量范围。纳克级灵敏度为痕量样品检测保驾护航，痕量样品模拟测试达1ng/cm2。串联质谱确保了检测的准确性，除毒品质量信息外，串联质谱还可显示结构信息，避免了传统方法的假阳性问题。芬太尼类新精神活性物质质谱库对于芬太尼检测，通过标准物质建库，已将200余种芬太尼类物质纳入谱库，而专有的算法使Mini β小型质谱分析系统具备检测约5万种芬太尼及其变体的能力。

1996年Waters公司推出了世界上首台商业化Q-TOF质谱，从那时起Waters就成为引领Q-TOF质谱发展的旗手。2007年Waters创造性地将行波离子淌度（T-Wave）嵌入质谱中，推出SYNAPT HDMS&mdash 一举获得了当年PITTCON金奖。从此质谱不仅可提供质量信息，而且可以根据离子的形态进行分离、分辨。加之在液相领域至今所向披靡的UPLC技术，Waters为使用者呈现出了一个由质量、形态、色谱构成的多维分析空间。SYNAPT已帮助科学家在蛋白质复合体四级结构、蛋白单体变化及聚合物分析等领域，在Cell、Nature等期刊发表诸多论文。 SYNAPT没有止步，它带来了越来越多的惊喜。首先是T-Wave与前后两个碰撞池结合的TriWave技术。这个巧妙的设计使Q-TOF质谱具备了三级质谱性能。更令人兴奋的是，此三级远非常见的三级方法：母离子在第一个碰撞池产生的碎片，可在之后的T-Wave迁移腔中根据形态分离，因此当碎片离子按照形态顺序依次进入第二个碰撞室后，最终产生的三级碎片不仅包含质量信息，而且蕴含了结构信息。这种被称为时间排列平行碎裂（TAP，TimeAligned Parallel Fragmentation）的三级质谱技术，在糖肽结构分析中，可巧妙地分别采集糖链及多肽的碎片信息，为蛋白质糖基化及其它化合物分析提供了全新的策略。 T-Wave还可以提高质谱信号强度，提升信噪比！使用两个T-Wave组成的离轴迁移腔被命名为Step-Wave。它在使分析离子&ldquo 上一个台阶&rdquo 进入质谱分析器的同时，让中性干扰物&ldquo 下一个台阶&rdquo 而远离质量分析器。因此采用Step-Wave的SYNAPT G2-S对痕量物质的分析具有了前所未有的分析能力。较前代产品，SYNAPT G2-S的信号检测强度提高了约30倍，信噪比提高了5-6倍，最低检测限也下探了一个数量级。灵敏度的显著提高、无与伦比的选择性和分析能力、以及离子淌度分离等多重优势，使SYNAPT G2-S能够以在低于任何其它高分辨率质谱仪的分析浓度条件下定性、定量分析物。HDMSE是T-Wave技术的又一创新应用，它使沃特世独有的MSE专利技术进一步升华。MSE通过碰撞池在低、高能量匀速高频切换，分别得到全部母离子与所有碎片离子信息。之后通过母离子与其碎片具有一致色谱行为的性质，进行碎片离子归属，从而得到所有母离子的二级碎片信息。MSE的优势在于它不仅采集了最全的离子信息，而且&ldquo 完美&rdquo 地记录了色谱数据。这对于分析物的定性和定量堪称绝佳的解决方案。 HDMSE技术的推出，进一步对色谱行为相近的分析物通过离子淌度区分，极大地改善了数据的信噪比，使定性结果更加准确（图2左）。使用MSE以及HDMSE采集多肽GVIFYESHGK二级图谱的对比实验中可以看到，在MSE数据中有多达254个碎片信号，其中大部分是干扰信号，如果这些信号都被用来检索，将可能影响鉴定的准确性；而通过HDMSE得到的潜在产物离子碎片仅有35个，也就是说绝大多数干扰信号都被去除了，这极大地提升了最终的鉴定可信度（图2右上）。更让人兴奋的是，HDMSE技术在对复杂体系蛋白鉴定的数量上，较MSE也有了近一倍的提升（图2右下），产生了质的飞跃。 配备MALDI离子源的SYNAPT G2-S还可进行MALDI Imaging实验。较常规的MALDI Imaging技术，通过T-Wave技术的使用，科学家可以得到更加丰富、可信的实验数据，因此得到了广泛的应用。此外，ETD（电子传递解离）等丰富的研究手段都可在SYNAPT G2-S上实现。SYNAPT G2-S还具有最广泛的离子源，包括：电喷雾（ESI）、大气压化学电离（APCI）、双电喷雾和APCi（ASCi）、大气压电离（APPI）、常压气相色谱法（APGC）、NanoFlowR（ESI）、基质辅助激光解吸（MALDI）、大气固体分析探头（ASAP）和微控UPLC（T RIZAIC UPLC）等。它还可与包括DESI（Prosalia）、DART（IonSense）、LDTD（Phytronix）和TriVersa nano Mate(Advion)源在内的诸多第三方离子源兼容。 SYNAPT G2-S质谱作为2011年Waters最新发布的尖端质谱，正在融入生命、材料、环境、食品、农业、中药等领域的研究与实践应用中。 关于沃特世公司 (www.waters.com) 50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。 作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。 2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。

药品与我们的生活密不可分。新药研发一方面关系着全人类的健康需求，另一方面也关系着国家经济与社会的发展需求。 据权威统计，单一药物上市的成本超过十亿美元，整个过程花费约十年的时间，药物筛选的失败率高达97%。但药物筛选是新药研发中至关重要的一步，确定靶标分子及筛选模型是现代新药开发的基础。它主要有两种方式，表型筛选（Phenotypic drug discovery, PDD）和靶点筛选（Target-based drug discovery，TDD）。PDD的起点是一个化合物库或抗体库，用一个和疾病高度相关的临床前模型或者实验来筛选库中的药效，找到达到期望药效的分子再进一步优化和开发。经典的药物表型筛选更多的是基于动物疾病模型的筛选，实验选择遗传背景明确或者来源清楚的动物，例如鸡、猪、狗、猫、鼠、蛙、蛇、猴子、鱼、果蝇、线虫等。TDD则是基于对疾病和靶点机理的理解，针对某一个和疾病机理高度相关的特定的靶点，从而有针对性的设计大分子或小分子药物的研发方式。由于表型筛选无法提供活性化合物作用靶标信息, 因此需要利用化学蛋白组学回溯鉴定那些因与小分子药物直接发生作用而引起功能改变的蛋白质，在分子水平上系统揭示特定蛋白质的功能以及蛋白质与化学小分子的相互作用, 从而准确找到药物的作用靶点。旨在建立药物活性与细胞表型之间的联系，阐明药物的作用机理，一方面探究药物的脱靶效应和耐药性机制, 提高药物发现的效率；另一方面在药物研发的早期阶段预测潜在的副作用和毒性, 从而降低药物研发失败的风险。　化学蛋白质组学研究方法的一般流程是, 先将化学探针或小分子化合物与蛋白质提取液进行共孵育,然后利用亲和层析等方法将这些蛋白质分离,再通过高灵敏度的质谱鉴定, 最后对它们做进一步的生物信息学分析。1. 基于活性的蛋白质谱分析 (activity-based protein profiling, ABPP)ABPP利用基于靶酶活性的特异化学小分子探针 (activity-based probes, ABPs) 来探测功能蛋白质组, 利用活性小分子探针来识别蛋白质靶点。分子探针是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用并能被特殊方法所检测的分子。ABP 的设计通常包括两个基本组成部分:“反应基团”和“报告基团” , 一般通过碳链或者聚乙二醇链将二者连接在一起. 反应基团通常是具有独特化学结构的亲电性化学小分子, 能够选择性地与蛋白质组中某一类蛋白酶的活性中心结合, 并与其中执行重要催化功能的亲核性氨基酸发生反应, 从而将探针分子共价地标记在靶标蛋白上。活性分子探针结构示意图2. 药物亲和致靶点稳定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）DARTS通过对比药物处理组与DMSO对照组蛋白质酶解片段的差异，找出酶解情况不同的蛋白质，再进行结合特异性分析，找出特异结合的靶标。DARTS实验步骤这种方法的优点是, 仅依靠药物和蛋白直接结合而并不需要对小分子化合物进行修饰, 从而确定出小分子的任意靶点。因此, 可采用小分子稳定其靶蛋白的结构从而导致蛋白酶抵抗, 结合质谱分析法发现未知靶点。DARTS 可将具有生物活性的天然产物提取物在分离之前就用于靶点发现,多用来研究多靶点药理学以及复方中成药物。3.细胞热转变分析（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）CETSA是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验，其原理是靶蛋白与药物分子结合时通常会变得稳定。即随着温度的升高，蛋白会发生降解；当蛋白结合药物后，相同温度下，未降解蛋白的量会提高，该复合蛋白的热熔曲线会右移。用溶解蛋白质的量作温度的函数可以得到蛋白质的变性曲线，由此可以确定蛋白质的变性温度点或蛋白质的熔点。CETSA实验的样品来源，可以是细胞，也可以是组织样本，检测方法主要有Western blot和MS。该技术能在天然的细胞环境中进行，也无需对目标分子和蛋白进行任何修饰以及标记。CETSA实验步骤目前已证实该技术能识别许多已知的抗癌试剂的靶点，如在细胞裂解液、完整细胞或组织样本中均鉴定出多个药物的作用靶标。然而，CETSA方法不适用于高度不均匀的蛋白质或蛋白质配体结合域的结构展开，并不会诱导蛋白的聚集和变性的情况，如DNA和伴侣蛋白质的结合。有研究将cellular thermal shift assay与质谱联用（MS-CETSA），可以同时监测整个蛋白质组在药物作用下蛋白质稳定性的变化，因此可以鉴定出与药物相互作用的蛋白质，而不需要预先知道药物的作用通路或机制。MS-CETSA流程图4. 有限蛋白水解质谱（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry，LiP-MS）LiP-MS不需要对配体进行化学修饰，就可以实现在复杂的生物环境中鉴定药物靶标。实验步骤是用低浓度的非选择性蛋白酶K进行有限的蛋白水解，优先切割蛋白质暴露在外的柔性部分(环或者未折叠部分)， 经过变性和胰蛋白酶消化后，通过LC-MS分析肽混合物。基于LiP-MS的小分子图谱靶点的发现在整个药物研发过程中起着至关重要的作用。随着现代分子生物学技术的发展和人类基因组计划的完成，出现了大量可供治疗干预的新型分子靶点，但并不是所有的靶点都能够成为与疾病有关的有效靶点，因此对新型靶点进行发现和验证便成为非常重要的工作。

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Analytical Chemistry上文章，High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry1。该文章的通讯作者是美国基因泰克公司的Wendy Sandoval研究员。　　癌症疫苗是通过利用肿瘤细胞相关抗原，来唤醒人体针对癌症的免疫系统。常见的策略是通过对病人的肿瘤细胞样本进行基因测序来寻找特征性抗原肽，该抗原肽会与I类主要组织相容复合体(MHCI)相结合并呈递至CD8+细胞表面，通过与CD8+细胞表面受体相结合从而诱导免疫反应。为了实现整个过程，研究人员通常会结合基因测序和计算机预测结果设计多个候选抗原肽，每个候选肽都需要通过实验测试来确认它与MHCI分子的结合能力以及相关免疫原性。此外，考虑到编码MHCI的基因具有多态性，候选抗原肽还需要与不同等位基因编码的MHCI分子进行测试。因此，本文开发了一种高通量方法，利用非变形质谱快速筛选候选抗原肽并表征形成的肽-MHCI复合物(pMHCI)。　　pMHCI复合物中抗原肽的体外载入一直以来都是难点，因为MHCI复合物(包括HLA和β2M亚基)本身并不稳定，需要长度为8~10的多肽链载入到MHCI的凹槽以保持完整。本文则通过利用紫外光裂解肽-MHCI复合物(UV-MHCI)的肽交换实现抗原肽的载入，具体步骤如图1A所示，通过紫外光照，UV-MHCI中的高亲和肽被切割转为低亲和肽段，该低亲和力肽段极易发生肽交换，通过监测新的pMHCI复合物的形成实现对候选肽的评估。目前常用的检测pMHCI形成的工具包括ELISA、TR-FRET以及2D-LC-MS。然而这些方法仅能提供有限的信息关于肽交换、pMHCI分子质量，对形成的pMHCI复合物无法进一步的表征。事实上，pMHCI复合物对后续诱导免疫反应至关重要。　　图1. 癌症疫苗的免疫监测的示意图：A) 筛选流程，B检测方法。　　为了确认非变性质谱(nMS)能否用于pMHCI复合物表征以及肽交换率的检测，作者对UV-MHCI以及6个标准肽段进行了考察(图2)。未经UV照射的UV-MHCI MS谱图(图2A)可以观察完整的UV-MHCI复合物以及丢掉紫外光裂解肽的MHCI。MHCI复合物被认为是气相解离产生的，因为没有活性肽的稳定作用，MHCI很难存在于溶液相中，溶液中没有MHCI，“空壳”的MHCI只有可能是质谱中UV-MHCI的气相裂解产生的。图2B证实了这一观点，经紫外光照射后，紫外光裂解肽由高亲和力转为低亲和力，从MHCI上脱落，MHCI解离成HLA和β2M亚基，谱图中能观察到HLA和β2M亚基信号。确认了MHCI是由peptide-bound population产生的信号，作者开始用该方法去定量标准肽的肽交换率。如图2C为UV-MHCI与标准肽孵育并过夜UV照射得到的谱图，仅观察到完整的pMHCI以及“空壳”MHCI的信号，说明实现了100%的完全肽交换。如图2D，肽交换率随孵育时间改变，2小时孵育时间足以实现最大肽交换。　　图2. nMS表征UV光照A)前B)后的UV-MHCI复合物，C)nMS测定UV-MHCI与标准肽的肽交换率，D)标准肽肽交换率随时间的变换情况。　　为了提高分析通量，减少样本消耗，作者在nMS基础上开发了SEC-nMS和CZE-nMS系统。作者用SEC-nMS系统测定了50个候选肽的交换率，说明该系统能够进行中或大规模的数据采集。相比较SEC-nMS而言，CZE-nMS系统具有更高的灵敏度和通量，样品体积消耗从微升减少至纳升，分析时间也缩短为2 min(图3A)。检测信号与进样量呈线性关系，注射体积为3 nL时，最低检测限为6 ng(图3BCD)。作者测定了67个候选肽跨越4种等位基因编码的MHCI分子的肽交换率(图3E)。此外，通过将UV-MHCI复合物同时与四种以上的候选肽进行孵育可在单个实验中同时检测它们的相对肽交换率以及与MHCI结合的亲和力(图3F)。作者还提出Vc50这个概念，即导致50%的pMHCI复合物发生解离的碰撞电压，可作为评估pMHCI复合物稳定性的重要参数。　　图3. 使用CZE-MS系统高通量分析pMHCI复合物　　除了检测pMHCI复合物的形成，测定肽交换率，nMS还可以对形成的复合物进行进一步的结构表征。如图4所示，native top-down的分析策略可获得多层次的结构信息。本文使用的Orbitrap Eclipse “Tribrid” 质谱，图4A为完整pMHCI的MS1谱图，图4B为施加源内电压(SID)促使蛋白解离为亚基，图4C是将14+ pMHC单独分离出，为后续HCD活化做准备。图4D为pMHCI复合物经HCD解离后的MS2谱图。图4E和图4F则分别为对肽段以及HLA亚基进行top-down测序的结果。这些多层次的结构信息能够帮助区分HLA亚型、阐明候选肽的序列，包括一些PTMs、二硫键信息。这些结构细节可能会影响候选肽与MHCI分子间的亲和力甚至是后续T细胞受体的识别。　　图4. Native top-down分析策略获得pMHCI复合物的多层结构信息　　总之，本文将非变性质谱(nMS)与分子排阻(SEC)或毛细管电泳(CZE)分离技术相结合用于高通量筛选pMHCI复合物中的候选肽。该方法能够直观确认pMHCI的完整性，Vc50可作为评估复合物气相稳定性的重要指标，通过native top-down分析策略可获得多层次的结构信息。以上所有确保了后续临床T-细胞实验的正常进行。　　撰稿：刘蕊洁　　编辑：李惠琳　　原文：High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Schachner LF, Phung W, Han G, et al. High-Throughput, Quantitative Analysis of Peptide-Exchanged MHCI Complexes by Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 10.1021/acs.analchem.2c02423. doi:10.1021/acs.analchem.2c02423