喹哪朵肽

猪肉中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物多残留量的测定四环素类药物 (TCs)、磺胺类药物 (SAs)和喹诺酮类药物 (QNs)是畜牧养殖中常用到的三类药物，常用来治疗或预防鸡的细菌、支原体和球虫感染，但若使用不当会导致其在动物源性食品中的残留超标, 影响人类健康, 并且会使细菌的耐药性增强。2022年2月1日，GB 31658.17-2021《食品安全国家标准 动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类多残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》正式实施，本文参考上述标准，试样中残留的四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物，用Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取，使用HLB柱经睿科Fotector Plus全自动固相萃取仪净化，洗脱液经睿科 EVA 80全自动氮吹仪浓缩，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。✦1仪器和耗材● 仪器Fotector Plus全自动固相萃取仪EVA 80 高通量全自动平行浓缩仪Agilent 1290Ⅱ/6470高效液相色谱-串联质谱仪Fotector Plus全自动固相萃取仪EVA 80 高通量全自动平行浓缩仪● 耗材HLB固相萃取柱（RayCure，200 mg/6 mL）● 试剂甲醇（优级纯）乙腈（优级纯）正己烷（优级纯）超纯水0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液：取磷酸二氢钠7.8 g，用水溶解并稀释至1000 mL。0.05 mol/L 磷酸氢二钠溶液：取磷酸氢二钠17.9 g，用水溶解并稀释至1000 mL。磷酸盐缓冲液：取0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液190 mL，用0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液稀释至1000 mL。1 mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4 g，用水溶解并稀释至100 mL。0.03 mol/L氢氧化钠溶液：取1 mol/L氢氧化钠溶液3 mL，用水稀释至100 mL。Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液：取柠檬酸12.9 g、磷酸氢二钠10.9 g、乙二胺四乙酸二钠39.2 g，加水900 mL，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至5.0±0.2，用水稀释至1000 mL。洗脱液：取甲醇150 mL，加乙酸乙酯150 mL、浓氨水6 mL，混匀。复溶液：取水40 mL，加甲醇5 mL、乙腈5 mL、甲酸0.05 mL，混匀。2样品制备取试样1 g（准确至±0.01 g）于50 mL离心管，加入Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液8 mL，涡旋1 min,超声20 min，高速冷冻离心5 min，收集上清液。下层残渣中加磷酸盐缓冲液8 mL，重复提取一次，合并两次提取液，混匀，备用。● 净化将HLB固相萃取柱安装在Fotector Plus全自动固相萃取仪上，依次用甲醇5 mL、水5 mL活化，取备用液过柱，依次用5 mL水和20%甲醇水溶液5 mL淋洗，吹干，用洗脱液10 mL洗脱。收集洗脱液于EVA-80全自动平行浓缩仪中45 ℃水浴氮气吹干。加入复溶液1.0 mL，涡旋1 min溶解残余物，微孔滤膜过滤，液相色谱-串联质谱测定。具体的固相萃取方法见图3。●固相萃取净化条件Fotector Plus固相萃取方法3液质检测条件● 液相条件● 液相梯度洗脱条件● 质朴仪器参数● MRM参数● 色谱图四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物标准溶液总离子流图（20μg/L）4结果与讨论为了验证该方法的回收率，本实验在空白猪肉样品中加入四环素类、喹诺酮类和磺胺类标准品进行加标回收验证(n=3)，并采用基质标准曲线定量，数据结果如表-2所示。加标回收率在62.4%~105.6%之间，RSD值控制在15%以内，满足标准要求，说明该方法能够很好地运用于动物性食品中四环素类、喹诺酮类和磺胺类多残留量的检测。表-2.猪肉样品加标回收率及RSD值5总结● 在超声提取步骤时使用冰水浴来进行20 min的超声，可减少由于长时间超声引起的温度升高，而造成目标物的损失。● 应避免样品在浓缩过程中长时间氮吹、过分浓缩干燥，否则可能会造成回收率损失。● 本方法使用睿科Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪可实现净化过程的自动化，从活化到上样、洗脱一步到位；最多一天能够处理180个样品，高效便捷地完成固相萃取过程。同时搭配睿科Auto EVA 80高通量全自动平行浓缩仪进行浓缩，二者的样品架可兼容使用，无需进行样品转移，操作连贯简便，避免样品的损失。

NaCha多温区工作台NaCha 多温区工作台，拥有三个独立温区，点击屏幕即可轻松 设置各温区的反应温度和时间，推荐用于低温加样及中、高温的温 育反应。优质的帕尔贴与精准的温度校准技术，配合复合式液体冷 却循环系统，有效保证温度控制准确性与孔间温度均一性，实现快 速变温。因此，NaCha 能够出色完成要求温控精准的反应，如分子 生物学研究中常见的酶切、逆转录等实验。贴心的自动记忆和安全 保护机制，带来更好的操作体验。应用范围低温区：可设置温度范围为4.0~16.0℃，用于低温加样及加样后的暂时保存、低温中止反应等中温区：可设置温度范围为16.0~55.0℃，用于试剂样品的解冻、酶切实验、热激反应等高温区：可设置温度范围为55.0~99.9℃，用于凝胶回收反应、酶热失活、蛋白变性处理等配置参数货号GT20401型号NaCha名称多温区工作台英文名称Multi-Temp Platform电源AC100~240 V, 50/60 Hz, 3.5 A升温时间高温区≤8 min (23.0℃升至 99.9℃ )时间范围0~23 h 59 min 59 sec中温区≤2 min (16.0℃升至 55.0℃ )温度范围高温区55.0~99.9℃降温时间高温区≤4 min (99.9℃降至 55.0℃ )中温区16.0~55.0℃中温区≤5 min (55.0℃降至 16.0℃ )低温区4.0~16.0℃低温区≤4 min (23.0℃降至 4~8℃ )温度精度±0.1℃显示屏幕7 寸 LCD 全彩触摸屏（1024*600）温控准确性 *±0.2℃温控均一性 *±0.3℃最大功率300 W外形尺寸19.4(W)×11.6(H)×26.7(D) cm净重9.3 kg* 温控准确性及温控均一性针对中、高温区 0.2 ml 孔。可选择模块订购信息货号产品描述规格GS40101S0.2 ml (96-well) Metal Block金属管架（96 孔，0.2 ml）1/pkGS40201S0.5 ml (10-well) Metal Block金属管架（10 孔，0.5 ml）1/pkGS40301S5 ml (3-well) Metal Block金属管架（3 孔，5 ml）1/pkGS40401S0.2 ml (24-well) Metal Block金属管架（24 孔，0.2 ml）1/pkGS40501S1.5/2.0 ml (10-well) Metal Block金属管架（10 孔，1.5 ml/2.0 ml）1/pk创新点：NaCha 多温区工作台，拥有三个独立温区，设置各温区的反应温度和时间，推荐用于低温加样及中、高温的温育反应。 优质的帕尔贴与精准的温度校准技术，配合复合式液体冷却循环系统，有效保证温度控制准确性与孔间温度均一性，实现快速变温。

2022年4月13日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命联合中心邓宏魁研究团队在国际学术期刊Nature杂志在线发表了题为“Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells”的研究论文，首次在国际上报道了使用化学小分子诱导人成体细胞转变为多潜能干细胞这一突破性研究成果。运用化学小分子重编程细胞命运（化学重编程），是继“细胞核移植”和“转录因子诱导”之后新一代的，由我国自主研发的人多潜能干细胞制备技术，为我国干细胞和再生医学的发展解决了底层技术上的“瓶颈”问题。多潜能干细胞具有无限增殖的特性和分化成生物体所有功能细胞类型的能力，这些神奇的特质使其在细胞治疗、药物筛选和疾病模型等领域具有广泛的应用价值，是再生医学领域最为关键的“种子细胞”。在哺乳动物自然发育过程中，多潜能干细胞只短暂存在于胚胎发育的早期阶段，随后便会分化为构成生物体的各种类型的成体细胞，丧失其“种子细胞”的特性。如何逆转这一自然发育过程，使高度分化的成体细胞重新获得类似胚胎发育早期的多潜能状态，一直是干细胞与再生医学领域最重要的科学问题之一。上世纪60年代，英国科学家John Gurdon在爪蟾中开发了细胞核移植技术，1997年Ian Wilmut团队利用该技术制备了克隆羊多莉，证明了哺乳动物高度分化的体细胞也可以被逆转为早期胚胎的初始状态，并获得了发育为整个动物个体的能力。2006年，日本科学家Shinya Yamanaka报道了使用转基因的方式可以将小鼠成体细胞重编程为多潜能干细胞，称为诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。细胞核移植和导入外源基因的方法，证明了哺乳动物体细胞可以通过重编程逆转为胚胎发育早期状态，重新获得“多潜能性”。这两项技术于2012年荣获诺贝尔生理学或医学奖。iPS技术的建立，打破了传统胚胎干细胞的伦理限制，为构建病人自体特异性干细胞系提供了全新的方法，大大加速了干细胞临床应用的进程。近年来，已开展了针对帕金森、糖尿病和癌症等多种重点疾病的细胞治疗临床试验。然而，目前细胞治疗的技术体系都是国外发展起来的，中国能否拥有原创的底层技术？长期以来，邓宏魁团队一直致力于开发调控细胞命运的新方法和建立制备干细胞的底层技术。2013年，邓宏魁团队在Science杂志发表了一项原创性的研究成果，即不依赖卵母细胞和转录因子等细胞内源物质，仅使用外源性化学小分子就可以逆转细胞命运，将小鼠体细胞重编程为多潜能干细胞（chemically induced pluripotent stem cells, CiPS细胞）。相比传统方法，化学小分子操作简便灵活，时空调控性强、作用可逆，可以对细胞重编程过程进行精确操控。另外小分子诱导体细胞重编程技术作为非整合方法，规避了传统转基因操作引发的安全问题，有望成为更安全的临床治疗手段。之后，邓宏魁团队又相继在Cell和Cell Stem Cell等杂志发表文章，详细阐明了化学重编程独特的分子机理，并进一步对小鼠化学重编程体系进行了大幅优化。随后，包括谢欣、姚红杰、裴端卿、刘林、祝赛勇等多个研究组利用相同或类似的化学小分子组合，重复和优化了小鼠化学重编程技术。化学重编程诱导多潜能干细胞的研究开辟了一条全新的体细胞重编程途径，不仅有助于更好地理解细胞命运决定和转变机制，而且为未来再生医学治疗重大疾病带来新的可能。本次研究中，邓宏魁团队首次报道了使用化学重编程的方法，成功实现了使用化学小分子将人成体细胞诱导为多潜能干细胞(人CiPS细胞)。这一技术的建立开辟了人多潜能干细胞制备的全新途径，使其向临床应用，迈进了关键一步。图1：新一代诱导多潜能干细胞技术作为高等动物，人类成体细胞特性和稳态调控的复杂性远非小鼠成体细胞可比，在表观遗传层面上存在重重障碍，严重限制了在人类成体细胞中激发细胞可塑性的可能。自2013年以来，尽管众多国际团队在小鼠化学重编程工作的启发下进行大量尝试，却一直未能解决人类成体细胞的化学重编程问题。这使得领域内普遍认为：人类成体细胞的表观遗传限制是极其严格的，很可能无法通过化学重编程激发人类成体细胞获得多潜能性。邓宏魁团队经过长期地坚持和不懈努力，突破了这一瓶颈。这一突破的关键步骤受低等动物再生过程启发。蝾螈等低等动物在受到外界损伤后其体细胞会自发的改变本身的特性，进而通过去分化获得一定的可塑性，借助这一可塑的中间状态实现肢体的再生。沿着这一思路，研究团队进行了大量化学小分子的筛选和组合，最终发现高度分化的人成体细胞在特定的化学小分子组合的作用下，同样可以发生类似去分化的现象，获得具有一定可塑性的中间状态。在此基础上，研究团队最终实现了人CiPS细胞的成功诱导。图2: 人体细胞化学重编程诱导人CiPS细胞与传统的技术体系相比，CiPS细胞诱导技术具有更加安全和简单、易于标准化、易于调控等不可替代的优势，突破了iPS技术面临的限制，具有广阔的临床应用前景。1）安全性方面，之前在小鼠CiPS细胞中已经证明，其携带的遗传突变显著少于传统 iPS 细胞，产生的嵌合体小鼠在长达 6个月的观察期内不产生肿瘤且全部健康存活。同时，人CiPS细胞分化来源的胰岛细胞移植入小鼠和非人灵长类动物模型体内，经过长期观察未发现肿瘤形成；2）在个体化制备方面，研究团队目前已在不同年龄个体来源的体细胞类型上都可实现稳定诱导人CiPS细胞；3）在细胞标准化制备方面，化学小分子具有操作简单，时空调控性强，作用可逆，合成储存方便，易于标准化生产等一系列特点，使得人CiPS细胞在标准化和规模化生产方面有着不可替代的优势。要特别指出的是，人CiPS细胞能高效制备胰岛细胞，且安全有效地改善了糖尿病猴的血糖控制，凸显了人CiPS细胞作为“种子细胞”治疗重大疾病在安全性和有效性上的巨大优势。这一研究的主要结果于今年二月发表在医学杂志Nature Medicine上。图3：人CiPS技术在生物医学领域具有广阔的潜在应用前景在此基础上，研究团队还描绘了化学重编程诱导人CiPS细胞的分子路径，揭示了化学重编程与传统转录因子重编程不同的分子机制和独特的调控机理。研究发现人CiPS的诱导以分阶段精确调控的方式发生，在早期阶段产生了特殊的中间状态。通过和低等动物再生去分化过程中细胞性质的详细比较，研究团队确认了人CiPS细胞诱导的早期阶段激活了与低等动物断肢再生早期类似的基因表达特征。更重要的是，研究团队还发现了调控这一类再生状态的关键信号通路，证明抑制过度的炎症反应，对于化学重编程诱导人体细胞重新获得类再生中间态至关重要。这一再生中间态为研究人体细胞重新激活再生基因提供了全新的思路，并且提示将来有仅通过化学小分子组合重新激活人体细胞可塑性和再生潜能的可能性，有望推动化学重编程在组织器官再生方向的应用，为再生医学研究提供新的可能途径。图4:化学重编程激活再生相关网络的分子机制综上所述，化学重编程技术体系的建立不仅在多潜能干细胞临床应用领域具有巨大的意义和价值，同时为细胞命运调控及再生生物学理论研究方面提供了全新的视角和平台。化学重编程可以精确调控细胞命运，有望成为高效制备各种功能细胞类型的通用技术，为治疗重大疾病开辟了新的途径。