质谱纯蛋白测

聚乙二醇化的多肽和蛋白质为生物治疗药物的详细结构表征带来重大挑战，这主要是由于聚乙二醇 (PEG) 具有异质性。本应用简报描述了一种联用 Agilent HPLC 及 Agilent 6520精确质量数 Q-TOF LC/MS 系统分析聚乙二醇及聚乙二醇化蛋白的方法。其使用了一种电荷剥离剂（三乙胺）作为柱后添加剂，这样有助于简化质谱图，因此可更好地阐释结果。结果表明聚乙二醇和聚乙二醇化蛋白质的质谱图质量均得到显著改善。

本应用简报介绍了如何像生物分析科学家在典型生物药理学环境下进行纯度分析那样，使用 Agilent Easy Access 软件来分析模式治疗性蛋白的批次间纯度。分析模式治疗性蛋白的批次间纯度时，将 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统与 Agilent 6530 精确质量Q-TOF LC/MS 联用，并通过 Agilent Easy Access 软件进行数据分析。LC/MS 平台拥有卓越的色谱分离度和质量精度，结合强大的数据处理能力，可简便、快速地分析批次间的蛋白纯度。本应用简化了工作流程，使用者可以快速做出决策，以作进一步的下游处理。该软件可用于比较蛋白谱图，从而确保监管机构要求的批次一致性。此外，该软件还有助于了解工艺放大或生产过程中纯化后蛋白的杂质谱图。该数据可帮助开发生物仿制药的公司在产品上市前评估其产品与原始药物的相似度，重要性不言而喻。

免疫球蛋白G，即抗体，是免疫系统用来识别和中和病原菌和病毒等异物的Y型大蛋白，在生物学上十分重要。Protein G可以结合哺乳动物IgG，与其蛋白结构上的Fc片段进行特异性识别。因此可以选用月旭Welchrom? Protein G Tanrose 4FF(5mL，00081-12012)来分离纯化牛初乳粉中的IgG蛋白、Welchrom? BC-10重力柱(8.3mL，00051-32022)提高纯度，并采用月旭Xtimate? SEC-300（7.8*300mm，5um）进行色谱检测分析实验结果。

本实验使用Thermo ScientificTM Q Exactiv HF 超高分质谱仪测试了超高场Orbitrap在DIA分析方面的性能。实验使用1小时梯度，分析仅500ng上样量的Hela细胞总蛋白裂解液，重复三针。结果显示，三针DIA分别定量到27558、27604、27483种肽段和4067、4080、4073种蛋白。谱图库中95%的蛋白都获得了可靠的DIA解析(Q0.01)，灵敏度极高；峰面积CV值20%的肽段占90.3%，重现性极佳。

人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)检测试剂盒人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)抗原、生物素化的人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

随着“一小时酵母蛋白质组”的实现, 短梯度下实现蛋白质组深度覆盖成为可能.本文利用全新 Q-OT-qIT 三合一质谱系统进行“一小时蛋白质组”分析与优化. 50 min 有效梯度, 单次实验分别从1 μ g和50 ngHeLa全蛋白中鉴定到20860和14100条肽段, 对应到3865和 2877 个非冗余蛋白, 而目前的文献报道至少需要 2~3 h. 同时, 本文考察了 Q-OT-qIT 碎裂模式、检测方法、最大注入时间和自动增益控制等参数对蛋白质组快速分析的影响, 证明了不同采集方法间的互补性, 阐述了不同扫描参数对鉴定结果的影响. 此外, 还讨论了Q-OT-qIT 的并列运行原理和扫描组合模式, 为不同实验目的和样本类型的蛋白质组快速分析奠定了基础.

对于重组蛋白的分离纯化，一般都会在进行载体构建时，选择N端或C端加上一个标签，如GST，HIS6，FLAG和MBP等，带了这些标签的蛋白就可以通过亲和吸收的填料来到达初步纯化的目的，亲和纯化相对简单，带有标签的蛋白就会吸附到相应的填料上，而不带标签的蛋白会直接流出，简单的清洗杂蛋白后，只需要再把吸附在上面的蛋白洗脱下来即可，几乎不需要摸索分离纯化的条件。含有所需蛋白的分泌液或者裂解液一般体积都相对比较大，最好使用蛋白存化系统（Clear First 2000）的上样泵上样；进完样后，进行杂蛋白的清洗，再用特异的洗脱液将蛋白洗脱，通过自动接收器接收分离后样品即可，整个过程基本可以实现自动化操作。

重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白，是由人干扰素α2b和人血清白蛋白2种编码基因通过基因工程技术构建的毕赤酵母工程菌，通过诱导表达产生的胞外分泌蛋白。干扰素类重组蛋白药品是目前临床上广泛用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等顽症的有效药物。2015年版《中华人民共和国药典》对重组蛋白制品的纯度要求为不低于95.0%。本篇应用中，作者采用了离子交换色谱柱TSKgel Q-STAT建立了测定重组人血清白蛋白干扰素α2b 融合蛋白药物纯度的方法，经验证该方法适合 rIFNα2b-HSA纯度检测。

人胆固醇酯转移蛋白(CETP)检测试剂盒人胆固醇酯转移蛋白(CETP)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人胆固醇酯转移蛋白(CETP)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人胆固醇酯转移蛋白(CETP)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人胆固醇酯转移蛋白(CETP)抗原、生物素化的人胆固醇酯转移蛋白(CETP)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胆固醇酯转移蛋白(CETP)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

乙醇梭菌蛋白是用乙醇梭菌作为发酵菌种，利用含有一氧化碳的工业尾气和氨水为主要原料进行液态发酵、离心分离浓缩、喷雾干燥，人工合成的一种新型单细胞蛋白产品。乙醇梭菌蛋白饲料不仅蛋白质含量高，营养丰富，并且氨基酸结构平衡，易于动物消化，同时还具有优异的饲料蛋白质原料加工特性，富含核苷酸等功能性物质，有利于动物肠道与肝脏的健康。本实验参照《GB/T 24318 杜马斯燃烧法测定饲料原料中总氮含量及粗蛋白质的计算》使用杜马斯定氮仪对乙醇梭菌蛋白的粗蛋白含量进行测定。

糖蛋白在细胞内部，细胞膜和细胞外均有发现，大部分蛋白质是糖蛋白。对糖蛋白的检测和分析发现，糖蛋白中糖组分的结构和功能具有多样性。糖蛋白中的糖通常是不同种类的，而且是由一些可控数量的单糖组成。糖基化的多样性与细胞周期，细胞分化和发展的状态有关。

人视黄醇结合蛋白(RBP)检测试剂盒人视黄醇结合蛋白(RBP)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人视黄醇结合蛋白(RBP)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人视黄醇结合蛋白(RBP)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人视黄醇结合蛋白(RBP)抗原、生物素化的人视黄醇结合蛋白(RBP)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人视黄醇结合蛋白(RBP)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

乙醇梭菌蛋白是一种单细胞蛋白，是以含一氧化碳的工业尾气为原料，由乙醇梭菌为发酵菌种生产的一种新型菌体蛋白。人工合成乙醇梭菌蛋白目前主要应用还是在动物饲料上。乙醇梭菌蛋白饲料不但蛋白质含量高，营养丰富，并且氨基酸结构平衡，易于动物消化，同时还具有优异的饲料蛋白质原料加工特性，富含核苷酸等功能性物质，有利于动物肠道与肝脏的健康。本实验参照《GB/T 6432 饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》使用凯氏定氮法对乙醇梭菌蛋白中的蛋白质含量进行测定。

仪器：Clear-First蛋白3000。样品：BHb（牛血红蛋白）、BSA（牛血清白蛋白）、脂肪酶的混合样品，3种蛋白均为2mg/mL。其中BHb购自国药，BSA购自世泽生物，脂肪酶购自沃凯。上样量：1 mL。色谱柱： Hitrap™ DEAE FF，5mL。缓冲液：A管路为20 mM Tris-HCl（pH8.5），，B管路为20 mM Tris-HCl（pH8.5）其中含0.5 M NaCl。流速：1 mL/min。检测波长：280nm，385nm。

使用MST技术检测跨膜蛋白TRKB与脑胆固醇和抗抑郁药物的结合。其中跨膜蛋白TRKB并未纯化，直接将过表达GFP-TRKB的HEK293T细胞裂解后取上清。以GFP-TRKB融合蛋白作为荧光信号源，进行MST检测。

促胰岛素分泌肽( Exendin-4) 是一种来源于美洲希拉毒蜥唾液中的含39个氨基酸的多肽，其作用机制与GLP-1类似，能够促进胰岛素的分泌、增加胰岛素敏感性、改善胰岛细胞功能。促胰岛素分泌肽融合蛋白( Exendin-4-Fc fusion protein，简称E4F4) 是将促胰岛素分泌肽( Exendin-4)与人IgG的Fc片段相连重新构建的结构蛋白，可在不影响药效的同时延长了药物的体内半衰期，有效改善Exendin-4 在机体内的药物代谢动力学特性。文献中采用了尺寸排阻色谱柱TSKgel G2000SWXL色谱柱（I.D. 7.8 mm× 30 cm）建立了促胰岛素分泌肽融合蛋白纯度测定方法，经验证该方法适合E4F4纯度检测。

引起过敏的物质称为过敏原,一般为蛋白质类物质。 随着食物过敏患者的增多,以及可能导致过敏性休克甚至死亡等严重后果,已建立了一系列针对过敏原的法规及检测方法,包括核酸法(PCR)和酶联免疫法(ELISA)等。 新兴的质谱法(MS)灵敏度高、假阳性概率低,并具有方法开发快速、运行成本低等优势。葡萄酒酿造过程中需要加入澄清剂去除沉淀物质,使酒液获得长期稳定性。 酪蛋白是常用的澄清剂之一。 酪蛋白是一种来源于牛乳的过敏原,残留在葡萄酒中会对过敏人群产生危害。 但是葡萄酒,特别是红葡萄酒含有大量单宁等鞣质,单宁与蛋白质之间存在多点疏水键和氢键的作用,有很强的蛋白结合能力。 单宁常用作酶抑制剂使酶失活。 单宁极大地抑制了葡萄酒蛋白的提取与酶解,传统蛋白提取方法(超滤、透析、有机溶剂沉淀等)用于葡萄酒时回收率只有 20% ~30%。 因此,关于葡萄酒过敏原质谱分析的报道很少,研究对象也集中在单宁含量很低的白葡萄酒,对于含有大量单宁的红葡萄酒的前处理和质谱分析仍无成熟的策略。已报道的方法如十二烷基硫酸钾(KDS)法、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)法等,提取后蛋白仍需要电泳去除单宁和两性电解质,工作量大,分析通量低,蛋白质的回收率很低。交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)是 PVP 交联后形成的颗粒(约 110 μ m),具有很强的吸附能力。PVPP 竞争性地与单宁结合,释放蛋白,可以有效去除单宁等多酚类物质。本研究利用 PVPP 建立了快速、高效的红葡萄酒蛋白提取与酶解方法,使前处理时间缩短到 2 h 之内,回收率达到 80% 以上。 将本方法与三重四极杆液相色谱鄄串联质谱联用(LC-MS/ MS)结合,分析了红酒中 3 种亚型的酪蛋白,检出限达到 10 μ g/ L,比目前报道的方法提高了至少一个数量级。

仪器：蛋白3000样品：乳清蛋白粗品上样量：3 mL色谱柱：60 cm× 26 mm填料：Sephacryl S-200（GE）缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH6.8），0.1 M NaCl流速：1 mL/min

尽管蛋白质生物制品总体来说是相对稳定的分子，但是在生产、制剂和储存过程中，还是会发生一些化学修饰和降解反应。许多蛋白质在纯化过程中可能发生水解断裂，而断裂形成的片段污染物可能会导致患者免疫反应的不良后果。由于存在化学修饰和降解反应，因此需要可靠而且灵敏的方法来评价研发和生产过程中蛋白质的纯度和结构完整性。 完整蛋白质、完整亚基或结构域的精确质量测定对于蛋白质序列组成的快速确认和翻译后修饰、降解和样品处理引起的分子变异的鉴定非常有帮助。电泳、色谱和质谱 (MS) 技术是完整蛋白质及其降解物分子量测定的最常用技术。其中一种最常用的分析是体积排阻色谱 (SEC)，它用于测定蛋白质是否为单体结构，并且在生产和制剂过程中是否始终保持这一结构。

人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)检测试剂盒人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)抗原、生物素化的人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人视黄醇结合蛋白4(RBP-4)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

摘要：介绍了玉米种子盐溶蛋白电泳鉴定真伪及纯度的操作技术, 并对该方法在实际应用中应参照的国标及存在的问题进行了分析和探讨。关键词玉米 电泳 品种纯度 操作技术

apo-A1 简介载脂蛋白A1是一种蛋白质，由APOA1基因编码。作为高密度脂蛋白颗粒的主要成分，它在脂质代谢中具有特殊作用。APOA1基因位于第11条染色体上，具体位置为11q23-q24，该基因包含4个外显子。APOA1编码一个28.1kDa的蛋白质，由243个氨基酸组成；通过质谱数据观察到21个肽。载脂蛋白A1是血浆中高密度脂蛋白颗粒的主要蛋白成分。从肠道细胞分泌的乳糜微粒也含有载脂蛋白A1，但它在血液中迅速转移到高密度脂蛋白。该蛋白作为高密度脂蛋白颗粒的一个组成部分，通过接受细胞内的脂肪（包括动脉壁内的巨噬细胞，这些巨噬细胞已被氧化的低密度脂蛋白颗粒摄入的脂肪超载），使脂肪分子外流到其他地方，包括回到低密度脂蛋白颗粒或到肝脏排泄出来。它是卵磷脂胆固醇转移酶（LCAT）的辅助因子，该酶负责大多数血浆胆固醇酯的形成。载脂蛋白A1还被分离为前列环素（PGI2）稳定因子，因此可能有抗凝血作用。它经常被用作预测心血管疾病的生物标志物。

本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物- 多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。

20 - 40%)。串联质谱多反应监测 (MRM/SRM)定量方法，一直以来就是定量的黄金标准，在小分子定量上早已成熟使用，随着液相色谱和串联质谱技术的提高，越来越多的生蛋白（肽段）定量的意义及出现 MRM 质谱技术平台的缘由化实验室开始大量采用串联质谱技术为基础的蛋白（肽段）定量流程。MRM 肽段定量方法的优点很多，它利用蛋白专属的肽段序列完成定量分析，一次运行可同时分析几十到几百种的蛋白，具备高通量的定量分析能力。特别是 2012 年，方法论领域的权威期刊《Nature Methods》将基于三重四极杆质谱 (QQQ) 平台的 MRM/SRM 定量思路的靶向蛋白质组学 (Targeted proteomics) 技术列为当年的年度方法，确立了目标蛋白定量分析的权威策略。近年来该杂志陆续发表了多篇论文，对 QQQ-MRM/SRM 思路成功应用于目标蛋白定量分析进行了持续报道。随着质谱灵敏度的大幅提高，以大流速常规液相色谱 (LC) 取代纳流液相色谱 (Nano-LC) 所组成的 MRM 肽段定量方法，代表着蛋白定量分析的最高技术标准，极大地促进生物化学及各种新应用快速向前发展，广泛应用在蛋白质组学、生物制药等研究领域，并迅速朝着诸如食品、环境、临床等更宽的应用范围发展。

静态光散射与尺寸排阻色谱的联用，在单克隆抗体（mAbs）的纯度检验或下游纯化的快速检测方面来说是一项重要手段。光散射也是在荧光检测之外蛋白多聚体的最敏感检测方法之一。

本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物- 多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。

?肌动蛋白是真核细胞骨架蛋白的重要组成部分，具有多种重要的细胞功能，包括细胞分裂、细胞极性、伤口愈合、肌肉收缩等。本篇文章介绍了一种改进的肌动蛋白表达和提纯方法，使用SPEX 冷冻研磨仪研磨法破碎酵母细胞，适用于所有配备分子生物学设备的实验室中，这将极大地促进肌动蛋白细胞骨架的升华和细胞生物学研究。

人葡萄球菌蛋白A(SPA)检测试剂盒人葡萄球菌蛋白A(SPA)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人葡萄球菌蛋白A(SPA)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人葡萄球菌蛋白A(SPA)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人葡萄球菌蛋白A(SPA)抗原、生物素化的人葡萄球菌蛋白A(SPA)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人葡萄球菌蛋白A(SPA)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

本文展示了应用MALDImini-1 紧凑型基质辅助激光解吸电离数字离子阱质谱（MALDI-DIT）对低浓度牛血清白蛋白（BSA）（上样量100 fmol）进行分子量检测的案例，表明MALDImini-1检测蛋白质分子量的灵敏度较高，结果准确，可以满足m/z 650-70000以内蛋白质分子量检测的要求。

岛津基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测疫苗各亚基存在分布与比例，直接得到了样品单电荷离子、二电荷离子的分子量信息，结果与理论一致。分析速度快、仪器维护方便、性能卓越，是蛋白类疫苗亚基分析的有力工具。