质谱峰分子量

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 自质谱成像技术于二十世纪80年代前半期诞生以来，至今为止不断持续着技术改革，并被广泛运用于以新药研究和代谢产物研究领域为首的众多领域中。如今仍以提升灵敏度和空间分辨率、重现性等为目标，不断进行着技术改良。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 同时，也开发出多种离子化所需的基质，如何从这些基质中选出适用于检测目标化合物的基质成为重点。 span style=" text-indent: 2em " 除基质选择外，其涂布方法也会对分析结果造成很大影响，因此，现有多个应用于检测目标化合物的基质涂布方法正在研究中。大致可分为喷雾法和升华法两种方法，两种涂布方法均有自己的优缺点，现阶段经常会同时使用两种方法。本公司开发了能控制基质膜厚的基质升华涂布装置iMLayer（图1），对涂布方法进行研究。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 我们针对以往难以重结晶的基质9AA，开发了升华后重结晶的方法，并在此进行报告。此外，还将对小鼠肝脏中低分子量代谢产物的MS成像结果示例进行介绍。 /p p style=" text-align: right text-indent: 2em line-height: 1.75em " ——R.Yamaguchi, E.Matsuo, T.Yamamoto /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 1、不同基质涂布方法对MS成像分析造成的影响 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 基质涂布方法对基质的结晶形成和MS成像分析造成的影响如表1所示。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 与升华法相比，通过喷雾法生成的基质的结晶较粗，并可能因样本中所含成分的渗漏导致空间分辨率降低。均匀性较差，基质溶液干燥后结晶时会依赖湿度和温度等周围环境，因此重现性也会变差。另一方面，样本中所含化合物的提取效果较好，可能提高检测灵敏度。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 相比之下，升华法具有结晶较细、难以渗漏、均匀性好、重现性良好的特点，是高空间分辨率成像所不可或缺的方法。但相对的，其样本中成分的提取效果不佳，在灵敏度上可能存在不利的一面。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 实际的测量灵敏度依赖于检测化合物的结构。例如，在分析磷脂质等时，采用升华法便具有足够的灵敏度，诸如胺碘酮等药物可以足够的灵敏度完成MS成像（参考应用文集B61）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 另一方面，在检测小鼠肝脏等器官中含有的ADP 和ATP 等低分子量代谢产物时，通过升华法进行基质涂布，由于没有任何提取效果，无法得到足够的灵敏度。因此，绝大多数例子都是通过喷雾法涂布9AA来实施MS成像，但其空间分辨率相对较低。于是，我们对将DHB和CHCA上使用的升华后重结晶法涂布9AA所需的条件进行了研究。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/0178e2f4-5edd-42fd-ab37-3b27f1e3173b.jpg" title=" 微信截图_20200619165723.png" alt=" 微信截图_20200619165723.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 图1 基质升华装置iMLayer /p p style=" text-align: center " 表1 基质涂布方法对结晶形成和MS成像分析造成的影响 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/962223c2-c637-4894-9498-e953c6d6b688.jpg" title=" 2.png" alt=" 2.png" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 2、基质升华后重结晶法 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " 对9AA进行升华后重结晶。如图2所示，将含有5%甲醇的滤纸和升华处理后的样本放入相同容器中，于37℃的恒温环境下静置5分钟。此时，滤纸中的5%甲醇蒸发，渗入样本中，在提取样本中化合物的同时会使少许9AA结晶溶解。之后将其真空干燥器内干燥10分钟，使溶解的9AA进行重结晶。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/b1b946ad-81b9-4670-bd42-0b2b1b03f739.jpg" title=" 33333333333333.png" alt=" 33333333333333.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " 图2 9AA升华后重结晶的方法 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/8767d240-e8eb-44fc-8470-cff5822571a1.jpg" title=" 444444444.png" alt=" 444444444.png" / /p p style=" text-align: center " 图3 成像质谱显微镜iMScopeTRIO /p p style=" text-align: center " 表2 iMScope i TRIO /i 测量参数 /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/69636f83-0667-4f8a-a02b-4d1c757bc977.jpg" title=" 55555555555.png" alt=" 55555555555.png" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 3、使用升华后重结晶法提高MS成像灵敏度 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 对9AA升华后重结晶的小鼠肝脏样本，使用成像质谱显微镜iMScope& nbsp i TRIO /i （图3），根据表2的参数进行质谱成像分析。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 对比升华法进行基质涂布样本与升华后重结晶样本的分析结果、比较其分析区域的平均质谱图（图4）。仅采用升华法时、能强烈检测到基质9AA的峰（m/z 385.14）（图4▼），基本上检测不到低分子量代谢产物的峰，但通过实施升华后重结晶，使来自低分子量代谢产物的峰强度增加（图4▼等），确认其提升检测灵敏度的效果。此外，其他多个低分子量代谢产物的MS图像，通过升华后重结晶的处理，能够获得更为清晰的MS图像（图5）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 针对难以重结晶的9AA开发的升华后重结晶方法，充分利用升华法的优势成功实现了无损且高灵敏度的MS成像分析。 /p p span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/0bbf3127-6052-4b6a-af7e-a0c6fc57f542.jpg" title=" 6.png" alt=" 6.png" / /p p style=" text-align: center " 图4 质谱图（升华法和升华后重结晶法的比较） /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/de208828-8702-40d6-8202-037e64b3f190.jpg" title=" 7.png" alt=" 7.png" / /p p style=" text-align: center " 图5 MS图像（升华法和升华后重结晶法的比较） /p p br/ /p

质谱仪器作为一种质量检测仪器，被应用到各个学科领域中，尤其是在化学化工、环境能源、医药、生命及材料科学等领域发挥着重要作用。在常规质谱分析中，被分析物质首先被离子化，随后各种离子被引入真空中的质量分析器，在分析器中的电场或磁场作用下，离子的运动特性随其质荷比不同而产生差异，因而造成时空上的分离，并由检测器依次检测出来。而在这种原理下，质谱仪测量的是离子的质荷比（m/z)，而不是质量本身。利用质谱仪器对样品的分析过程中，样品的雾化过程十分关键。目前，常用的电喷雾技术原理是由John Fenn提出的电喷雾电离（ESI）技术，这一理论也获得了2002年的诺贝尔化学奖。通常对蛋白质这种大分子来说，ESI质谱中都会呈现多种价态的谱峰群，群落中的每一组为某个电荷态该蛋白质的各个同位素峰、盐峰以及加合物峰等。由于电荷态z通常是连续的整数分布（例如z = 11，12....21,22...)，人们可以通过计算不同电荷数对应的群落m/z的间隔来推算各组的电荷数z，进而求出实际的质量m的分布，也可以使用软件进行解卷积得到m分布。这种分析手段对于分析分子量较小（分子量在5万以下）、简单纯净的蛋白样品还是很有效的。然而，在实际应用中对天然蛋白和病毒颗粒的分析却不那么简单。随着分子量上升，分子结构越来越复杂，各种翻译后修饰使被测蛋白的分子量出现差异化，很宽的质量分布（可达上千Da）使得不同价态的峰群连接在一起。如图1所示，这种缺少电荷状态以及同位素峰的“死亡驼峰”，我们很难通过解卷积的形式进行分析。并且，对于很多糖蛋白，分子量超过3、4万就出现峰群交叠，无法用解卷积软件来获得分子量的分布信息。因此，对于大生物分子的质谱分析，仅靠提高仪器的分辨率是无济于事的。在这种情况下，电荷检测质谱（CDMS）技术便成为了我们的“救命稻草”。电荷检测质谱（CDMS）通过同时测量单个离子的质荷比和电荷数，进而计算获得离子质量m。因此，相较于其他类型质谱，CDMS技术的关键是如何准确地测量单个离子的电荷。目前，电荷检测质谱技术还没有现成的商品化仪器，只有能够自己开发质谱仪器硬件，或自己改编FTMS软件的专家才能进行这样的实验。而在今年的ASMS会议上，赛默飞公司重磅推出了直接分析质谱技术（DMT），并将其结合在了Orbitrap上，这使得超大分子量的复杂蛋白的直接质谱检测成为了可能。直接分析质谱技术其原理是：在Orbitrap中检测来自离子沿中心电极的中心轴旋转的轴向频率，进而确定离子的m/z信息；与此同时，来自外电极上的感应电荷振幅也会被检测，从而确定离子的电荷z的信息。直接分析质谱技术模式为 Orbitrap 质量分析仪增加了电荷检测功能，能够同时测量数百个单个离子的质荷比 (m/z) 和电荷数 (z)。这使得 Orbitrap 质量分析仪可以直接计算分析物的质量，而不需要根据 m/z 去卷积。根据 m/z 去卷积的方法依赖于测量结果中已分辨的电荷状态和/或同位素分辨的信号。直接分析质谱技术模式提高了分辨率，并且扩展了动态范围，提高了可获得的质量测量结果的上限，同时由于单个离子测量的灵敏度较高，可以从浓度明显较低的样品中采集到更有价值的数据。

MALDI-TOF对小分子化合物分子量的快速确认小分子通常指分子量小于1000 Da（尤其小于400 Da）的有机化合物，包括天然产物（生物体合成）及各类人工合成的有机小分子。质谱技术由于可以精确测量各类化合物的质量，被广泛应用于小分子的分子量表征及结构鉴定工作。通常小分子分子量表征常用手段是LCMS，实则MALDI-TOF同样可以用于小分子化合物的分子量确认，且具有更高的效率。MALDI-TOF MS表征小分子分子量的方案特点：1快！每天可分析数千个样品2直接上样分析，无需样品分离3所需样品量较少，单次上样体积只需1 μL以内4除可溶性样品外，还能够分析难溶性样品MALDI-TOF分析小分子的工作流程小分子测试案例分享01各类化合物（原料、物料、产品）分子量及杂质检测在药品、化工品等产品生产过程中，对投入的原料、物料以及终产品进行分子量和杂质检测，是生产质量控制的重要内容。下图中，通过质谱信息可以直接了解寡核苷酸合成原料亚磷酰胺单体的分子量及杂质信息。寡核苷酸合成原料亚磷酰胺单体质谱图02小分子有机合成反应跟踪、产物确认在有机合成中，鉴定反应产物和了解反应进程极其重要。MALDI-TOF MS可以快速测量化合物进行半定量反应跟踪和产物确认。通过化合物单同位素峰的分布，还能轻松识别出溴和氯的存在与否。下图中原料双（氯甲基）苯的信号强度在反应18小时后降低，产物双（溴甲基）苯在反应18小时后强度增加。反应不同时间获得的反应产物的质谱图比较03有机功能材料合成确认有机功能材料包括有机光电材料、有机导电材料、有机磁性材料、有机催化材料等。MALDI-TOF MS可以快速进行有机功能材料的合成确认。下图中，通过样品同位素分布模式及质量数的实际检测结果与理论值的比较，可以准确判断产品合成是否成功。半导体材料及有机发光二极管材料的质谱图04难溶性颜料分子量分析颜料通常不溶于水和一般有机溶剂，常见的颜料包括无机颜料、偶氮颜料、钛菁颜料等。由于颜料的难溶解性，不能使用传统LCMS或GCMS方法进行分子量检测，而MALDI-TOF MS由于不需要分离，分析时不受溶解性限制，可以检测不溶性颜料的分子量，用于鉴别颜料种类或者颜料生产合成质控。难溶性颜料钛菁红的质谱图结语MALDI-TOF MS具有前处理简单、能够快速获取从低分子量到高分子量各类样品的分子量信息，无需分离、不受样品溶解性限制等优点，为医药行业药物发现、有机合成产物确认、化工领域颜料、乳化剂等各类化工产品分子量分析、有机功能材料的合成确认提供快速检测手段。撰稿人：顿俊玲本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

各有关单位：经研究，国家标准委决定对《焊缝无损检测 磁粉检测 验收等级》等225项拟立项国家标准项目公开征求意见，征求意见截止时间为2023年7月5日。请登录请登录标准技术司网站征求意见公示网页http://std.samr.gov.cn/gb/gbSuggestionPlan?bId=10001282，查询项目信息和反馈意见建议。2023年6月5日相关标准如下：#项目中文名称制修订截止日期1蛋白质分子量测定 液相色谱-飞行时间质谱联用法制定2023-07-052肝素酶活性的测定制定2023-07-053硫酸软骨素酶活性的测定制定2023-07-054葡萄糖氧化酶活性检测方法制定2023-07-055包装袋 试验条件 第1部分：纸袋制定2023-07-056产品几何技术规范(GPS) 坐标测量机(CMM)确定测量不确定度的技术第3部分：应用已校准工件或标准件修订2023-07-057产品召回 生产者安全管理韧性评价制定2023-07-058电梯、自动扶梯和自动人行道的电气要求 信息传输与控制安全制定2023-07-059电梯安全要求 第2部分：满足电梯基本安全要求的安全参数修订2023-07-0510工业废硫酸的处理处置规范修订2023-07-0511工作场所环境用气体探测器 第1部分：有毒气体探测器性能要求制定2023-07-0512工作场所环境用气体探测器 第2部分：有毒气体探测器的选型、安装、使用和维护制定2023-07-0513合格评定 管理体系审核认证机构要求 第 14 部分：文件管理体系审核与认证能力要求制定2023-07-0514化学品 快速雄激素干扰活性报告（READR）试验制定2023-07-0515化学品 水-沉积物系统中穗状狐尾藻毒性试验制定2023-07-0516化学品 液态粪肥中的厌氧转化试验制定2023-07-0517化学品 鱼类细胞系急性毒性：RTgill-W1细胞系试验制定2023-07-0518环境试验 第2部分：试验方法 试验：温度/湿度/静负载综合制定2023-07-0519家用燃气快速热水器 通用技术规范制定2023-07-0520腈水合酶纯度和活性的测定制定2023-07-0521跨境电子商务 海外仓服务质量评价指标制定2023-07-0522实验动物 动物模型鉴定与评价技术规范制定2023-07-0523塑料 丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS) 模塑和挤出材料 第1部分：命名系统和分类基础修订2023-07-0524塑料 聚醚醚酮（PEEK）模塑和挤出材料 第1部分：命名系统和分类基础制定2023-07-0525搪玻璃层试验方法 第6部分：高电压试验修订2023-07-0526无损检测仪器 超声检测设备的性能与检验 第1部分：仪器修订2023-07-0527无损检测仪器 超声检测设备的性能与检验 第2部分：探头修订2023-07-0528无损检测仪器 超声检测设备的性能与检验 第3部分：组合设备修订2023-07-0529项目、项目群和项目组合管理 项目管理指南修订2023-07-0530项目成本管理制定2023-07-0531消费品缺陷工程分析 危险温度点测量方法制定2023-07-0532消费品缺陷线索采集与评估规范制定2023-07-0533医疗器械 制造商的上市后监督制定2023-07-0534邮政业术语修订2023-07-0535真空技术 真空计 皮拉尼真空计的规范、校准和测量不确定度制定2023-07-05

贾伟 沃特世科技（上海）有限公司实验中心 对蛋白药的分子量进行测定，可以在完整蛋白水平，对其进行宏观表征，以初步确定蛋白的表达是否正确。BiopharmaLynxTM软件中，专门设计了对蛋白整体分子量测定及表征的多种功能，它具有以下特点。 ■ 通过原始质谱数据，计算出蛋白分子量。 ■ 自动标注蛋白的各种不同修饰形态。 ■ 以直观方式，比较样品与标品间差异。 ■ 自动计算蛋白质的各种修饰形式间的峰强度比例。 ■ 界面友好、直观，操作简单。 通过原始质谱数据，计算分子质量，是蛋白分子量测定的基本功能。图1中左上为免疫球蛋白IgG的原始质谱数据，右下为软件分析后，得出的IgG分子质量信息。通过BiopharmaLynx软件的自动计算功能，复杂的质谱数据成为了直观的分子量形式。图1中，绿底色图为标准品蛋白的分子质量分布数据，蓝底色图为样品蛋白的分子质量分布图。在BiopharmaLynx给出的结果中，IgG的具有多个分子质量形式，这是由于其含有多种糖基化修饰的原因。 图1. BiopharmaLynx软件的完整蛋白质量分析界面。 图中的紫色线条直观地显示出了样品蛋白与标品的质量分布差异差异。观察紫色线条形态可以发现，样品IgG具有更多的大分子量糖基化修饰形式，而标品蛋白中的小分子量糖型修饰较多。当将鼠标指针放置于峰尖时，将自动出现此处蛋白名称、修饰种类、峰强度、色谱保留时间等信息。通过以上两种信息，可以简单、直观地找到两者的差异之处了。 BiopharmaLynx软件可根据用户设置，对蛋白的不同修饰情况，自动标注。除内置的90种修饰外，用户还可根据需要自行创建修饰方式。特别是，考虑到生物蛋白药的一些具体情况，BiopharmaLynx内置了一些蛋白表达药品常见的蛋白改变修饰，如蛋白C端的Lysine缺失等（图2红色箭头指向）。这些细节设计，会帮助使用者极大地提高工作效率，节省精力。 图2. 使用BiopharmaLynx软件的修饰设置界面。 BiopharmaLynx软件对蛋白各种修饰间的比例也可以直观地给出初步分析结果（图3）。 作为一家在液相与质谱技术都占有领先优势的企业，沃特世更提供了全面的蛋白分子量分析方案，包括色谱柱、色谱梯度方法、质谱条件等一系列已优化完成的实验操作流程(图4)。使用此整体解决方案，仅仅使用0.5微克的IgG蛋白，在4分钟内，就可完成液质数据采集全过程。此方案也包括对还原后IgG的分析方法(图4右上)。 图4. 完整及还原后IgG质量测定解决方案示意图。 参考文献 (1) Rapid Profiling of Monoclonal Intact Antibodies by LC/ESI-TOF MS. Waters Application Note, 2007, 720002393 EN (2) Rapid Screening of Reduced Monoclonal Antibodies by LC/ESITOF MS. Waters Application Note, 2007, 720002394 EN (3) Characterization of an IgG1 Monoclonal Antibody and Related Sub-Structures by LC/ESI-TOF MS, 2007, 720002107 EN (4) Assessing the Quality and Precision of T herapeutic Antibody LC/MS Data Acquired and Processed using Automated Workflows. Poster presented at the ASMS meeting. 2008, 720002687 EN (5) Efficiently Comparing Batc hes of an Intact Monoclonal Antibody using t he Biop harma Lynx Software Package. Waters Application Note, 2008, 720002820 EN 联系方式： 叶晓晨 沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部 xiao_chen_ye@waters.com 周瑞琳(GraceChow) 泰信策略(PMC) 020-83569288 13602845427 grace.chow@pmc.com.cn

脂溶性聚合物环氧树脂及甲基硅油分子量分布测定刘兴国 熊亮 曹建明 金燕美丽而寒冷的冬天又到了，室外大雪纷飞，喜欢运动的小伙伴们由户外转战室内，场馆内羽毛球、乒乓球、篮球大战相继上演，运动的身姿和蓝绿色地面、明亮的篮板构成了一道道靓丽的风景线。你可知道这漂亮的场地和器材是用什么材料制造的吗？学化学的你可能回答：“有机材料。”其实这些都是聚合物材料，绿色和蓝色的防滑地面材料为环氧树脂，有机玻璃的篮板材料为聚甲基丙烯酸甲酯。这些均为脂溶性聚合物材料的产品，它们已渗透到日常生活和高端科技的方方面面，从每天要用到的塑料袋到航天材料都可看见它们的身影。 今天，飞飞给大家重点介绍两种脂溶性聚合物。一种是低分子型环氧树脂，是由双酚A和环氧丙烷在氢氧化钠作用下缩聚而成，室温下为黄色液体或半固体，耐热、耐化学药品、电气绝缘性好，广泛用于绝缘材料、玻璃钢、涂料等领域，是常用的基础化工材料。另外一种为甲基硅油，它具有突出的耐高低温性、极低的玻璃化温度、很低的溶解度参数和介电常数等，在织物整理剂、皮革涂饰剂、化妆品、涂料和光敏材料等领域广泛应用。 分子量分布是表征聚合物的重要指标，对聚合物材料的物理机械性能和成型加工性能影响显著。常用测定方法有：粘度法、激光光散射法、质谱法和体积排阻色谱法 （SEC法），其中凝胶渗透色谱法（GPC法）作为体积排阻色谱法的一类，方便快捷、设备普及，具有广泛适用性。通过本文，飞飞给大家介绍以聚苯乙烯为标样，GPC法测定低分子量环氧树脂以及甲基硅油分子量的方法，通过对分子量分布的准确控制可以很好地保证产品的质量。变色龙软件GPC扩展包可以非常方便地将采集的GPC数据进行处理，快速地得到分子量分布的信息，而且该扩展包完全免费。 本实验仪器配置如下：仪器：赛默飞 U3000高效液相色谱仪泵：ISO3100 Pump自动进样器：WPS 3000SL Autosampler柱温箱：TCC3000 Column Compartment检测器：ERC 521示差检测器变色龙色谱管理软件 Chromeleon CDS 7.2 1. 环氧树脂分子量测定双酚A型环氧树脂基本结构及以它为材料制造的体育馆环氧地坪见图1：图1 双酚A型环氧树脂基本结构及体育馆环氧地坪色谱条件如下：分析柱：TSKgel G2500HXL 300*7.8mm，P/N:0016135（适用分子量范围100-20000）；TSKgel G3000HXL 300*7.8mm，P/N:0016136（适用分子量范围500-60000）；TSKgel G5000HXL 300*7.8mm，P/N:0016138（适用分子量范围1000-4000000）；三根色谱柱串联分析。柱温：25℃RI检测器：过滤常数：2s，温度：35℃流动相：四氢呋喃，流速1.0mL/min进样量：15µL 对照品为聚苯乙烯，分子量分别为162，370，580，935，1250，1890，3050和4910；称取适量对照品用四氢呋喃超声溶解，浓度0.02mg/mL。样品用四氢呋喃溶解，浓度0.1mg/mL，测定谱图见图2。 图2不同分子量聚苯乙烯对照品测定谱图注：580和370两个对照品出厂报告上polydispersity多分散系数分别为1.13和1.15，分子量集中度差，所以峰形呈现为多簇小峰。其余对照品多分散系数均小于1.05，峰形呈对称单峰。 校正曲线及相关系数如下： 图3 校正曲线校正曲线方程y=-0.0006x3+0.0502x2-1.5496x+20.4439，相关系数R=0.9998。不同厂家不同批次环氧树脂样品测定结果如下： 表1 环氧树脂样品测定结果样品名称 重均分子量Mw样品-1 387样品-2 401样品-3 396 2. 甲基硅油分子量测定测试甲基硅油的分子量及其分布，常用的GPC方法是采用甲苯或四氢呋喃作为流动相，但是由于甲苯属于管制类试剂，不易购买，因此飞飞采用四氢呋喃（THF）作为流动相来测定硅油的分子量及其分布，结果显示分离与色谱峰形均较好。对照品为聚苯乙烯，分子量分别为1210，2880，6540，22800，56600和129000；称取适量对照品用四氢呋喃超声溶解，浓度约1.0mg/mL。样品用四氢呋喃溶解，浓度1mg/mL。色谱条件如下：分析柱：Shodex KF-805L 8.0*300mm（适用分子量范围300-2000000）；柱温：30℃RI检测器温度：31℃流动相：四氢呋喃，流速0.8mL/min进样量：100µL 对照品测定谱图及校正曲线如下：图4 对照品测定谱图及校正曲线 校正曲线方程y=-0.0182x3+0.5987x2-7.1522x+34.6655，相关系数R=0.9996。甲基硅油样品测定结果数均分子量为20727，重均分子量为36273，Z均分子量为59280，Z+1均分子量为91320。总结到这里，飞飞给大家介绍了采用U3000液相结合变色龙软件采集和处理数据，分析低分子量环氧树脂和甲基硅油分子量的方法，由于两者分子量范围差异较大，实验采用了两组不同分子量的聚苯乙烯标准品作为对照品。对于环氧树脂由于需要测定的是低分子量聚合物且对照品分子量接近，所以采用了三根截留分子量不同的凝胶柱串联进行测定，结果更为准确。变色龙GPC分子量计算扩展包功能强大，导入和使用方便，为广大变色龙工作站用户扩展使用GPC功能带来便利。本文介绍的为脂溶性聚合物的分子量测定，对于水溶性聚合物的分子量分布测定，飞飞这里有较多应用文章供大家参考，感兴趣的朋友可联系我索取，这里给大家提供一篇最常用的，右旋糖酐40的分子量分布测定，扫描以下二维码既可查阅。

链霉素和双氢链霉素（DHSTR）属于氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阴性菌有明显的抗菌活性效果，可以预防和治疗多种动物疾病。由于链霉素和双氢链霉素能够有效地治疗蜜蜂的幼虫病，在养蜂行业应用普遍，但由于管理和使用的不科学，会造成蜂产品中该类物质的残留。长期食用链霉素和双氢链霉素超标的蜂产品，会对健康产生一定的危害，尤其是听觉神经。因此，国内和国际对蜂产品中链霉素、双氢链霉素的限量均有相关的规定。我国《绿色食品蜂产品》（NY/T 752-2012）中规定了蜂蜜中链霉素的最大残留限量为20μg/kg；英国食品标准署规定蜂蜜中链霉素的限量为50μg/kg；德国规定蜂蜜中链霉素的限量为20μg/kg。在山东省食品药品检验研究院组织的蜂蜜风险监测中，链霉素检出率较高。因此，建立蜂蜜中链霉素、双氢链霉素残留量的先进、高效、准确的检测方法，对保障公众的饮食健康具有重要意义。研制背景　　原有蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的检验标准有三项，这三个标准存在如下问题：（1）在流动相或提取剂中使用离子对试剂，离子对试剂的使用会污染色谱柱，且与质谱检测器不兼容，易造成离子源污染和信号抑制，甚至造成其他目标物无法检测；（2）净化方式均采用双柱串联，检测成本较高，步骤繁琐、耗时、检测效率低；（3）对花粉含量较高的蜂蜜，净化时易造成固相萃取柱的阻塞；（4）采用液相色谱法测定链霉素，需衍生化，重现性差，对同时含有链霉素和双氢链霉素的样品无法准确定量。因此，各检验机构无法利用原有方法进行蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的检测。检验方法的不完善造成2018年-2021年，蜂产品的国家风险监测方案将链霉素和双氢链霉素两项目取消。方法简介　　本方法适用于蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的测定。方法采用含三氯乙酸的磷酸盐缓冲溶液提取试样中的链霉素和双氢链霉素，经离心和过滤后，HLB固相萃取柱净化，混合型两性离子键合的SIELC Obelisc R色谱柱分离，液相色谱-串联质谱仪进行检测，外标法定量。　　本标准与原有检测标准相比，具有以下优势：（1）摒弃了离子对试剂，与质谱检测器更好地兼容；（2）突破常规的双柱串联固相萃取方式，采用单柱净化模式，提高了检测效率，节约了检验成本。技术要点　　蜂蜜含有大量的果糖和葡萄糖，为了达到去除杂质的目的，需要在前处理过程中对目标物进行净化、富集。固相萃取因简单、快速、高效等特点被广泛应用于蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的净化。HLB固相萃取柱在去除糖类、蛋白等杂质上有一定的优势，虽不能直接保留目标物，但是借助一定的提取溶剂，两种化合物均能得到很好地保留。　　链霉素和双氢链霉素属于碱性化合物，易溶于水，难溶于甲醇、乙腈等有机溶剂，因此可采用缓冲液进行提取。链霉素和双氢链霉素极性大，文献多采用提取溶液中添加离子对试剂或三氯乙酸的方法，以增加两种目标物在固相萃取柱上的保留。若前处理过程中离子对试剂去除不彻底，对色谱柱和质谱检测器将会有一定程度的污染，因此，本标准选择添加三氯乙酸的方法。研究发现，含20 g/L三氯乙酸的缓冲液pH在6~7之间时，回收率较高且比较稳定，之后再增加溶液的pH，回收率逐渐下降。　　在实际样品测定中，用2%TCA（pH 6.8）提取后，不同蜂蜜样品之间回收率差别较大，且回收率偏低。对提取后的样品处理液进行pH值测定，发现pH在3.5~6.2之间，这是引起回收率偏低的重要原因。蜂蜜样品含有多种有机酸，而提取液无缓冲能力，经提取后样品处理液的pH值会发生变化。为解决此问题，研究人员在提取液中加入10 mmol/L～50 mmol/L磷酸盐。研究结果表明，50mmol/L磷酸盐缓冲效果较好，样品处理液的pH值稳定在6.2~ 6.7。综合以上因素，50 mmol/L磷酸盐缓冲液（含20 g/L三氯乙酸，pH 6.8）作为最终的提取溶剂。　　研究人员进一步对洗脱溶剂中甲酸的浓度和洗脱体积对链霉素和双氢链霉素回收率的影响进行了考察，甲酸-乙腈-水（2: 5:93，v/v/v）溶液1.0 mL为最佳洗脱条件。操作注意事项　　蜂蜜在存放过程中很容易析出结晶，为保证分析结果的准确性和代表性，对无结晶的实验室样品，直接将其搅拌均匀；对有结晶的样品，检验前，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，分出0.5 kg作为待测试样用于检验。　　在标准溶液配制过程中还需注意，若采用非本标准中形式的标准物质，需进行分子量折算后再进行标准品称量；若经常使用，建议将标准储备液分装成小包装，每次将小包装解冻使用。此外，氨基糖苷类药物易与玻璃器皿发生吸附，实验过程中尽量使用塑料器皿；提取溶液的pH值将影响目标物在固相萃取柱上的保留效果，因此需采用pH计准确调节pH值至指定范围。　　SIELC Obelisc R色谱柱是在硅胶表面修饰了羧酸类的官能团，醇类会酯化硅胶表面键合的羧酸，影响物质的保留时间与重现性，因此色谱柱使用过程不能接触甲醇。建议严格按照色谱柱使用说明进行色谱柱的活化与维护。方法应用　　BJS 202103《蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的测定液相色谱-串联质谱法》已于2021年1月发布实施，已列入2022年全国食品安全风险监测计划中，在全国范围内得到广泛应用。本方法的发布实施可以为企业和监管部门提供技术支持，对市场监管具有重要意义。□山东省食品药品检验研究院　薛 霞

使用超高效聚合物色谱（APC）系统对低分子量聚合物进行快速高分辨率分析 Mia Summers和Michael O&rsquo Leary 沃特世公司（美国马萨诸塞州米尔福德） 应用优势 ■ 既能对聚合物进行快速表征又不会降低性能水平 ■ 与常规GPC分析相比，可提高对低分子量低聚物的分辨率 ■ 与常规GPC分析相比，可提高校准水平并由此对低分子量低聚物进行更准确的测定 ■ 可对聚合物进行快速监测，从而能提早发现产品开发过程中出现的变化 沃特世提供的解决方案 ACQUITY® 超高效聚合物色谱（APC&trade ）系统 ACQUITY APC XT色谱柱 沃特世聚合物标准品 带有GPC选项的Empower® 3色谱数据软件关键词 聚合物、SEC、GPC、APC、聚合物表征、低分子量聚合物、低聚物、环氧树脂 引言 凝胶渗透色谱（GPC）是一种广泛认可并行之有效的聚合物表征方法。然而，尽管使用此技术可获得大量信息，但这类分析本身仍存在缺陷。色谱柱通常填充苯乙烯-二乙烯基苯，同时需要进行适当老化并应在低背压下运行以确保其长期稳定。填充颗粒通常较大（&ge 5 &mu m），分辨率一般会因此而受影响。填充较小颗粒（行校正。综合使用这些技术能够更稳定、更精确地测定低分子量聚合物样品的分子量参数。提早识别某种聚合物所出现的甚至比较细微的改变都能明显加快化学和生物材料应用中聚合物的开发速度。 实验 Alliance® GPC系统条件 检测器： 2414 RI （示差折光检测器） RI流通池： 35 ℃ 流动相： THF 流速： 1mL/min 色谱柱： Styragel 4e，2和0.5，7.8 x 300 mm（3根串联） 柱温： 35 ℃ 样品稀释剂： THF 进样量： 20 &mu L ACQUITY APC系统条件 检测器： ACQUITY RI（示差折光检测器）RI流通池： 35 ℃ 流动相： THF 流速： 1 mL/min 色谱柱： ACQUITY APC XT 200 Å 柱和两根45 Å 柱，4.6 x 150 mm（3根柱串联） 柱温： 35 ℃ 样品稀释剂： THF 进样量： 20 &mu L 数据管理 Empower 3色谱数据软件 样品 1 mg/mL的沃特世聚苯乙烯标准品（100K、10K和1K）环氧树脂（2 mg/mL） 结果与讨论 为了使用SEC对聚合物进行适当表征，重要的是要使用适当的标准品生成一条校准曲线以确定当前所用色谱柱的分离范围。使用常规GPC分析标准品和样品相当耗时，运行时间可长达1小时（或更长）。由于样品所产生的数据将与经校准的标准品进行比较以确定分子量，因此标准品分析结果的准确度对获得关于聚合物样品的准确结果而言具有至关重要的作用。除了GPC本身的运行时间较长之外，常规GPC系统的额外柱体积较大也会导致峰展宽，从而降低分辨率并由此降低校准数据点的准确度。与常规GPC系统相比，ACQUITY APC系统的扩散度更低，因此产生的峰展宽就更少，并且窄分布标准品的色谱峰也明显更清晰，如图1所示。此外，低扩散性APC系统与支持更高流速和背压的稳定的亚3 &mu m APC色谱柱柱技术相结合也能提高对1K聚苯乙烯标准品的分辨率，并使分析时间缩短至原来的1/5。 图1. 比较在常规GPC系统和ACQUITY APC系统中分析聚苯乙烯标准品（Mp：100K、10K和1K）的运行时间和分辨率 使用APC系统所提高的分辨率为确定1K聚苯乙烯标准品分子量增添了更多可识别的色谱峰。如图2所示，通过使用标准品供应商提供的数值或根据外部方法得出的标准品测定值而确定的分子量信息，更多的数据点由此可被添加到校准曲线上，从而为根据这条曲线所计算出的样品结果增加了可信度。 图2. 使用ACQUITY APC系统时，因对1K低分子量标准品的分辨率提高而在校准曲线上得出关于聚苯乙烯标准品（100K、10K和1K）的更多数据点 一般说来，需要运行一系列标准品以得出用来生成校准曲线的数据点。使用常规GPC时，平衡、配制并分析每种标准品可能需要数小时至数天的时间。因此，通常不进行校准并根据原有校准曲线确定分析结果。ACQUITY APC系统因其系统滞留体积低而使平衡速度明显加快，并且因在更高流速下使用更小的颗粒而使运行时间明显缩短。运行时间的缩短使得平衡和校准操作可在一小时内轻松完成。最后，得益于分辨率的提高，可能只需要配制并进样检测更少的标准品，就能获得一条可用来进行校准的稳定曲线。分析样品时，校准操作的稳定性提高使得对低分子量低聚物的分子量测定具有更高的可信度。 图3显示出一份环氧树脂样品相对于用聚苯乙烯标准品校准的分析结果。该结果表明使用三根ACQUITY APC XT 4.6 x 150 mm串联柱可在不到5分钟的运行时间内分辨出不同低聚物。 图3. 使用配有ACQUITY RI检测器的三根ACQUITY APC XT 4.6 x 150 mm串联柱对溶于四氢呋喃的一份环氧树脂样品进行分析。低分子量低聚物（显示为峰尖分子量）可在不到5分钟的时间内被分辨开来。 APC可缩短运行时间的特点有助于在工艺开发过程中进行反应监测。分辨率提高能够促进对合成应用或降解研究中可能出现的聚合物改变进行更快速的鉴别。通过监测各种分子量而提早发现工艺改变有助于更好地了解聚合物及其预期属性，从而可促进新型聚合物的开发并加快产品上市进程。 结论 由于超高效聚合物色谱系统的扩散度更低并能承受更高的背压以允许使用更小的杂化颗粒，因此该系统明显优于常规GPC系统。通过与最新的色谱柱技术相结合，APC系统与常规GPC相比也提高了对低分子量低聚物的分辨率。APC在性能方面的优点包括校准结果更可靠，这对生成用于聚合物表征的准确测定值而言是必不可少的。低分子量聚合物检测速度和分辨率的同时提高可在开发过程中实现对聚合物的快速且可靠的表征，从而促进对新型聚合物进行密切的上市跟踪。

电荷检测质谱法是通过同时测量单个离子的质荷比和电荷数，进而算得离子质量m的单粒子统计方法，在测定超大分子离子的质量分布方面有独特的优势。现有质谱仪在超大分子量测量方面面临的挑战在质谱仪中，被分析物质首先被离子化，随后各种离子被引入真空中的质量分析器，在分析器中的电场磁场作用下，离子的运动特性随其质荷比不同而产生差异，因而造成时空上的分离，并由检测器依次检测出来，因此形成质谱。所以，目前的质谱仪测量的是离子的质荷比（m/z)，而不是质量本身。经过一个多世纪的发展，质谱仪从原先只能分析无机元素和小分子，逐步发展到能够分析有机物分子、生物大分子直至具备生命体特征的病毒颗粒。2002年诺贝尔化学奖之一授予了用电喷雾电离（ESI）进行蛋白质质谱分析的创始人John Fenn。在电喷雾质谱对蛋白质进行分析时，溶液中的蛋白质样品被传送到加有高压的毛细管尖端，强电场促使样品溶液喷雾，喷雾中的液滴通过蒸发，库仑爆炸等过程，形成带有多个电荷的蛋白质离子，被引入处于真空中的质谱分析器。每个离子所带的电荷数的多少，取决于分子的大小、分子在溶液中的几何构象（折叠或打开）以及电喷雾尖端处的电压和气流等参数。通常对蛋白质这种大分子来说，ESI质谱中都会呈现多种价态的谱峰群，群落中的每一组为某个电荷态该蛋白质的各个同位素峰、盐峰以及加合物峰等。由于电荷态z通常是连续的整数分布（例如z = 11，12....21,22...),人们可以通过计算不同电荷数对应的群落m/z的间隔来推算各组的电荷数z，进而求出实际的质量m的分布，也可以用电脑程序退卷积得到m分布。对于分析较小（分子量在5万以下）、较简单纯净的蛋白样品，退卷积还是很有效的。然而，在实际应用中对蛋白和蛋白组的分析，特别是对天然蛋白和病毒颗粒的分析却不那么简单。随着分子量上升，分子结构越来越复杂，各种翻译后修饰使被测蛋白的分子量出现差异化（heterogeneity），很宽的质量m分布（可达上千Da）使得不同价态的峰群连接在一起。图1中，用高分辨质谱仪对二种病毒壳体的质量进行测定，由于各种价态的质谱峰群连城一片，根本无法辨别谱峰，得到样品分子的质量。同时，实际样品也可能因处理不善或自然裂解，使谱图混杂着不同大小的分子离子，它们各自的价态z分布可能导致它们的峰群在m/z轴上交叠在一起。目前对于很多糖蛋白，分子量超过3、4万就出现峰群交叠，无法用退卷积软件来获得分子量的分布信息。事实说明，对于大生物分子的质谱分析，仅靠提高仪器的分辨率是无济于事的。图1 ESI质谱对大型病毒壳体质量测定的困难。(a,b）晶体结构效果图 (c,d) 的“高分辨”质谱分析图。（摘自：Kafader, J. O.， Nature methods, 17(4), 391-394）糖蛋白是生物制品中比例最大的一类药物，其糖修饰对其功能非常关键，准确解析此类药物的糖修饰是药物研发、报批和质量监控的关键内容。但它们在ESI-MS的质谱中，看到的好像是一堆杂草，无法辨别有什么蛋白组分。将一个糖蛋白药物中的各组分进行高分辨检测，是当前生物质谱面临的巨大挑战。电荷检测质谱仪的提出与技术发展早在上世纪90年代，美国西北太平洋国家实验室R.D.Smith组的 Bruce, J. E等就提出可以在傅里叶变换质谱仪中同时测量单个离子的电荷和质荷比，从而算出离子的质量m。随后，美国劳伦斯伯克利国家实验室W. H. Benner 发明了一种线形的静电离子阱，并用其测量单个高价离子的电荷数和质荷比，进而得到单个事件中的离子质量m。只要连续不断地进行大量的单个离子测量，就可以把总离子事件统计出来，形成按质量分布的直方图，而这就是一张电荷检测质谱。图2，Benner小组采用的直线形静电离子阱进行CDMS测量的原理图CDMS技术的关键是如何准确地测量单个离子的电荷。测量中，离子在静电离子阱内进行周期性运动并在电极上感应出“镜像电荷”信号。通过对信号的傅里叶变换，得到离子信号的频率从而决定离子的质荷比，而由频谱峰的强度得到离子所带的电荷数。虽然单个离子的镜像电荷频谱的峰强度与离子的电荷数成正比，它也同时与离子在阱内的轨道形状、离子存活时间有关，而这些参量都存在不定性；并且由于镜像电荷信号强度极弱，回路中的电子噪声对精确测量镜像电荷产生很大的影响，因此早期的电荷测量的RMS误差达2.2e以上,由此计算出的质量精度只比凝胶电泳好一点。近年来随着人们对天然、复杂蛋白分析的需求日益显现，CDMS技术也进一步得到了发展。美国印第安纳大学Jarrold小组通过对线形静电离子阱分析器的不断改进，特别是采用了低温前级信号放大器等优化设计后，实现了最小RMS 0.2 e的电荷测量误差，测量的样品包括2 MDa以上的蛋白复合体（protein complex）和20 MDa以上的病毒外壳。在这个RMS误差下，通过电荷数取整可以大概率获得精准的电荷值，从而得到精准的质谱分布。图3给出了用普通ToF质谱仪和CDMS测量天然态丙酮酸激酶（PKn）多聚体的效果比较。当3个以上四聚体组装在一起时，ToF质谱完全无法辨别其质量分布，而CDMS可以看到近10个四聚体组合的质量峰。图3.用常规ToF质谱（左）和用CDMS测量的丙酮酸激酶（PK）多聚体，使用相同样品和相同电喷雾条件。（摘自D. Keifer: Analyst, 2017,142,1654)目前，虽然用线形静电阱结合傅里叶变换可以得到较好的电荷测量精度，但该方法每次只能测一个离子，否则库伦相互作用会影响测量。在实际测试中，每次引入的离子数是随机分布的，需要用软件鉴别超过一个离子注入的事件，也要发现因为和残余气体碰撞而半路夭折的事件，并把这些“不良”记录剔除。考虑单次分析时间大约需要1s，得到一张良好统计的CDMS谱图需要几个小时甚至一天的数据积累。加利福尼亚大学E. Williams团队对线形静电离子阱分析器的设计和的数据处理方法进行了创新，能让宽能量范围的离子同时进入离子阱进行分析，避免了离子之间的空间电荷作用，可以在一个测量周期内测量10-20个离子，进而有望提高了检测效率。与此同时，其他尝试使用商业傅立叶FT质谱仪进行CDMS的研究团体也逐步浮现。美国西北大学Kelleher团队、荷兰乌得勒支大学的A.R.Heck团队先后使用热电公司的静电场轨道阱(Orbitrap) 系统，通过更新数据处理软件，对CDMS进行了应用研究。除了Orbitrap是成熟的商业化仪器这一优点外，轨道静电离子阱内的离子由于其轨道运动，导致电荷分布在中心电极周围，因此其空间电荷相互作用较小。Kelleher 在Nature Method上的论文声称，基于Orbitrap的CDMS可以同时分析100个离子。不过，在电荷测量精度上，Orbitrap-CDMS目前只达到RMS 1 e左右，较Jarrold的线形静电阱还有一定的差距，但Orbitrap对m/z的测量精度、分辨率远远超过ELIT，一定程度上帮助消除在多离子同时分析时可能出现的m/z相近离子的信号干涉效应。笔者在岛津公司的欧洲研发团队去年也在JASMS发表了用CDMS测量糖蛋白的尝试。该工作采用了一种盘状平面静电离子阱分析器，如图4，而这种分析器也能像Orbitrap那样获得超高分辨质谱。通过对测量硬件和软件进行改进，实现了CDMS实验。该报道给出了一种全新的CDMS数据处理方法，能够克服离子在分析过程中因碰撞夭折造成测量不准的问题，同时实验验证了该方法的有效性，还对多个离子同时分析时的信号干涉等问题提出分析和研判，为深入研究CDMS技术，消除造成电荷测量误差的障碍打下了基础。图4，用于CDMS 实验的平面静电离子阱系统 （A. Rusinov, L. Ding, JASMS, 32, 5, 2021)CDMS技术的应用现状目前，电荷检测质谱技术还处于早期发展阶段，还没有现成的商品仪器出售，只有能够自己开发质谱仪器硬件，或自己改编FTMS（含Orbitrap）软件的专家才能进行这样的实验。 今年初美国沃特世公司宣布成功收购专攻电荷检测质谱技术（CDMS）及服务的初创企业Megadalton Solutions Inc. Megadalton Solutions是由美国印第安纳大学的Martin Jarrold和David Clemmer两位教授于2018年创立，他们目前是研发的CDMS仪器最长久的团队并拥有最成熟的技术。沃特世曾于2021年将Megadalton的CDMS技术引进到了沃特世Immerse Cambridge创新和研究实验室，并应用于各项先进检测及研发工作。沃特世公司首席执行官Udit Batra博士表示要进一步开发Megadalton的CDMS技术并将其商业化。在国内，CDMS无论是仪器技术开发还是应用都属空白。虽然国内在复杂生物大分子结构与功能的研究、病毒载体空壳率监测方面对CDMS已经产生需求，但我们在高端质谱仪器研制方面远远落后于西方。CDMS在技术上是基于FTMS分析原理而演化产生的，但国内目前对FT类型的质谱仪器研究，除了少量理论分析与离子光学仿真工作外，还没有实质性的进展，也没有企业能够提供FTMS类商品仪器。针对这些需求，笔者打算在前期研究工作的基础上，研究开发静电离子阱分析器，并进一步结合开发CDMS特定的数据处理软件，建成一套拥有自主知识产权的新型质谱仪器。同时建立国内的研发应用合作机制，解决目前国内超大分子蛋白质生物药剂质量分析的问题。预测CDMS技术未来的市场空间如前所述，目前对复杂蛋白等大型生物分子进行质谱分析时，由于其分子量的差异性（heterogeneity), 存在着严重的多价态峰群重叠问题，导致无法通过质谱仪获得这些大分子在样品中的质量分布。而用电荷检测质谱仪，无需对电荷态退卷积，可以直接得到蛋白质、蛋白复合体、各种转译后修饰造成的特定质量分布图。因此，该仪器的发展在天然蛋白质、糖蛋白、病毒颗粒的成分和结构研究，抗原-抗体作用机理研究和疫苗研发方面有很大的未来市场空间，具体可以列举以下几个方面：（1）新型电荷检测质谱仪可实现复杂样品的蛋白离子精确分析，可时提供复杂样品中各蛋白分子的结构，密度分布等。（2）可直接测定糖蛋白及其它各种转译后修饰造成的特定质量分布图，为解释蛋白大分子及其转译后修饰分子量或结构表征变化信息等之间的关系，从而对糖蛋白相关的疾病诊断具有重要意义。（3）通过研究DNA等生物大分子离子的电荷分布，以及质量与电荷的关联，可以推断这些大分子的结构，比如它的聚合程度、纤维股数等。（4）在病毒研究中，可以用来确定病毒衣壳的蛋白复合体结构及其组装反应的过程，这将在抗病毒药物的研究中发挥作用。（5）在基因疗法研究和产品质控中，本项目研制的电荷检测质谱仪可以用来测定腺病毒载体的空壳率，检查载体内的基因完整度。推动现代临床医学的发展；（6）电荷检测质谱仪还可以用来测定纳米聚合物分子的聚合度和分散指数，推动材料科学的发展。值得关注的是新冠疫情给质谱分析带来了全新机遇，除了对新冠病毒本身的蛋白进行分析研究以外，也可以在灭活疫苗、病毒载体疫苗以及核酸疫苗产品的质量控制、效果评价、免疫机制研究以及载体类疫苗的体外模拟产物的评价等方面发挥优势。关于笔者：宁波大学材料科学与化学工程学院/质谱技术研究院 丁力1990年于复旦大学物理系获理学博士学位。先后工作于复旦大学材料科学系，以色列魏兹曼科学研究所，英国贝尔法斯特女王大学纯粹与应用物理系。1998年加入岛津欧洲研究所。2007年至2011年任岛津分析技术研发(上海)有限公司总经理。2011-2020年任岛津欧洲研究所高级研究员，研发二部经理。主要领导了多项质谱仪器的研发，是国际上数字离子阱质谱技术的创始人，在离子源，四极场离子阱，静电离子阱，飞行时间等分析器技术及其联用技术方面有很多创新和突破。发表论文、报告、专著一百余篇，有三十余项发明专利。领域：QIT、ToF、Quadrupole、MALDI、APMALDI、ESI、Digital Ion Trap、Linear Ion Trap、Electrostatic Ion Trap，FTMS、 CDMS、MSMS、ECD、Ambient Pressure Ion Sources 等。目前丁力在宁波大学组建团队，继续静电离子阱的设计和优化工作，已提出了静电“和谐阱”的设计概念，充分利用其高次谐波来提高质谱分析器的分辨本领。同时也在探索在国内实现这种精密分析器的加工和组装工艺，为下一步实现超高分辨质谱仪国产化做准备，也为在国内研制电荷检测质谱仪打好基础。

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Caprioli等在1997年提出，他们通过将MALDI质谱离子扫描技术与专业图像处理软件结合，直接分析生物组织切片，产生任意指定质荷比(m/z)化合物的二维离子密度图，对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析，可通过所获得的潜在的生物标志物的空间分布以及目标组织中候选药物的分布信息，来进行生物标志物的发现和化合物的监控。 /p p 　　正如数字图像包括三个通道：红、绿、蓝一样(单个亮度定义了每个像素的颜色)，质谱成像也包含了数以千计的通道，每一个对应于一个特殊的光谱峰值，“你可以通过质谱方法从这些像素中获得任何信号，然后调整图像中所需分子像素的相对亮度，最后得到一张分子特异性的成像图。” /p p 　　这种方法可用于小分子代谢物、药物化合物、脂质和蛋白，而且质谱成像能相对快速的利用许多分子通道，完全无需特殊抗体。下面列出五种先进的质谱成像方法。 /p p 　　 strong I. 挑战高分子量蛋白——MALDI质谱分子成像技术 /strong /p p 　　在对组织或生物体进行成像，分析小分子构成的时候，有一个“拦路虎”总是阻碍实验的进程，那就是多肽，这些多肽体积十分大，要想对它们进行分子成像几乎是不可能的，比如想要研究肿瘤边缘的分子微环境，如果直接成像是不可能获得清晰图像的。 /p p 　　来自范德堡大学的质谱方法专家Richard Caprioli博士因此发明了基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱分子成像技术，这项技术不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，它可在组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，而事先无需知道所检测蛋白的信息，同时可对这些蛋白质分子含量进行相对定量。 /p p 　　MALDI 质谱分子成像是在专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。被用来研究的组织首先经过冰冻切片来获得极薄的组织片，接着用基质封闭组织切片并将切片置入质谱仪的靶上。通过计算机屏幕观察样品，利用MALDI 系统的质谱成像软件，选择拟成像部分，首先定义图像的尺寸，根据尺寸大小将图像均分为若干点组成的二维点阵，来确定激光点轰击的间距。激光束通过这个光栅图案照射到靶盘上的组织切片，软件控制开始采集质谱数据，在质谱仪中，激光束对组织切片进行连续的扫描，组织样品在激光束的激发下释放出的分子被质谱仪所鉴定从而获得样品上每个点的质荷比(m/ z)信息，然后将各个点的分子量信息转化为照片上的像素点。在每个点上，所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集组织切片的质谱数据，最后得到具有空间信息的整套组织切片的质谱数据。这样就可以完成对组织样品的“分子成像”。设定m/ z 的范围，即可确定该组织区域所含生物分子的种类，并选定峰高或者峰面积来代表生物分子的相对丰度。图像中的彩色斑点代表化合物的定位，每个斑点颜色的深浅与激光在每一个点或像素上检测到的信号大小相关。 /p p 　　通过增加单位面积上轰击的激光点数量和像素，研究人员可以获得更多的样品信息，例如采用4000 像素比200 像素能够得到更好的样品图像。质谱分子成像技术是一种半定量或相对定量技术，图像上颜色深的部分表明有更多的生物分子聚集在组织的这个部分。然而，不可能据此确定生物分子在组织的不同部位的实际绝对含量。选择组织图像上的任意一个斑点，图像都能够给出一个质谱谱图或者离子谱图，代表在组织的该部位存在这种生物分子，然后与做指纹图谱类似，像做指纹图谱那样，将样品的离子谱图与已知标准品进行对照，分析差异，从而进行生物标志物的发现和药物作用的监控。 /p p 　　 strong Ⅱ. 无需样品处理 实时成像——电喷雾电离技术 /strong /p p 　　一般质谱成像方法由于体积庞大，重量重，需要冗长的样品准备阶段，因此并不适用于即时成像(bedside applications)，比如说要帮助外科医生进行实时的肿瘤边界成像监控，那么就要寻找新的方法了。 /p p 　　一种称为电喷雾电离技术(desorption electrospray ionization，DESI)的MS成像技术解决了这个问题。DESI技术于2004年首次提出，由于这一方法具有样品无需前处理就可以在常压条件下，从各种载物表面直接分析固相或凝固相样品等优势而得到了迅速的发展。 /p p 　　这种方法的原理是带电液滴蒸发，液滴变小，液滴表面相斥的静电荷密度增大。当液滴蒸发到某一程度，液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发，就可获得自由徘徊的质子化和去质子化的蛋白分子DESI与另外一种离子源：SIMS(二次离子质谱)有些相似，只是前者能在大气压下游离化，发明这项技术的普渡大学Cooks博士认为DESI方法其实就是一种抽取方法，即利用快速带电可溶微粒(比如水或者乙腈acetonitrile)进行离子化，然后冲击样品，获得分析物的方法。 /p p 　　DESI系列产品最大的优势就在于无需样品处理，一般质谱和高效液相色谱分析，样品必须经过特殊的分离流程才能够进行分析检测，使得一次样品检测常常需要约一个小时，而DESI系列产品可将固体样品直接送入质谱,溶液被喷射到检测表面,促使样品离子均匀分布。采用这一手段的质谱分离过程，只需3分钟左右即可完成。 /p p 　　 strong Ⅲ. 活体成像——APIR MALDI/LAESI技术 /strong /p p 　　了解细胞的内部成分是理解健康细胞不同于病变细胞的关键。但是直到目前为止，唯一的方法是观察单个细胞的内部，然后将其从动物或植物中移除，或者改变细胞的生存环境。但是这么做的话，会使细胞发生变化。科学家还不是很清楚一个细胞在病变时与健康细胞的差别，或者当它们从一个环境移到另一个环境中产生的变化。 /p p 　　来自华盛顿大学Akos Vertes教授希望能从另外一个方面来进行活细胞分析，在他的一项关于活叶样品中初级和次级代谢产物分布的研究中，研究人员发现叶片中积累基质很厚，常导致光谱末端低分子量部分模糊，而且基质辅助激光解析电离(MALDI)质谱分析需要在真空中进行，但活体样本在真空中无法存活。 /p p 　　实际上，MALDI质谱分析的原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。而生物样品也可以直接吸收能量的，比如2.94mm波长的光能激活水中氢氧键。 /p p 　　因此Vertes等人想到复合两种技术来解决这一问题。首先他们利用大气压红外线(an atmospheric pressure infrared，APIR)MALDI激光直接激活组织中的水分，使样品气化，就像是组织表面发生了细胞大小的核爆炸，从而获得了离子化微粒，进入质谱中进行分析。但是并不是所有的气化微粒都带电，大部分其实是不带电的，会被APIR MALDI遗漏。 /p p 　　为了捕捉这些中性粒子，Vertes等人采用了第二种方法：LAESI (laser ablation electrospray ionization，激光烧蚀电喷雾电离)，这种方法能捕捉大量带电微滴的微粒，然后重新电离化。通过对整个样品进行处理，复合这两种方法，就能覆盖更多的分子，分析质量更高。 /p p 　　与一般质谱成像过程不同，Verte的方法还在成像中增加了高度，从而实现了3D代谢物成像。这项技术的分辨率是直径10mm，高度30mm，这与生物天然的立体像素相吻合，这样科学家们就可以获得天然构像。 /p p 　　 strong Ⅳ. 3D成像——二次离子质谱技术 /strong /p p 　　质谱成像技术能将基质辅助激光解吸电离质谱的离子扫描与图像重建技术结合，直接分析生物组织切片，产生任意质荷比(m/z)化合物的二维或三维分布图。其中三维成像图是由获得的质谱数据，通过质谱数据分析处理软件自动标峰，并生成该切片的全部峰值列表文件，然后成像软件读取峰值列表文件，给出每个质荷比在全部质谱图中的命中次数，再根据峰值列表文件对应的点阵坐标绘出该峰的分布图。 /p p 　　但是一般的质谱成像技术不能对一些携带大分子碎片的化学成分进行成像，来自宾夕法尼亚州州立大学的Nicholas Winograd教授改进了一种称为二次离子质谱(SIMS，secondary ion mass spectrometry)的方法，可以对样品进行完整扫描，三维成像。 /p p 　　SIMS早在用于生物学研究之前就已经应用广泛了，比如分析集成电路(integrated circuits)中的化学成分，这种质谱技术是表面分析的有利工具，能检测出微小区域内的微量成分，具有能进行杂质深度剖析和各种元素在微区范围内同位素丰度比的测量能力。 /p p 　　这种技术具有几个优点：速度快(-10,000 spectra per second)，亚细胞构造分辨率(-100 nm)，以及不需要基质。但是另外一方面，不同于MALDI方法，SIMS方面不是一种“软”技术，这种方法只能对小分子成像，因此常常需要进行粉碎。 /p p 　　Winograd教授改进了这一方法，他利用了一种新型SIMS光束(carbon-60 磁性球)，这种新光束比传统的SIMS光束对物体的化学损伤更小。C60同时撞击样品表面，类似于“一阵爆炸”，这样重复的轰击使得研究人员能深入样品，进行三维分子成像，Winograd教授称这个过程是“分子深度成像”(molecular depth profiling)。 /p p 　　C60的能量与其它的离子束相当，却不到达样品表面以下，这样样品可以连续地被逐层剥离，研究人员就可以得到纵面图形，最终获得三维的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液将硅的薄片包裹起来并进行SIMS实验，随着薄膜逐渐被C60剥蚀，可以获得糖和肽的稳态信号。最终，薄膜完全剥离后就可以获得硅的信号。如果用其它的射线或原子离子代替C60 ，粒子束会快速穿过肽膜而无法提供有关生物分子的信息。因此这种方法具有良好的空间分辨率，能够获得巨噬细胞和星型细胞的细胞特征和分析物的分布情况。 /p p 　　这里还要说到一点，SIMS和上一技术(APIR MALDI/LAESI技术)都可以对三维成像，但两者也有差别，SIMS方法中，采用高能离子轰击样品，逐出分析物离子(二级离子)，离子再进入质量分析器。MALDI方法则用激光辐射样品使之离子化，另外SIMS探针可以探测到100nm的深度，能提供纳米级的分辨率，而MALDI可以探测更深，但空间分辨率较低。 /p p 　 strong 　Ⅴ. 高灵敏度 高分辨率——纳米结构启动质谱技术 /strong /p p 　　质谱在检测生物分子方面有很大潜力，但现有方法仍存在一些缺陷，灵敏度不够高和需要基质分子促使分析对象发生离子化就是其中之二。比如说，需要溶解或者固定在基质上的方法检测代谢物，较易错判，因为这些代谢物与那些基质常常看上去都一样。另外基于固定物基质的系统也不允许研究人员精确的判断出样品中某一分子到底来自于哪儿。 /p p 　　来自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士发明了一种称为纳米结构启动质谱(nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS)的新技术，这种技术能以极高的灵敏度分析非常小的区域，从而允许对肽阵列、血液、尿和单个细胞进行分析，而且还能用于组织成像。 /p p 　　NIMS利用了一种特制的表面，这种多孔硅表面上聚集了一种含氟聚合物，这些分子在受到激光或离子束照射时会猛烈爆发，这种爆发释放出离子化的分析物分子，它们被吸收到表面上，使其能够被检测到。这种方法利用激光或离子束来从纳米尺度的小囊中气化材料，从而克服了一般质谱方法缺少所需的灵敏度和需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷。 /p p 　　通过这种方法可以分析很多类型的小分子，比如脂质，糖类，以及类固醇，虽然每一种分析材料需要的含氟聚合物有少许差别，但是这是一种一步法的方法，比MALDI简单多了——后者需要固定组织，并添加基质。 /p p 　　由于含氟聚合物不能很好的离子化，因此会发生轻微的光谱干扰，而且由于离子化过程是“软性”的——就像MALDI，所以NIMS产生的生物分子是整块离子化，而不是片段离子化。不过这种技术对于完整蛋白的检测灵敏度没有MALDI高。 /p p & nbsp /p p & nbsp /p

仪器信息网讯 伴随我国各行业对分析检测技术需求的大幅提升，分析仪器得到了广泛关注和高速发展。质谱作为“热度”较高的分析仪器，其通过测量带电粒子的质量进而对物质进行定性和定量分析，至今已有超过100年历史。如今，质谱分析技术广泛应用在环境检测、地球科学、材料科学、食品安全、临床检验、药物与毒物、生物医学研究等领域，应用层面可以说是包罗万象。而随着分析物质的日益复杂，质谱仪器的需求也日益增长，庞大的市场吸引越来越多的厂商加入到质谱供应商行列，质谱市场的竞争更加“如火如荼”。2021年中国市场上各主流厂商的质谱产品推陈出新，从新品类型来看，主要集中于Orbitrap、飞行时间、三重四极杆等液质联用质谱。此外，国产制造商也带来了很多“惊喜”。金秋九月，两年一度的行业盛会，第十九届北京分析测试学术报告会暨展览会(简称BCEIA2021)于2021年9月27日在北京中国国际展览中心（天竺新馆）隆重开幕。为向广大用户带来最新最前沿的质谱新产品速报，仪器信息网特别策划了MS GO：2021质谱新品大探秘视频报道活动，让广大网友跟随我们的镜头，近距离地了解2021年各大仪器厂商展出的质谱新产品与新技术。更多新品采访视频，请关注后续报道。跟随仪器信息网的镜头，可以看到2021年多家公司质谱产品扎堆发布，可以说是你方唱罢我登场，好不热闹。谱育科技EXPEC 7910 ICP-TOF质谱 谱育科技EXPEC TRACE 8000化学电离飞行时间质谱谱育科技在高端质谱仪器研发和产业化创新方面做出了一系列的突破，2021年谱育带来了他们的首款电感耦合等离子体-飞行时间质谱仪（ICP-TOF-MS），将ICP电离特性与飞行时间质谱仪高分辨率、高灵敏、快速扫描等优点相结合，可实现75种元素及质量数范围1~260amu绝大多数同位素的分析。不仅如此，谱育还带来了一款化学电离飞行时间质谱仪，适用于VOCs走航和在线监测。北京莱伯泰科LabMS 3000上市新秀莱伯泰科带来了他们的第一款质谱产品，技术来源于胡克博士深耕多年的ICP-MS领域，仪器在整机设计、进样系统材料、锥接口、锥材料以及碰撞反应池、冷热焰模式等方面都做了改进，其稳定的冷热焰切换技术可满足半导体行业的测试需求，该系统的应用领域瞄准半导体和医疗行业。清谱科技Cell 系统清谱科技致力于小质谱技术的研发和产业化发展，继miniβ之后，清谱这次带来了更“小”的质谱产品，产品全部重量8.5kg，内含锂电池，可以测量分子量在50-1000之间的化学物质。禾信康源 NucMass 2000核酸质谱系统禾信仪器作为“国产质谱第一股”，公司在周振博士的带领下攻克了高分辨飞行时间等质谱技术，并在大气环境监测的细分领域具有品牌优势。此次展会禾信重点带来了第一款核酸质谱仪器，为其大举进攻医疗领域打下基础。安益谱1978 三重四极杆气质联用系统安益谱深耕质谱技术自主研发多年，2021年其推出了首款气相色谱串联三重四极杆串联质谱仪，系统搭载了轴向线性加速电压高效碰撞池；双涡轮分子泵真空结构，最大载气流速可达10ml/min，支持0.53mm大内径色谱柱；新产品拥有的非共轴双预四极离子导引有效降低中性粒子噪声等特点。衡昇仪器iQuad系列第三代电感耦合等离子体质谱衡昇仪器带来了iQuad系列第三代电感耦合等离子体质谱，在其2019年推出的ICP-MS产品的基础上，新产品进行了升级迭代，搭载了全数字频率调谐四极杆驱动技术以及六极杆碰撞反应池技术。博赛德走航监测系统博赛德作为全球众多知名前处理分析仪器生产厂商在华的独家代理专注于VOC监测解决方案，近年来其与INFICON公司联合研发走航监测系统，搭载了四极杆质谱技术，可以对烷烃、卤代烃、芳香烃、含氧烃等多种VOCs组分实时分析。盘福生物 QUADVENTURE 5 GCMS系统盘福生物在其便携气质产品的基础上，2021年推出了首台的台式气质产品，目标在食品安全及环保领域进行拓展。福立分析 S900 GCMS系统福立的产品主要为色谱质谱仪、实验室前处理设备和色谱分离材料等，并在其自主研发的气相色谱的技术基础上，研发制造了GCMS系统，前端搭载了基于ADVIS专利技术的离子源技术，搭配GC9720plus系统，基于“通道”模式的分析工作流，结合高位全自动液体进样系统，可实现同步并行分析检测。质谱的市场无疑是巨大的，而且需求将持续增加。据仪器信息网报道，2020年，全球质谱市场规模约41亿美元，预计到2025年，该市场规模将达到56亿美元，预测期内复合年均增长率为6.5%。制药和生物技术应用领域在近两年占据了最大的市场份额，这一趋势预计将在预测期内持续下去。作为精准诊疗的高新技术平台，质谱技术在临床中的应用越来越受到关注，其中一些质谱仪器已经获得NMPA认证并取得相关医疗器械证件。截至2021年5月，进口质谱共计10款，包括MALDI-TOF 3款、LC-MS 7款；国产质谱共计23款，MALDI-TOF 13款，LC-MS 8款，ICP-MS 2款。近五年报批数量递增幅度放缓，相关企业主要聚焦在方法开发、试剂开发和应用推广方面。自20世纪60年代以来，色谱质谱联用技术将色谱优越的分离性能与质谱提供结构信息的能力完美结合，满足了对复杂样品定性定量的需求，也使该联用技术广泛应用于食品安全、生态环境、药物以及生物医学等领域。而如今，质谱技术逐渐开始展现其直接分离离子的能力，离子源技术得到快速发展 同时借助离子淌度(IMS)及串联质谱分析器等技术手段，质谱进入了实时原位、超高通量分析的新时代。总体看来，质谱技术一方面将随着生物医学及生命科学等领域应用研究的深入得到进一步完善。另一方面，质谱仪器也将从高灵敏度、高准确性、自动化、专用化等方面进行技术提升。质谱仪器市场一直以来竞争激烈，很多品类仪器长期以来被国外品牌垄断，尤其是以串联质谱仪等为代表的高端质谱仪器，其市场一直被进口厂商占据，进而国内用户形成了“进口必然优于国产”的认知，使得国产厂商想在市场中谋取一席之地时面临着重重困难。对此，部分国产质谱企业在突破了研发技术的瓶颈后，进而探索差异化布局，侧重开发特定应用领域和场景的专用化质谱产品，以满足通用仪器无法覆盖的市场需求。此外，随着现场检测对分析仪器的大量需求，便携式和小型化质谱已经成为发展趋势。我国学者在质谱仪器小型化方面已有不少成果，该进展极大地推动了相关研究领域的发展，同时也能带来明显的经济效益。

药物分析方法开发共性难点岛津技术团队在与行业用户专家和用户交流中，收集以下共性难点反馈：1、基质化合物组成极性范围宽，色谱峰容量不够。2、中药基质复杂，在对特征峰鉴定时可能受到目标物附近其他峰干扰，影响鉴定准确度。3、聚合物杂质检测通常采用排阻色谱法，对聚合物杂质进行笼统的总量控制，定量不准确，且无法鉴定聚合物杂质的结构。4、采用HPLC-UV法进行杂质测定，但该方法无法将HPLC中使用的不挥发性流动相直接应用到LC/MS分析中，或者流动相与质谱不匹配。针对以上行业分析难点，岛津多年来持续致力于多维色谱质谱联用解决方案开发，将多类型色谱分离优势和质谱分析优势进行结合。岛津多维液相色谱质谱解决方案全二维液质联用系统&中心切割1二维液质联用系统Nexera-e 全二维液相色谱仪《中国药典》0512高效液相色谱法通则：二维液相色谱可以分为差异显著的两种主要类型：中心切割式二维色谱和全二维色谱。中心切割式二维色谱是通过接口将前一级色谱中某一（些）组分传递到后一级色谱中继续分离，面对复杂基质环境时，将一维目标峰切到二维进行更好的分析。全二维色谱是通过接口将前一级色谱中的全部组分连续地传递到后一级色谱中进行分离，如此两个独立的分离模式正交组合可实现尽可能高的峰容量。二维色谱可以是相同的分离模式和类型，也可以是不同的分离模式和类型，二维色谱可以和质谱联用。详情参考：https://www.shimadzu.com/an/products/liquid-chromatography/hplc-system/nexera-e/index.html2全谱二维液质联用系统极性覆盖范围宽:可一针实现宽极性多目标物的同时分析，可以胜任绝大多数分析项目中宽极性、多组分分析的要求。该系统和岛津最新推出的LCMS-9050高分辨质谱正负极离子同时采集功能结合，能得到4in1技术优势--相比岛津前一代方案，可以节省3/4的样品、分析时间，并减少3/4的质谱污染。3 SEC-RPLC-QTOF二维液相色谱-高分辨质谱为了解决前述聚合物杂质鉴定难题，岛津与北京新领先医药科技发展有限公司合作搭建了SEC-RPLC-QTOF二维液相色谱-高分辨质谱检测平台。基于该平台二维杂质动态上样、在线脱盐等技术，以及岛津高分辨质谱仪的高质量准确度和高质量稳定性等性能特点，目前双方的研发人员共同参与完成了十四种β-内酰胺类抗生素的聚合物杂质的全面解析，并建立质谱数据库。详情参考：https://mp.weixin.qq.com/s/etytDIXLjrICzsNfHOKgAw。4 Trap-Free 二维液质联用系统Trap-Free 2DLC系统是一套支持在线流动相转换的二维液相与色谱-质谱联用仪的组合系统，系统结构示意图见图 1。本系统的第一维液相色谱系统，可使用非挥发性流动相或者与质谱分析不匹配的流动相体系，通过系统中切换阀、程序命令的组合,对第一维液相色谱系统分离的组分进行分馏。本系统的第二维液相色谱系统,可以采用适合 LCMS 分析的液相色谱条件，针对分馏的组分，进行针对性的质量分析。详情参考：https://support.shimadzu.com.cn/pdfweb/web/viewer.html?file=https://support.shimadzu.com.cn/an/downa/AP_News_LCMS-QTOF-053.pdf全谱二维液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用分析不同产地当归的活性成分a) 正模式火山图结果 b)负模式火山图结果根据多元统计分析OPLS-DA 结果的 VP 值，可以初步筛选出甘肃产当归和云南产当归的差异活性物质，进一步筛选则通过结合单变量统计火山图结果(P-value 与Fold change) 进行。最终正模式下筛选得到 1351 个差异物质，负模式下筛选得到1716 个差异物质。通过 MSDIAL软件，对化合物进行鉴定，共鉴定出 43种差异性化合物,包括藁苯内酯类有机酸类等天然活性物质，下表为部分差异性化合物鉴定结果表。详情参考：https://support.shimadzu.com.cn/pdfweb/web/viewer.html?file=https://support.shimadzu.com.cn/an/downa/AP_News_LCMS-QTOF-073.pdf岛津携手阳光诺和揭示头孢西丁钠新颖聚合方式图1 头孢西丁钠破坏样品检测色谱图本方案一维采用HPSEC系统，磷酸盐流动相定位头孢西丁钠中的聚合物杂质，然后采用阀切换技术，使用500 μL定量环将聚合物峰全部转移至二维反相色谱，脱盐、分离并质谱鉴定。其中聚合物C1分子量较2分子头孢西丁少2个H（Mr. 852.09），根据其同位素比例和特征碎片离子信息，推断其为一分子头孢西丁7-位侧链与另一分子头孢西丁7-位噻吩环联结形成的，该新颖聚合方式尚未见文献报道。本研究建立了注射用头孢西丁钠聚合物检测的反相色谱方法，并探索其用于日常检验的可能性。C1一级质谱图（A）和母离子m/z 870的二级质谱图(B)（ESI+）详情参考：《Characterization of polymerized impurities in cefoxitin sodium for injection by two-dimensional chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry》.https://doi.org/10.1016/j.talanta.2023.125378二维液相色谱联用四极杆飞行时间质谱仪对赤芍配方颗粒特征图谱2号峰鉴定配方颗粒特征图谱（1D） 配方颗粒特征图谱（2D）一维液相特征图谱中的2号特征峰切入至 50 μL定量环进行收集，再由二维流动相进行洗脱，该组分在二维液相上的保留时间为 35.267 min。采用岛津 2DLC+LCMS-QTOF对赤芍配方颗粒特征图谱中2号特征峰进行了高分辨质谱定性研究。经 MS1、MS2质谱图信息、相关文献信息以及标准品确认，最终鉴定2号特征峰为原花青素 B1。本研究为中药配方颗粒特征成分研究提供了思路，为赤芍中药配方颗粒特征图谱标准制定提供参考依据。Trap-Free 2D LC Q-TOF 定性分析宫缩抑制剂阿托西班中的多聚体杂质阿托西班二聚体的[M+3H]3+峰分子式预测结果 阿托西班二聚体解卷积分析结果阿托西班三聚体的[M+2H]2+峰分子式预测结果 阿托西班三聚体解卷积分析结果针对多肽药物中的由两个或多个多肽组成的稳定的多聚体杂质，可利用体积排阻色谱法(SEC)分离相关杂质。本案例采用岛津Trap-free 2DLC+LCMS-9030，既能避免SEC的色谱条件与质谱离子源不匹配，也能有效解决液相色谱分析浓度过高而导致的质谱信号饱的问题。结果显示阿托西班二聚体和三聚体的 MS1的离子质荷比同理论值均小于1mDa。使用 Insight Explore 软件中解卷积功能预测目标物的分子量，预测分子量和理论分子量的误差小于3ppm。详情参考：https://support.shimadzu.com.cn/pdfweb/web/viewer.html?file=https://support.shimadzu.com.cn/an/downa/AP_News_LCMS-QTOF-053.pdf注：本文中所用数据均为岛津实验室特定条件下的测试数据，结果可能随实际情况变动文中涉及最佳、最低类描述，限于实验组别对比结果。本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

导读随着生物医药技术的发展，越来越多的生物药陆续上市，如治疗慢性疾病的寡核苷酸药物Leqvio，“一年只需注射两针”就可以长效持久的降低血液中胆固醇含量，以及用于治疗II型糖尿病的多肽类药物Mounjaro。在寡核苷酸和多肽药物的质量控制中，分子量测定是定性表征中不可缺少的一部分，而单四极杆液质联用仪（LCMS）是测定分子量的利器。但与小分子药物相比，多肽和寡核苷酸药物极性和分子量均较大，在LCMS中带多电荷，所以分子量测定时可能会存在分子量测定范围窄、灵敏度低等问题。小身材大智慧 LCMS-2050岛津最新款单四极杆质谱仪LCMS-2050兼顾小型化和高性能，其离子源为加热型ESI/APCI（DUIS）源，使得寡核苷酸和多肽药物等分子量较大的极性化合物更容易电离，所以LCMS-2050具有分析灵敏度高，分子量测定范围广的特点。此外，岛津LabSolutions软件自带分子量解卷积功能，可以快速对多电荷质谱图进行解卷积，获得分子量相关信息。分子量测定案例分享寡核苷酸药物本方案中寡核苷酸药物为小干扰核苷酸（siRNA），是一类双链RNA分子（正义链和反义链），长度为20-25个碱基对。通过流动相的调整和质谱参数的优化，LCMS-2050（负模式）检测得到了siRNA多电荷质谱图，质荷比为600~1700。此时质谱图中无其他加和离子干扰，且高质荷比也有明显响应。通过岛津LabSolutions软件自带的多电荷解卷积功能，计算得到siRNA正义链电荷数量为4~11，分子量为6631.64 Da，反义链电荷数量为4~10，分子量为6637.66 Da，与理论值的偏差均小于0.4 Da。siRNA色谱图正义链质谱图正义链分子量解卷积结果反义链质谱图反义链分子量解卷积结果多肽药物此多肽药物为一种生长抑素，其理论分子量为1637. 72 Da。LCMS-2050（正模式）检测得到质荷比为546.76~1638.47，通过LabSolutions解卷积功能计算得到分子量为1637.45 Da，与理论值偏差为0.27 Da。多肽药物色谱图多肽药物质谱图多肽药物分子量解卷积结果结语岛津最新款单四极杆质谱仪LCMS-2050兼顾小型化与高性能，适用于多肽、寡核苷酸等化合物分子量测定，具有灵敏度高、分子量测定范围广的优势。了解更多详情，敬请下载《LCMS测定小干扰核苷酸siRNA分子量》《LCMS-2050在多肽分子量定性分析检测中的应用》本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

高级多检测器GPC测量低分子量样品凝胶渗透色谱(GPC)是测量天然和合成聚合物分子量和分子量分布的常见工具。先进的光散射检测器，越来越多地被用来克服传统GPC测量的局限性，准确提供绝对分子量以及分子尺寸。由于样品的光散射(Rθ)灵敏度会受到聚合物的分子量Mw、浓度(C)和折光指数增量(dn/dc)的影响，所以对于低分子量聚合物而言，准确测定分子量对大多数GPC/SEC系统来说是一个挑战。例如，PLGA等药物递送聚合物的dn/dc通常很低，而环氧树脂、多元醇等分子量可能极低。马尔文帕纳科最新GPC系统OMNISEC可用于克服测量低分子量聚合物测定的困难，这要归功于光散射和示差检测器灵敏度的提高。借助OMNISEC光散射灵敏度，您可以：以更高的准确度测量较低分子量的样品。可以较低样品浓度测量珍贵样品。以更高的准确度和灵敏度测量具有低dn/dc的样品。对环氧树脂、多元醇和PLGA样品的分析清楚地表明，先进的检测技术现在可以轻松地应用于低分子量等聚合物的表征。 环氧树脂双酚A用于生产双酚A二缩水甘油醚等环氧树脂，是一种低分子量样品，我们可以用OMNISEC在正常浓度下成功测量。在图1中，对浓度为3 mg/ml的双酚A(分子量为228 g/mol)进行分析，显示出示差RI检测器和光散射检测器LS都具有良好信噪比的信号响应。(图1)图1：双酚A(分子量228 g/mol)在THF中运行的多检测器色谱图(RI和RALS检测器)。样品浓度为3 mg/ml。用OMNISEC系统分析分子量为340g/mol的双酚A二缩水甘油醚，得到的色谱图（图2）显示了清晰的峰和良好的信号响应，尽管聚合物的分子量很低。图2：双酚A二缩水甘油醚(分子量340g/mol)在四氢呋喃中的多检测器色谱图(RI、RALS和粘度计检测器)。样品浓度为5 mg/ml。多元醇多元醇是具有多个羟基官能团的材料，通常用作合成其他聚合物(如聚氨酯)的反应物，或在食品工业中使用多元醇作为糖的替代品。了解这些材料的分子量分布对于监测它们在不同应用环境中使用是至关重要的。本文采用聚乙二醇(PEO)和聚丙二醇(PPG)为例进行分析。图3显示了极低分子量PEO的OMNISEC色谱图和结果。在RALS探测器中观察到良好的信噪比，使得对聚合物的全面表征成为可能。图3：多检测器SEC色谱图(RI、RALS和粘度计检测器)。分子量为196g/mo的聚乙二醇。样品浓度为3.9 mg/ml。在图4和表1中，您可以看到PPG的分析，它在THF具有非常低的dn/dc(0.045ml/g)。所有的检测器都有很好的响应，并且多次注射之间有很好的重复性。图4：聚丙二醇在THF中的多检测器色谱图(RI、RALS和粘度计检测器)。样品浓度为6 mg/ml。表1：三个聚丙二醇样品重复注射的分子量数据。样品浓度为6 mg/ml。聚乳酸-羟基乙酸 PLGA聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)是一种生物相容性和生物可降解性聚合物，最常用于药物输送和组织工程应用。在药物输送应用中，PLGA用于配制药物和蛋白质在体内的受控输送装置。这些PLGA设备的工作方式是，当PLGA在体内降解时，它会释放与之相关的药物分子。PLGA给药装置的物理性能可以通过控制药物浓度、PLGA分子量以及组成PLGA的聚乳酸和乙醇酸的比例来调节。然而，由于PLGA在THF中的dn/dc非常低，约为0.05ml/g，因此SEC对PLGA的表征历来是非常困难的。如图5所示，使用OMNISEC系统在THF中按SEC分析PLGA 50:50后，每个检测器均可获得良好的信号响应和完整的样品表征。图5：PLGA 50：50多检测器SEC色谱图(RI、RALS、LALS和粘度检测器)。样品浓度为3.028 mg/ml。结论：与传统GPC相比，OMNISEC系统具有高灵敏度，因此可以在正常浓度下测量低dn\dc和低分子量样品，如环氧树脂、多元醇和PLGA，并具有极好的重复性。

沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）近日推出全新软件和分析柱产品，旨在助力生物分子药物发现和开发。使用waters_connect平台新增的Waters Intact Mass应用程序，科学家们能够在BioAccord LC-MS系统上快速确认合成或重组工艺生成的生物分子和杂质分子量，其分析速度可达市场上其他产品的近两倍 i。图. Waters BioAccord LC-MS系统的完整分子量分析在几分钟内为生物工艺工程师提供有关药物和工艺质量的关键信息沃特世公司高级副总裁Jon Pratt表示：“采集生物分子的质量数和纯度数据相当耗时。复杂的质谱数据需要由具备一定技能水平的人员来分析，因此这项工作通常会交给远程专业分析实验室。借助这款新的Waters Intact Mass应用程序，生物工程师和生物化学家使用简单的技术就可以加快药物发现和开发，在几分钟或几小时内即可自行生成质量数确认数据，不再需要花费长达数天乃至数周的时间。”完整分子量分析是在蛋白质、肽、寡聚核苷酸治疗药物和偶联药物等生物药物开发的各个阶段都会开展的一项常规分析。在药物发现的早期阶段，生物化学家每周需要分析数百甚至数千个不同的样品。为了加快分析速度，Waters Intact Mass应用程序提供了一套快速可靠的自动化解决方案，旨在助力新型生物治疗药物的质量数确认和纯度测定。这款应用程序特有的智能自动解卷积功能让用户在减少指令输入的情况下，在采集样品数据后几分钟内即可完成处理。沃特世推出MaxPeak Premier BEH C4 300Å蛋白分析专用柱，助力完整蛋白和亚基分析与Intact Mass应用程序一同推出的还有全新分析柱系列，将在完整生物分子及其亚基分析中发挥关键作用。用于BioAccord LC-MS系统的ACQUITY Premier和XBridge Premier BEH C4 300Å蛋白分析专用柱采用MaxPeak高性能表面（HPS）技术，能阻止样品中的磷酸化和羧基化分子被LC系统和色谱柱的金属表面吸附，进而避免样品分析物损失。得益于此，低浓度完整分子量分析的灵敏度可提高达3倍，磷酸化蛋白完整分子分析和低浓度单克隆抗体亚基分析的灵敏度则可提高达2倍ii 。目前，新购BioAccord LC-MS系统的waters_connect平台已预置Intact Mass应用程序，已安装的系统可通过版本升级获取此应用程序。沃特世现已面向全球供应MaxPeak Premier BEH C4 300Å蛋白分析专用柱。其他参考资料- 阅读博客文章：Automating Intact Mass Deconvolution: It' s About Time（《完整分子量的自动化解卷积：时机已到》）- 阅读沃特世应用纪要：Intact Mass - A Versatile waters_connect Application for Rapid Mass Confirmation and Purity Assessment of Biotherapeutics（《Intact Mass - 用于生物治疗药物快速质量数确认和纯度评估的多功能waters_connect应用程序》）- 欢迎您通过www.waters.com关注和联系沃特世。关于沃特世公司（www.waters.com）沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）是全球知名的专业测量仪器公司，作为色谱、质谱和热分析创新技术的先驱，沃特世服务生命科学、材料科学和食品科学等领域已有逾60年历史。公司在全球35个国家和地区直接运营，下设14个生产基地，拥有约7,400名员工，旗下产品销往100多个国家和地区。关于沃特世中国自上世纪80年代进入中国以来，沃特世的规模与实力与日俱增，在大陆及香港、台湾均设有运营中心，拥有近700名本地员工，并在上海、北京、广州、成都设立实验中心和培训中心。自2003年成立沃特世科技（上海）有限公司以来，今天的中国已成为沃特世全球营收仅次于美国的第二大市场。作为分析科学家的理想合作伙伴，沃特世始终坚持提高本地技术能力、支持本地技术人才培育，并推动制药、食品安全、健康科学、环境保护等相关行业标准和法规的建立和完善。凭借出众的人才与全球布局，沃特世已经为其商业合作伙伴创造了显著的价值，并致力于满足广大中国消费者对更美好生活的需求。 i“两倍”估计值基于96个样品的分析，比较了Waters BioAccord系统配合Intact Mass运行“并行采集和处理”工作流程与市场上其他产品运行“先采集后处理”工作流程的速度。 ii基于MaxPeak Premier BEH C4 300Å蛋白分析专用柱与ACQUITY 300Å蛋白分析专用不锈钢柱的比较结果。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry的文章，In-Depth Characterization of mAb Charge Variants by On-Line Multidimensional Liquid Chromatography-Mass Spectrometry[1]。本文的通讯作者是中国复宏汉霖生物制品有限公司的刘卓宇博士。　　重组单克隆抗体(mAbs)正成为肿瘤和自身免疫性疾病最成功的治疗方法之一。与传统的小分子药物不同，抗体在电荷、大小和糖型上都非常不均匀。单克隆抗体的电荷异质性通常是由细胞培养、纯化和储存过程中发生的翻译后修饰(PTM)引起的。电荷变异由于其对单克隆抗体的安全性和有效性的潜在影响而引起了人们的注意。CEX通常用于组分收集，以收集纯化的变体进行结构征，然而，在CEX分离中使用的非挥发性离子试剂与MS检测器直接耦合时，往往会造成电离抑制和污染。为了避免这些问题，CEX馏分应在进一步LC-MS分析之前进行脱盐和浓缩。传统的峰收集、纯化和随后的组分表征方法是劳动密集型和耗时的，组分在这么长的时间里不稳定。此外，传统CEX-MS在分析分子量变化较小PTMs时难以进行表征。 在最近的研究中，基于CEX和MS的多维液相质谱技术，已经在研究电荷变异体上展现了诸多优点。通过CEX的组分收集和MS的分析，多维液相质谱实现了对电荷变异体的实时表征，在缩短了检测时间的同时，也减少了由于传统手工方法诱导的人工PTMs，并且能够得到之前无法检测到的不稳定的中间体。该技术具有较好的重现性和灵敏度，对PTM的序列可实现高覆盖率的表征。在所开发的方法中，在1D CEX上分离的11种电荷变体在自动进样器中被收集到96孔板中。随后，通过多次进样，将单个馏分装入二维柱上进行预浓缩，以收集适当的量。这种新方法能够自动收集低丰度的多种电荷变体，然后通过不同的在线过程进行彻底的表征，包括分子量分析、肽图谱和Fc-γ-RIIIa受体亲和力评估。　　图1. mAb-A1和mAb-A2的CEX谱。通过优化的纯化工艺去除mAb-A1中的B5-B8峰，以消除信号肽相关变异，命名为纯化抗体mAb-A2。　　如图1所示，mAb-A的CEX图谱显示出较高的电荷异质性，PTM引起的mAb-A1电荷异质性可能对产品的安全性和有效性构成潜在风险。虽然不需要的电荷变体可以通过下游净化过程消除，但变体的去除会显著降低产量，从而增加成本。因此，需要对mAb-A1电荷变体进行深入研究，以确定其对产品质量的影响，并为工艺优化提供信息。研究中，先通过2DLC(CEX × RP-C4)-MS分析鉴定了11个mAb-A1电荷变体，包括2个AP (A1和A2)， 1个MP和8个BP (B1-B8)。一方面，2DLC(CEX × RP-C4)-MS方法具有时间效率，每个峰只需40分钟。另一方面，2DLC(CEX × RP-C4)-MS法省力。省去了传统脱机分析所需的超滤、预富集、脱机还原等人工操作。　　变体在亚单位水平上通过高分辨率质谱初步鉴定。如图2所示，重链的TIC图谱在所有电荷变体中是一致的 通过对HC1和HC2峰的质谱分析，确定了HC上的PTMs，这些PTM是常见的，已报道对抗体的安全性和有效性影响不大。去卷积质谱显示，B5、B6、B7和B8的LC1峰被RVHS-LC2 (Arg-Val-His-Ser-LC2, MWLC2 + 479.5 Da)和TRVHS-LC2 (Thr-Arg-Val-His-SerLC2, MWLC2 + 580.6 Da)的信号肽相关变体所覆盖。由于这些物种在精氨酸残基位点易被色氨酸切割，因此可能在肽图谱中被错误地识别为含有VHS的变异。通过2DLC(CEX × RP-C4)-MS分析，可以很容易地在亚基水平上获得mAb-A1未截断的RVHS和TRVHS变体。　　图2. 2DLC(CEX × RP-C4)-MS分析mAb-A1及其电荷变体的降低分子量。(A)总离子色谱图。(B) LC1的去卷积质谱。在mAb-A1的B5-B8变体中，LC1与未截断的RVHS和TRVHS分离。　　通过4DLC(CEX × RP-C4 × Trypsin×RP-C18)-MS分析鉴定出7个mAb-A2的电荷变体，包括3个ap、1个MP和3个bp。在变体中获得的PTMs包括脱酰胺(图4B)、Pyro Q(图4C)、c端Lys截断/Pro酰胺化(图4D)和Met氧化(图4E)。所有ap均发现HC N55脱酰胺。据报道，HC N55的脱酰胺会影响抗原-抗体结合活性据报道，Fc氧化会影响FcRn结合，对药代动力学(PK)产生负面影响。4DLC(CEX × RP-C4 × Trypsin×RP-C18)-MS的数据采集在1天内完成，以小于0.5 mg的样品表征了mAb-A2的7个变体。mAb-A2的肽图谱序列覆盖率达到90%。　　图3. 4DLC(CEX × RP-C4 × Trypsin×RP-C18)-MS在线肽图谱。(A)经鉴别的重叠色谱图mAb-A2主峰的肽段。(B)所有mAb-A2变异的HC N55脱酰胺。(C) N端谷氨酰胺环化成在所有mAb- A2变异体中HC Q1的焦谷氨酸。(D)在所有mAb-A2变体中，C端HC K450的赖氨酸截断和HC P448的脯氨酸酰胺化。(E) HC M255下蛋氨酸氧化。　　由于Fc-γ-RⅢa的结合亲和力一般与ADCC效价具有良好的相关性，且Fc-γ-RⅢa的结合能力可以反映在Fc-γ-RvⅢa柱上，通过2DLC(CEX × Fc-γ-RⅢa)分析间接监测了mAb-a的电荷变体的生物活性。APs中峰3的丰度高于MP和bp，表明酸性峰具有更好的Fc-γ-RⅢa亲和力。对Fc-γ-RⅢa色谱中mAb-A2的三个峰进行分离，并进行离线N-聚糖分析，以获得准确的糖型分布结果。在峰1、峰2和峰3中观察到聚焦化和半乳糖基化的含量逐渐增加。集中化已被广泛报道可增强ADCC的活性有趣的是，观察到半乳糖基化对Fc-γ-RⅢa亲和力的积极影响，这与先前的研究一致。　　图4 (A)Fc-γ-RⅢa亲和谱图2DLC(CEX×Fc-γ-RⅢa)分析。(B)mAb-A2的N-聚糖谱及其Fc-γ-RⅢa亲和组分 (峰1、峰2、峰3)。　　综上，利用MDLC-MS系统深入表征电荷变体的结构和生物活性，包括分子量、PTMs和Fc-γ-RⅢa亲和力。该过程可以在发现和工艺开发阶段对单克隆抗体进行电荷变异分析。MDLC-MS可以在研发中发挥重要作用，使从DNA序列到新药研究(IND)申请的时间流程缩短。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：In-Depth Characterization of mAb Charge Variants by On-Line Multidimensional Liquid Chromatography-Mass Spectrometry　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Liu, Z., Y. Cao, L. Zhang, Y. Xu,Z. Zhang.(2023).In-Depth Characterization of mAb Charge Variants by On-Line Multidimensional Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical chemistry.

液相色谱通常使用紫外-可见光（UV-Vis）吸光度检测器或光电二极管阵列（PDA）检测器。然而，光吸收检测器不适合检测无紫外光吸收的化合物、低浓度存在的化合物或没有充分分离的化合物（共洗脱化合物）。对于此类化合物，质谱仪可以用作补充检测器。由于质谱仪基于不同的测定原理，因此可以测定无紫外吸收的化合物。此外，质谱仪可以提供有关化合物的质量信息，从而可以获得更准确的定性结果。LCMS-2050单四极杆质谱仪具有Mass-it&trade 功能，可以将质谱获得的化合物质量数（m/z）信息叠加到紫外色谱图上，以支持补充使用紫外检测器获得的定性分析结果。SPD-M40 PDA检测器（左）和 LCMS-2050 MS检测器（右）PART 1液相色谱（LC）工作原理液相色谱（LC）是一种使用检测器监测色谱柱分离化合物的分析技术。它可以提供有关样品中所含化合物的各种信息。根据定性信息（如化合物保留时间）和定量信息（如检测器信号强度）的组合，对样品进行定性和定量分析。如果使用光电二极管阵列（PDA）检测器，则可以同时分析多个波长，以获得每个单位时间的紫外吸收光谱。由于每种化合物都具有独特的紫外光谱，因此它们提高了识别化合物成分的能力（定性分析性能）。使用PDA检测器获得的LC分析结果如上图所示。254nm波长处吸光度的紫外色谱图包括4种化合物的峰。PART 2质谱（MS）工作原理质谱（MS）是连续电离化合物以获得化合物质量信息（m / z）的仪器。体积紧凑且操作简单的LCMS-2050是一款单四极杆型质谱检测器，可用作LC检测器，其操作方式与使用PDA检测器相同。PDA检测器扫描紫外波长，MS检测器扫描一系列m/z值，并将响应显示为质谱图。或者，可以指定某个m/z值并将响应强度绘制为时间的函数，以将数据显示为定量色谱图。使用MS检测器获得的TIC分析结果如上图所示。除了紫外色谱图上看到的4种化合物的峰以外，还有化合物A的峰。PART 3结合使用PDA和MS检测器，获得丰富信息下图中结合了从PDA检测器获得的的3D图形数据和从MS检测器获得的质谱数据。并列出了化合物信息（化合物名称和理论m/z值）和每种组分的质谱图。因此，结合使用PDA和MS检测器可以提供大量定性信息，这对于确定样品中包含的所有成分非常有用。通过MS检测器获得的信息，可以清楚的看到没有紫外吸收的化合物，以及没有充分分离的共流出化合物。从PDA检测器获得的3D数据和从MS检测器获得的质谱数据什么是Mass-it&trade 功能？Mass-it&trade 可以将从质谱检测器获得的化合物 m/z 信息自动叠加在相应的紫外色谱图中，从而提高紫外色谱图中化合物鉴定的可靠性和整体可见性。Mass-it&trade 功能的应用Mass-it&trade 可以将从质谱检测器获得的化合物 m/z 信息自动叠加在相应的紫外色谱图中，从而提高紫外色谱图中化合物鉴定的可靠性和整体可见性。01使用Mass-it&trade 功能检测无紫外线吸收的化合物在上述案例中，保留时间0.8min左右的苯海拉明在254nm处吸光度较低，PDA检测器未检出，但MS检测器检测到了峰。因此，使用Mass-it&trade 功能将m/z信息添加到紫外色谱图中，可以防止漏检无紫外吸收的化合物。02使用Mass-itTM功能检查合成产物的分子量在化学合成或药物发现研究中，使用紫外检测器定量分析目标物时，通常希望同时获得目标物的质量信息以验证合成路线是否正确。Mass-it&trade 对于这一类分析应用特别有帮助。下图显示了分析含有杂质的阿托伐他汀样品测定结果，主成分峰的保留时间约为10.6 min。Mass-it&trade 功能会自动将质谱图中获得的信息（m/z 559.3）添加到紫外色谱图中，从而一目了然地看到阿托伐他汀是主峰。m/z信息也可以添加到峰面积为主峰0.1%或更小的峰上，有助于分析杂质。03使用质谱功能检测共洗脱峰对于色谱柱无法完全分离的多种化合物，则它们在紫外色谱图中显示为一个峰（共洗脱峰）。如果这些化合物保留时间特别接近，则很难发现这是一个共洗脱峰。然而，共洗脱可以从质谱信息中确定。Mass-it&trade 功能通过在UV色谱图上显示从质谱获得的m/z信息，为发现共洗脱化合物提供支持。下图显示了7种药物同时分析的案例，其中劳拉西泮和奥沙西泮没有完全分离，该共洗脱峰的保留时间为4.9min。鉴于劳拉西泮和奥沙西泮分别在m/z 320.8和286.8处被检测到，Mass-it&trade 将m/z信息添加到同一位置的紫外色谱图中，并以黄色箭头标识，从而轻松发现共洗脱化合物。此外，岛津PDA检测器具有i-PDeA II功能，利用智能峰解卷积技术可以从未分离色谱峰中提取目标峰。同时使用i-PDeA II和Mass-it&trade 功能可以提供更可靠的分析结果。小结Mass-it&trade 功能通过在紫外色谱图上显示MS获得的m/z信息来帮助识别化合物。它对于检查合成化学品中的分子量或杂质分析特别有用。即使检测到没有紫外吸收的化合物，质量数信息也会显示在紫外色谱图上，这有助于防止忽略部分化合物。对于共洗脱的未充分分离色谱峰，质量数信息将显示在同一位置，以提示用户注意共洗脱化合物。本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

p 　　从用户来讲，质谱软件是评价质谱系统性能指标最重要的因素之一。不同质谱公司的质谱软件差异非常大，而且目前还没有公认的统一的规范。相比而言，国外质谱软件比国内质谱的软件专业性更强、可靠性更高、投入技术和资金也更大。 /p p 　　灵敏度是任何一台质谱仪器的必须指标之一，但信噪比的计算方法多种多样，目前每个公司都对软件算法进行保密而计算结果都不一样，即使是第三方质谱软件公司的算法也不一样，因此，用户实际上很难通过信噪比参数来横向比较同类质谱仪器的优劣。 /p p 　　对于蛋白质来说，多电荷峰的去卷积算法最为关键，否则，分子量结果的准确性和可靠性难以评估。对目前主流质谱公司的去卷积软件进行比较后发现，只有个别质谱公司的去卷积计算结果有质量控制(QC)，有些公司的去卷积软件甚至不是实测质谱图。质谱采集软件由于涉及较多的商业利益，鲜有人进行深层介绍和评价。 /p p 　　由于质谱采集卡等硬件速度和带宽的大幅度提高，实时信号的实时处理技术方案就很重要了。有些公司采用内置独立处理电脑，有的是独立采集卡，它们对实时信号的预处理技术和深度差异很大，但是无论如何，简单平滑去噪的方案是不推荐的，而应该是根据质谱硬件情况开发更先进的算法来降低点噪音和化学噪音，从而提高质谱定量分析灵敏度和动态范围。 /p p 　　质谱数据库方面，NIST依然处于领先地位，近些年增加了许多蛋白质ms/ms数据。通过质谱公司与科研机构合作，微生物质谱数据库和代谢物数据库规模正不断扩大，预期将对质谱应用的进一步拓展起到重要的推动作用。目前，提高未知物鉴定效率和可靠性的软件和数据库还没有令人满意的进展。没有强大的数据库，就没有智能质谱。数据库的构建是个工作量巨大、成本巨大的事情，首先需要建立标准体系，然后需要大量人工去伪，还需要良好的算法。欧洲生物信息研究院(EBI)应该成为质谱数据库建设的范例。 /p p 　　当质谱硬件发展到一定程度后就会出现平台期，软件和应用支持则是质谱系统的核心竞争力，因此，培养质谱软件技术人员和应用支持人员，是国内外质谱公司研发投入的着眼点，这对于国内质谱的持续发展尤为重要。 /p p style=" text-align: right " 本文作者为蛋白质药物国家工程研究中心魏开华研究员 /p

p 　　LC-MS/MS作为蛋白组学分析的主要手段，所分析的样品分子过于微小肉眼不可见，需要借助色谱图、质谱图判断其表现，但你看到文章里的质谱图是否感觉迷惑不解，甚至色谱图和质谱图傻傻分不清呢?文章返修编审让补充的有注释信息的二级质谱图究竟是个什么东东?今天小编带你一起解密。 /p p 　　我们常说的图谱分为两类，色谱图与质谱图。色谱图评价的是母离子在色谱上的表现，质谱图则是一级母离子和二级碎片子离子在质谱里的信号表现。这里小编跟你分享一个区分两种图谱的秘密，那便是看横坐标，横坐标是时间轴的为色谱图，横坐标是质荷比的那就是质谱图了，不管色谱图还是质谱图，纵坐标都是信号强度! /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/d2a264a0-7451-4f84-98dc-0b5062ac709e.jpg" title=" 1.jpg" / /p p 　　常见的色谱图有Basepeak图、TIC图、XIC图 质谱图经常提到的是一级质谱图，二级质谱图，b,y离子匹配图(有注释信息的二级质谱图)，下面我们逐一看过来。 /p p 　　 strong 【色谱图】 /strong /p p strong 　　Basepeak 图： /strong /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/363edb6d-6fda-4948-81e5-4c0da2a627b5.jpg" title=" 2.jpg" / /p p 　　看到上图，做过LC-MS/MS实验的童鞋是不是有一种似曾相识的感觉?你肯定在哪里见过。 /p p 　　Basepeak图是色谱分离过程中将每个时间点质谱检测信号最强的肽段的强度值连续描绘得到的图谱。图中峰多信号强说明样品复杂度高量也足。由于上机的样品是蛋白质酶解后的肽段，所以如果你要问小编能否将鉴定到的蛋白质在basepeak图上标出来，答案是不能!!! /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/0e1dca0d-99a3-4c0d-83e6-259c06cc0fd8.jpg" title=" 3.jpg" / /p p strong 　　TIC图： /strong /p p 　　全称为Total ion chromatogram，即总离子流图，相比Basepeak图是用每个时间点质谱信号强度最高的母离子绘制的图谱，TIC是样品中所有离子的色谱图。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/8d76db07-faf1-4889-a7a7-d28156306780.jpg" title=" 4.jpg" / /p p strong 　　XIC图： /strong /p p 　　全称是Extracted ion chromatogram，即提取离子流色谱图,为某个特定母离子的色谱图，XIC图的峰面积可以用于蛋白定量分析。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/30b83abf-94dc-44f3-a7c4-305e22fc80fa.jpg" title=" 5.jpg" / /p p 　　 strong 【质谱图】 /strong /p p 　　一级质谱图是一次质谱全扫描内所有母离子的信号分布图，二级质谱图是特定母离子在高能碎裂后产生的二级离子的信号分布图，样品经质谱鉴定后生成的质谱文件实质是数万张一级质谱图和二级质谱图的叠加。 /p p 　　原始二级质谱图，如下图(m/z=377.54)，为实际检测到的二级离子的质荷比的分布图，只有一个个孤独的峰，代表一个个孤单的子离子，没有归属，只有将其大小与宗氏族谱(理论的肽段序列碎裂后生成的二级离子分布)匹配后，方能知道其名姓(肽段序列)。匹配后的图就是文章里提到的有注释信息的二级图，也叫做b,y离子匹配图。修饰组学及一段肽的蛋白发文章时可能会被要求提供b,y离子匹配图。 /p p style=" text-align: center " strong img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/741b86e1-6126-4e8e-a498-782c779009ae.jpg" title=" 6.jpg" / /strong br/ /p p style=" text-align: center " 　　B,y离子匹配图 /p p 　　将实际检测到的二级离子的质荷比分布与肽段序列断裂后理论形成的子离子匹配后的图谱。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/383ca26b-e241-4004-8430-5f9ab963f299.jpg" title=" 7.jpg" / /p p 　　肽段在能量作用下断裂后会生成一个个b,y离子对。左面的碎片为b离子，右边的碎片为y离子，以上图为例，KTQAASVEAVK理论生成的b,y离子对为： /p p 　　第一个氨基酸与第二个氨基酸中间断开(K|TQAASVEAVK)，则生成b1=K(从左往右数1)，y10=TQAASVEAVK(从右往左数10) /p p 　　第二个与第三个氨基酸中间断开(KT|QAASVEAVK)，生成b2=KT,y9= QAASVEAVK 其他位置断开，依次类推……。 /p p 　　本肽段中如果第一个氨基酸K上发生了泛素化修饰(已经标红)，我们应该如何找出该位点被修饰的证据呢?请往下看。(哎哎继续往下看，别走神儿!) /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/e98257d8-53f4-496b-9f0e-c37fb645c9ce.jpg" title=" 8.jpg" / /p p 　　肽段碎裂后检测的b3(KTQ),b4(KTQA)离子可能带有修饰集团，以b3为例，如果K上发生修饰，则b3的分子量应该比不带修饰的b3(KTQ)理论分子量(376.22-18.01(QA连接是脱了水的)=358.21)多一个修饰集团glygly-的分子量(114.04)，即=358.21+114.04=472.25，而我们检测到的b3离子的分子量刚好为472.25，说明b3(KTQ)离子携带了泛素化修饰集团.因泛素化常发生在K上，推测应为K发生了泛素化修饰。 /p p br/ /p

国产又一家核酸质谱供应商，　　目前，常见的分子诊断技术主要有荧光定量 PCR 技术(qPCR)、高通量测序技术(NGS)等。随着 MALDI-TOF-MS 技术的发展，核酸质谱技术也应运而生。　　核酸质谱技术可实现单个样本同时进行几十甚至几百种靶标检测，每日处理的样本数可达千例以上，且结果分析简单。核酸质谱技术的出现能够弥补 qPCR 通量低和 NGS 耗时长、报告解读复杂的不足，已经成为研究单核苷酸多态性 ( SNP ) 、基因插入 / 删除、基因选择性剪接、基因拷贝数变化、基因表达、基因组 DNA 甲基化、tRNA 和 rRNA 的转录后修饰等课题的有效检测手段。　　在核酸质谱技术领域，笔者近日关注到一家创办于 2022 年的创新公司苏州维基基因科技有限公司(以下简称 " 苏州维基 ")。苏州维基由多位业内资深医学博士联合创办，围绕其多项独有的基因检测技术，为临床及实验室等多场景提供核酸质谱整体解决方案，包括相关实验室建设、仪器、项目选择、试剂开发、临床检测全流程服务。苏州维基作为新一代基因检测机构，致力于通过开发更经济、科学、灵敏度高的检测方法提供高稳定性、高性价比的检测服务。　　复杂、多靶标诊断场景，核酸质谱具有极致性价比　　20 世纪 80 年代出现的 MALDI-TOF-MS 技术打破了以往质谱仅可进行小分子物质分析的传统，使得核酸、蛋白质等生物大分子也可应用质谱进行研究，极大推进了基因组学、蛋白质组学的发展，并给生物及医学领域带来了革命性的突破。　　核酸质谱是在 MALDI-TOF-MS 技术基础上发展出来的一种多重 PCR 分析检测系统，通过 " 多重 PCR+ 高通量芯片 + 飞行时间质谱 " 的技术路径，能够在保持高灵敏度、高特异性的情况下，同时具备检测多基因多位点、通量大、检测速度快及极致的性价比优势。　　在基因检测中，常见的分子诊断技术包括 qPCR 和 NGS 技术。在 qPCR 检测中，受到荧光通道数量的限制，要实现更大通量的检测只能依靠反复检测 而利用 NGS 技术进行检测分析成本较高，且报告周期达 7 天。" 对于临床需求而言，检测位点在 20~30 个或者 100 以内的时候，核酸质谱是更契合的检测技术。" 苏州维基联合创始人林有升说。　　核酸质谱能够直接依据分子量的差异进行检测。当核酸发生变异时，无论是碱基的替换或修饰，都会改变 DNA 的分子质量，因此，只要待测靶标扩增后的分子量不同，就能够进行精准识别。　　核酸质谱适合 10~100 靶标位点的基因检测，与 Sanger 测序符合度超过 99%，且重复性好。据介绍，核酸质谱仪器及配套试剂成本较低，同时每孔可分析 50 个位点，一次可分析 96 个样本，单次检测时间为 8 小时，报告周期约为 3 天。　　2018 年，中国核酸质谱医用专家共识协作组在中华医学杂志刊登《中国核酸质谱应用专家共识》，系统介绍了 MALDI-TOF-MS 技术的原理及应用等方面的内容，以提高核酸质谱在国内临床及实验室中的认知程度，推动其临床转化应用。目前，核酸质谱在临床中更适合用于复杂的、多靶标疾病的诊断，主要包括出生遗传缺陷、肿瘤、药物基因组、病原体多联检和耐药性检测等。　　突破国产核酸质谱试剂多个瓶颈问题，修饰后 dNTP 分子量差别大于 15　　受限于技术壁垒和政策变动等因素，长久以来，国内核酸质谱检测试剂依赖于进口，除了成本高外，更受到货期等其他方面的影响，进一步限制了核酸质谱技术的临床应用推进。" 核酸质谱的临床应用要关注多个方面，包括技术平台的灵敏度、特异性、通量、报告时长以及成本等。" 林有升说。　　为了实现核酸质谱试剂的国产化，苏州维基对核酸质谱检测流程中的多个环节进行了技术优化。PCR 技术是核酸质谱的关键技术环节之一，苏州维基通过 LNA-Blocker 技术，阻遏阴性模板以提高检出率，同时依靠自主开发出多重 PCR 设计软件，设计出的 UEP 引物特异性良好，能够将扩增数量达到 100 对以上。　　核酸质谱主要通过检测多重 PCR 反应的产物，即单碱基延伸的产物质量大小来进一步确定检测结果。目前，核酸质谱技术主要依赖单碱基延伸反应来进行操作，单碱基延伸的效率关系到核酸质谱的检测效率，而区分度则是能否成功检测的重要标准。　　dNTP 修饰技术是单碱基延伸过程中的重要技术，目前国内市面上比较成熟的核酸质谱制剂中的 dNTP 最小分子量差异为 9.21 Da。在检测中，由于分子量差异过小，出现检测的 SNP 为 AT 突变时，不同峰区的区分度很低，或是由于峰高差异较大出现 " 鼓包峰 " 等情况，从而干扰结果判读，这也成为制约核酸质谱临床应用的技术瓶颈之一。　　基于其多年的技术开发经验，苏州维基已经攻克核酸质谱 dNTP 修饰技术。据介绍，修饰后的 dNTP 具有良好的单碱基阻遏效果，同时表现出极高的链接效率，而在区分度上，使用该技术进行修饰的 dNTP 分子量差别大于 15，区分度较高，失败风险降低。　　面对不同的检测场景，苏州维基也从技术层面进行了推进和解决，致力于扩大核酸质谱技术的临床应用。例如，通过搭建甲基化核酸质谱检测防污染方案，可降低 98% 的 PCR 产物污染，在不影响检测灵敏度的情况下，解决了在 DNA 甲基化检测中因 PCR 产物污染造成检测结果不准确的产业化难题。　　另外，依靠核心团队多年深耕检测行业，苏州维基已经积累了数万例肿瘤样本 ctDNA 基因突变谱、DNA 甲基化谱、SNC、CNV、MSI 等数据，数万例肿瘤样本全基因组检测数据及数万例肿瘤样本 ctDNA 含量、片段大小、断裂点、GC RICH 等数据，为其进一步优化技术和产品开发打下坚实基础。　　打造三种解决方案，通用试剂可适配常见核酸质谱仪　　凭借对核酸质谱检测流程中的多个环节进行了技术优化，苏州维基依据临床使用场景计划以 LDT 模式打造三种解决方案：病原微生物基因检测、药物基因组检测(遗传基因检测)及肿瘤基因检测。　　病原微生物基因检测将通过打造 39 种病原微生物联检试剂，来覆盖 91% 以上的呼吸道感染疾病 药物基因组检测将涵盖心脑血管疾病、自身免疫系统疾病、精神类疾病、感染性疾病用药药物基因检测及单基因遗传病致病基因检测，提高各类疾病用药安全性及疗效 针对肿瘤基因检测，目前苏州维基将聚焦于消化道肿瘤筛查血浆游离 DNA 甲基化检测，实现血浆游离 DNA 甲基化启动子区 CpG 岛甲基化谱绘制。　　目前，苏州维基已经开发出了国产化的全血 / 拭子核酸纯化试剂、血浆游离 DNA 纯化试剂、多重化 PCR 扩增试剂、单碱基引物延伸试剂、PCR 产物阳离子纯化试剂以及多重 PCR 设计程序、UEP 引物设计程序两款软件。可以说，苏州维基已经走通了核酸质谱的全技术链条。　　据介绍，苏州维基开发的核酸质谱通用试剂 "MASS GEL ™ " 能够适配市面上常见的核酸质谱仪。" 在转化率、扩增效率、得率、稳定性及操作步骤上，MASS GEL ™表现都十分优异。其转化率超过 98%，实验步骤简化至五个。" 林有升说。　　" 随着核酸质谱国产化的快速发展，仪器成本和试剂成本不断降低，已接近 QPCR 仪器和试剂成本，表现出明显的成本优势。无论是从技术优势还是成本优势来看，核酸质谱都有潜力、有机会能够在临床应用中大显身手。" 林有升强调。关于苏州维基　　苏州维基基因科技是一家致力于核酸质谱国产化临床应用试剂开发与应用的技术主导型公司，由多位生物学、医学博士创办，公司申请专利5项，产品覆盖药物基因组学检测、病原微生物核酸联检，核心技术有“LNA-Multiplex-PCR”，”核酸质谱防污染技术”，“核酸质谱高效延伸技术”，“dNTP修饰技术”。苏州维基通过持续的技术开发和优化，已有药物基因组和病原微生物多款产品经过性能验证，有数款技术打破国外技术垄断，为我国临床基因检测技术进步贡献自己的力量。

p 　　何为非变性质谱?就是选用温和的溶液体系及质谱条件，使蛋白保持在非变性状态下被分析。听到这，有些小伙伴可能会一头雾水：师兄师姐教我处理蛋白质样品的时候，第一步就是要变性啊，怎么现在又不要变性了? /p p 　　在通常的蛋白质相关分析中，为了破坏蛋白质的三维立体空间结构，便于酶解等操作，会通过加热或是加入高浓度的变性试剂(如尿素、盐酸胍等)，使蛋白质变性 另外，对于常用的分离手段——反相色谱来讲，其流动相的酸性pH条件与高有机相同样也会使蛋白质变性。当需要对蛋白质中的非共价结合进行研究时，为了避免非共价结合被强烈的变性条件所破坏，则需在非变性的液相-色谱条件下(通常为50mM醋酸铵，pH=7的中性体系)进行研究 另外，对于组成较为复杂的蛋白样品，在非变性条件下分析时，由于体系中质子数减少，所以蛋白电荷态数目也会相应减少，电荷态之间的相互重叠度也会下降，进而减少复杂组分之间的相互影响，从而能够得到复杂蛋白样品中每个组分的分子量信息(图1)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图1_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/56171fe8-be7c-4cc8-a672-814a9fe87e30.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　 strong 图1 /strong 同一样品分别于变性及非变性条件下进行分子量测定的原始谱图 /p p 　　目前， strong 非变性质谱技术主要应用在两个方面 /strong ：一是 strong 生物制药领域 /strong ，通过打开单克隆抗体链间二硫键后在Cys位点上偶联小分子药物(Cys-ADC)的完整分子量分析，此类药物的链间仅靠非共价力结合，故变性条件下各条链会分离，无法测得其完整状态的分子量 另一应用方向为 strong 研究蛋白质多聚体 /strong ，非变性条件下不仅可以保持各个亚基间的非共价相互作用，同时由于中性条件更接近生理状态，得到的结果更具意义。 /p p 　　现在，非变性质谱与氢氘交换、X-ray衍射、核磁共振、冷冻电镜和cross-linking等技术联合使用、互为补充，已经越来越多的被应用在结构生物学、生物医药等领域的研究中。本期文章将会重点介绍非变性质谱在治疗性生物医药制品完整分子量测定中的研究，下期文章将会侧重介绍非变性质谱用于蛋白复合物的研究进展。 /p p span style=" COLOR: #002060" strong Orbitrap超高分辨质谱：非变性质谱研究的理想平台 /strong /span /p p 　　古人云：工欲善其事，必先利其器。要想研究做得好，趁手工具不可少!针对于非变性质谱研究中的需求，我们在Orbitrap质谱平台上对相关参数进行了优化，包括离子源区脱溶剂能量、质量范围的扩展以及高质荷比离子传输效率的优化等，使Orbitrap在固有的高分辨率、高质量精度及高灵敏度基础上，在非变性质谱领域也能有出色表现。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图2_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/caeec8f3-896f-4e02-a44a-84aae9ecd287.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图2 /strong Orbitrap质谱平台用于非变性质谱分析 /p p 　　上文中提到，在生物制药领域中，会通过分子工程设计，在单克隆抗体的特定氨基酸上通过化学反应，偶联上小分子治疗药物，通过单克隆抗体的靶向识别功能将小分子药物精确带至病变细胞处并释放，达到精确给药、减少毒副作用的目的，这类药物被称作抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADCs)。在这类药物中，通过将单抗链间二硫键打开从而在Cys位点上偶联药物的Cys-ADC，由于其链间仅靠非共价力结合，故需在非变性质谱条件下才能对其完整分子量进行测定(图3)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图3_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/270ff8dd-d5c1-442b-baf1-f287fcb557b9.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　 strong 　图3 /strong Cys-ADC结构示意图 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　图4展示了使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量的结果。由图中不难发现，使用体积排阻色谱(SEC)，可以将单克隆抗体与其他杂质分离开，而Orbitrap质谱平台能够得到基线分离、信噪比高的原始谱图。经数据处理软件解卷积处理后，可见偶联了0/2/4/6/8个小分子药物的簇峰分布，符合Cys-ADC的典型分布特征 解卷积后计算所得该ADC的药物/抗体比值(Drug to Antibody Ratio, DAR)，与之前报道过的DAR值相符。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图4_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/b494de8a-6ac5-42cf-ad12-d84637e32bef.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图4 /strong 使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。 /p p 　　作为对照，在变性条件下也对同一个样品进行了分子量测定(图5)，发现链间的非共价结合在强烈的变性条件下均被破坏，只能观察到部分ADC的分子量信息。该实验进一步说明了在非变性条件下对Cys-ADC进行分子量测定的必要性。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图5_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/46b85220-b769-47dc-b534-f92c93b56cff.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图5 /strong 变性质谱条件下对Cys-ADC进行分子量测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。 /p p 　　对于常见的另外一种ADC——Lys-linked ADC，虽然其小分子药物与单克隆抗体是通过共价键相结合，但偶联上小分子药物后，ADC的复杂度大大增加，此时若在非变性条件下进行分子量测定，可以减少信号之间的干扰，得到更加准确的测量结果(图6)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图6_20170406090915_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/7c9e60f0-f01a-45eb-85eb-f9dceece9c46.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　▲非变性条件可减少复杂组分间信号重叠 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 非变性2_20170406090518_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/e634be51-bf68-49f2-b7be-e205227a7242.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　▲非变性条件下Lys-ADC完整分子量测量结果 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图6 /strong 使用非变性质谱平台对Lys-ADC进行完整分子量测量。 /p p 　　 strong 小结 /strong /p p 　　本期我们对非变性质谱技术的原理、适用范围进行了介绍，并以Cys-ADC与Lys-ADC样品的完整分子量测量为例展示了该方法的应用，不知道小伙伴们有没有对非变性质谱技术有个初步的了解呢?下期我们将会介绍该技术在蛋白复合物研究中的应用，各位看官走过路过不要错过，我们下期见! /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] Dabaene et al., Anal Chem. 2014, Nov 4 86 (21):10674-83. /p p & nbsp /p

壳聚糖及其测定壳聚糖是目前研究最多的多糖类天然高分子材料，对于生物体来说，壳聚糖具有优良的生物相容性和降解性。将其植入人体后，可被人体组织中的酶缓慢吸收，是用来制作缝线和创伤覆盖材料的高分子材料。由于其优越的性能，使得壳聚糖在化工、 轻工、 医药、 食品及环境保护等领域中的开发应用研究十分活跃。 壳聚糖的学名为β-（1，4）聚-2-氨基-D-葡萄糖，是甲壳素最重要的衍生物,是除蛋白质以外含氮量MAX的有机氮源,也是自然界中仅有的碱性多糖，其相对分子量通常在10万-30万，但几乎不溶于水，其中分子量是影响壳聚糖溶解性的主要因素之一，分子量越低其溶解性就越好。 凝胶色谱法(GPC)是测定壳聚糖相对分子质量及其分布的常用方法，这将有助于推动壳聚糖作为生物医用材料的选择和设计。 应用案例——GPC测定壳聚糖本案例基于Waters1515凝胶色谱仪，搭配Ultrahydrogel色谱柱，对市售壳聚糖的相对分子量及分布进行计算。1、仪器 ▲Waters1515凝胶色谱仪，配示差检测器 2、标准品聚乙二醇标准品套组 3、实验条件01RI流通池温度40 °C02流动相50 mM 的醋酸+100 mM 硝酸钠缓冲液03流速0.45 mL/min04色谱柱Waters Ultrahydrogel 2000柱，7.8 ×300 mm05柱温40 °C 06样品稀释剂50 mM 的醋酸+100 mM 硝酸钠缓冲液07进样量50 μL08数据处理软件Empower QS +GPC计算模块色谱数据软件09样品处理1 mg/mL的壳聚糖4、结果与讨论壳聚糖样品的色谱图如下： 图1. 壳聚糖样品色谱图 利用Empower QS中GPC选项的功能，采用标样的保留时间绘制标准曲线，来计算壳聚糖样品的分子量分布，软件会自动计算出对应的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、多分散性等相关参数。 连续6针进样的重复性色谱图如下，通过计算Mw的RSD小于0.2%，表明此方法重复性良好。 Waters GPC优势行业先驱 Waters 从 1963 年起就致力于 GPC 技术的研究和开发，经过 50 多年的发展，使Waters 成长为 GPC 技术的引航者。专业 多项*技术加持，保证检测结果的准确性及重现性。易上手 简单、易操作，性能稳定，专为高聚物领域量身打造。参考文献[1] 凝胶渗透色谱法研究壳聚糖生物材料酶降解过程的均匀性[2] 用GPC研究壳聚糖氧化降解过程中的分子量及其分布_刘羿君[3] 壳聚糖作为医用高分子综述-王霞

全柱成像毛细管等电聚焦（imaged capillary isoelectric focusing, iCIEF）是一种基于蛋白质等电点（isoelectric point, pI）将其分离的技术，在生物制药行业中被广泛应用于电荷变异体的分析。与传统的毛细管等电聚焦（CIEF）技术相比，iCIEF具有方法开发更快（每个样品仅需10~15min），灵敏度更高，pI值相近的电荷变异体分离更好（分离精度0.01pI），仪器平台稳定性好以及高分析通量等优点。图1 iCIEF分离及UV检测原理虽然iCIEF平台可以将常见的生物治疗产品，如单抗、融合蛋白等按照其等电点进行分离，但受其检测手段的局限性，无法得到更为全面深入的蛋白表征信息。2021年6月，赛默飞世尔科技宣布了与Advanced Electrophoresis Solutions Ltd（AES）的合作， 通过将AES的CEInfinite iCIEF平台与赛默飞的高分辨质谱平台联用，对iCIEF分离的电荷变异体进行表征，从而实现对生物治疗产品更加深入的理解。图2 CEInfinite iCIEF平台今年9月，来自丹麦Symphogen 的首席科学家Dan Bach Kristensen在CE Pharm 2021会议上以视频形式介绍了iCIEF-MS联用的最xin成果。Dan在报告中提到，使用质谱对单克隆抗体进行分子量分析，样品前处理步骤简单，且Orbitrap高分辨质谱平台的高分辨率和高灵敏度等优点可以提供足够多的信息，帮助科研人员从完整分子量层面对产品进行监控。通过将不同原理的液相分离技术，如SEC/CIEX/Protein A/RPLC分别与质谱串联，可以将单克隆抗体的不同类型变异体进行分离，随后得到各个变异体的分子量信息。Dan在他的演讲中举了一个使用iCIEF-MS联用对参比品（-80℃保存）和实验品（48个月，5℃保存）进行对比的示例。通过观察iCIEF-UV图谱，发现相较于参比品，实验品的酸/碱峰均有一定比例的上升。进一步通过质谱数据确认导致酸/碱峰比例增加的具体修饰类型，发现对于碱峰，Orbitrap高分辨质谱的高分辨率和高灵敏度等优点可以最da限度的减少相邻质谱峰的重叠，从而提供更加可信的鉴定结果。最终，通过质谱测定的完整分子量结果，可以得出的结论是实验品中与稳定性相关的产品属性含量上升，而与质量相关的产品属性变化不大

各有关单位：经研究，现对《电化学储能系统火灾监测预警系统通用技术要求》等223项拟立项国家标准项目公开征求意见，征求意见截止时间为2024年4月10日。请登录请登录标准技术司网站征求意见公示网页http://std.samr.gov.cn/gb/gbSuggestionPlan?bId=10001651，查询项目信息和反馈意见建议。2024年3月11日 相关标准如下：#项目中文名称制修订截止日期1地理标志产品质量要求 安吉白茶修订2024-04-102地理标志产品质量要求 坦洋工夫茶修订2024-04-103地理标志产品质量要求 武夷岩茶修订2024-04-104地理标志产品质量要求 政和白茶修订2024-04-105多糖分子量及分子量分布的测定 高效凝胶渗透色谱-激光光散射法制定2024-04-106标准数字化平台 第1部分：系统架构制定2024-04-107标准知识图谱 第1部分：实现指南制定2024-04-108蛋白检测 CRISPR Cas12a蛋白反式切割活性检测方法制定2024-04-109工业品电商平台供应商能力建设指南 总则制定2024-04-1010医疗装备运维服务 第1部分：通用要求制定2024-04-1011制药装备 生物反应器通用技术要求制定2024-04-1012智能消费品安全 第1部分 危害（源）识别制定2024-04-1013智能消费品安全 第2部分 风险评估制定2024-04-1014智能消费品安全 第3部分：风险控制制定2024-04-1015重组蛋白试剂 亲和力测定方法制定2024-04-10

仪器信息网讯 2011年10月12-15日，第十四届北京分析测试学术报告会及展览会(BCEIA 2011)在北京展览馆隆重举行。为让广大网友及仪器用户深入了解BCEIA 2011仪器新品动态，仪器信息网特别开展了以“盘点行业新品 聚焦最新技术”为主题大型视频采访活动，力争将科学仪器行业最新创新产品、最新技术进展及最具有代表性应用解决方案直观地呈现给业内人士。以下是仪器信息网编辑采访赛默飞液相色谱/离子色谱及样品前处理产品中国区销售/服务总监梁晓峰先生、质谱产品应用工程师李静女士、质谱产品售前应用工程师叶芳婷女士的视频。 　　赛默飞世尔科技是科学服务领域的世界领导者，致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额接近110亿美元，拥有员工约37000人。赛默飞世尔科技进入中国发展已有30余年，目前在华员工人数已经超过1900名。 　　在采访中，赛默飞液相色谱/离子色谱及样品前处理产品中国区销售/服务总监梁晓峰先生、质谱产品应用工程师李静女士、质谱产品售前应用工程师叶芳婷女士向我们介绍了赛默飞色谱质谱新产品的情况。 　　“EASY-nLC 1000纳升级液相色谱仪是赛默飞在2011年美国质谱年会上全新推出的产品。其提供不分流的纳升级UHPLC性能，高达1000 bar压力，是目前耐压最高的液相色谱，非常适合蛋白质组学研究。该仪器的操作非常智能化，触屏式操作，用户使用非常方便。” 　　“Q Exactive 质谱仪台式LC-MS/MS将高性能四极杆的母离子选择性与高分辨的准确质量数(HR/AM)Orbitrap检测技术相结合，提供优异性能和出色多功能性。其分辨率非常高，能达到140000，采用S-Lens离子源，提供更佳灵敏度，具有快速扫描和多重检测能力，不仅具有大范围的筛选能力，而且尤为擅长目标定量实验，使任何实验室都能充分利用其多功能性。快速交替的正负极扫描模式支持最复杂的分析方法，在筛选实验中节约时间。该产品特别适合于药物代谢组学、蛋白质组学、环境分析、食品安全、毒物学以及临床研究应用。” 　　“Orbitrap Velos Pro组合型质谱仪在定量性能、裂解模式、扫描速度、抗污染等四方面有了很大的改进，特别适合定量分析，适用于蛋白质组学研究等领域。Orbitrap Elite组合式质谱具有业界领先的超凡性能，将下一代高场Orbitrap分析器和最新Thermo Scientific Velos Pro双压线性离子阱高效结合。其采用新型高场Orbitrap分析器，采用如碰撞诱导解离(CID)、更高能量碰撞诱导解离(HCD)以及可选的电子转移解离(ETD)等多种裂解技术，其分辨率 240,000 FWHM，提高了样品分析的速度、灵敏度和动态范围，可确定完整蛋白质的分子量，进行深入的同位素分析，从而提供极其可靠的分析结果。当处理复杂的低丰度样品时，例如在蛋白质组学、代谢组学和脂组学中，这种系统的超高分辨率尤其有用。” 　　欲了解更多关于赛默飞参展BCEIA2011的详细信息，请点击：www.thermo.com.cn/BCEIA2011

科学仪器被称作科学家的“眼睛”。质谱仪作为国际上最尖端的科学仪器之一，是直接测量物质原子量、分子量的唯一手段，被誉为“科学仪器皇冠上的明珠”。柴之芳院士质谱质量分析器质谱整机十多年前，质谱技术在国内基本还是一片空白。海归博士周振把“做中国人的质谱仪器”作为自己的终身奋斗目标。他创办了广州禾信仪器股份有限公司，并带领公司建成了我国第一个质谱仪器正向研发平台，实现了我国高性能飞行时间质谱仪的国产化和产业化，使我国成为掌握飞行时间质谱核心技术的国家之一。2021年11月，放射化学家、中国科学院院士柴之芳在禾信仪器设立了院士专家工作站。禾信仪器正联合院士团队向质谱仪的关键核心技术发起攻关。他们的目标是自主研制一款超高分辨率、快速分析的EIT质量分析器，质量分析器正是质谱仪的关键核心零部件。　　打响国产质谱仪“突围战”　　科学发现往往离不开新工具的发明与使用。质谱仪便是最精密、最灵敏的科学分析仪器之一，可以准确测定物质的分子量以及根据碎片特征进行化合物的结构分析。　　当前，质谱测量技术以准确的定性和定量能力正备受青睐，质谱仪器则作为一种高端科研装备，广泛应用在原子能、航空、航天、半导体、微电子、激光科技、医药、生物学、食品科学、法医学、刑侦学等领域。　　比如就半导体领域而言，只有“二次离子质谱仪器”能精确检测纳米尺度上痕量杂质离子，以保证下一代半导体材料在掺杂、刻蚀、曝光等工艺制程中的良品率和一致性。在生命科学领域，质谱仪则可以实现百万种蛋白和代谢物形态的精确测定，临床诊疗质谱检测项目达400余项。　　高端科研仪器的创新、制造和应用水平，往往考验着国家科技实力和工业实力。作为“科学仪器皇冠上的明珠”，质谱仪涉及精密电子、精密机械、高真空、软件工程、自动化控制、电子离子光学等多项技术及学科，研发难度大、周期长、投入大。而中国每年对质谱仪进口额达到上百亿元，这已成为制约我国自主创新能力提升的一个重要因素。　　怀抱着质谱强国梦，海归博士周振2004年来到广州创办了中国第一家专业质谱仪器公司——禾信仪器。“质谱仪是一项对国家科学水平具有标志性意义的尖端技术，中国发展自己的质谱仪刻不容缓，这就是我创办禾信的原因。”周振说。周振带领团队逐步攻克了单颗粒气溶胶在线电离源、双极飞行时间质谱技术、真空紫外光电离源、膜进样系统等核心技术，研发出单颗粒气溶胶飞行时间质谱仪、VOCs在线监测飞行时间质谱仪、微生物鉴定质谱仪等多款产品。禾信已经成为少数掌握高分辨飞行时间质谱核心技术的企业之一。　　继续向关键核心技术发起冲击　　经过十余年的研发积累，禾信仪器已经构建了质谱研发、生产、测试、售后服务、品质控制及应用开发的整套技术创新链条，形成了从基础研究成果向产业化应用转化的技术创新能力体系，包括技术顶层设计能力、产品规划设计能力、产品创新优化能力等。　　质谱强国梦正逐渐照入现实，但是禾信仪器也面临着挑战。目前国内质谱行业上下游产业发展不成熟，精密电子、精密机械、特殊材料等上游产业的支撑能力还不足。沃特世、丹纳赫等巨头依然合计占据了全球质谱仪市场约90%的份额。　　为了在这场长跑中实现“反超”，周振带领团队培育与发展整个质谱产业链，打造质谱生态圈。在2019年于广州举办的首届粤港澳大湾区高端科学仪器产业发展论坛上，禾信联合国内科学仪器行业有关单位发起的广东粤港澳大湾区高端科学仪器产业促进会进入筹备阶段，禾信更宏大的愿景是建设粤港澳大湾区高端科学仪器创新中心。　　“我们希望创新中心十年内实现每年培育四五十家仪器制造企业，二三十家核心零部件企业。”周振说，这是一条覆盖“政产学研用金”的完整链条。　　同样是在这场论坛上，包括柴之芳院士在内的一批行业专家与禾信等产业链企业代表一同发起《关于支持高端科学仪器产业发展的建议书》，共同呼吁将高端科学仪器研发列入广东省各级政府“十四五”和中长期科技发展规划的重点发展领域，培育建立完整的高端科学仪器产业链，制定切实有效的国产科学仪器政府采购政策，支持高端科学仪器创新中心建设。　　2021年8月广东省政府印发了《广东省制造业高质量发展“十四五”规划》，明确提出，支持广州加快建设粤港澳大湾区高端科学仪器创新中心，以质谱仪器开发为主线，重点攻克相关关键核心技术。　　攻克高端科学仪器关键核心技术同样一直是柴之芳院士的梦想。在2011年和2017年，禾信曾牵头承担2项国家专项，柴之芳院士担任项目总体组、技术专家组及用户委员会专家，为项目的应用研究及管理提供技术支持。在柴之芳院士看来，没有先进的仪器和方法，是无法做出重大原创性成果的。我国的科学研究高度依赖国外仪器的情况现在虽然正在改变，但仍十分严重，已成为制约我国攀登科学顶峰的一个瓶颈。　　2021年11月，在同一梦想与追求的驱动下，柴之芳把院士专家工作站设立在禾信仪器。　　志在自主研发EIT质量分析器　　柴之芳是著名的放射化学和核分析研究专家，曾在2005年摘得国际放射分析化学和核化学领域的最高奖——乔治冯海维希奖。他将核技术、核分析和放射化学方法应用于一些交叉学科中，在若干重要元素的分子－中子活化分析、铂族元素丰度特征、金属组学、环境毒理学和纳米安全性、核试验快中子谱等方面取得了一批成果。　　质谱技术起源于同位素的发现，发展初期主要是为了满足核工业领域同位素丰度比值的测定要求，并伴随着物质组分分析技术的发展而逐渐得到完善。随着核工业的兴起和快速发展，质谱技术被应用于核燃料与核材料中杂质分析、核燃料燃耗的测定以及核反应过程中的裂变产额测定等。　　质谱测量技术的进步推动了核工业的可持续发展，核工业的发展也对质谱技术提出了更新的要求。铀资源勘查、铀矿冶、铀同位素分离、同位素应用、核医学、乏燃料后处理和长寿命核素分离嬗变、核保障监督等都离不开先进的质谱测量技术。　　柴之芳院士专家工作站的研究项目是《超高分辨率、快速分析的静电离子阱质量分析器的研制》。 质量分析器是质谱仪的核心，是决定质谱仪检测精度和准确的关键，但高端质量分析器仍被海外龙头企业垄断。而院士专家工作站要自主研发的静电离子阱质量分析器（EIT质量分析器）便是一种具备超高质量分辨率、高质量精度、高灵敏度、快速分析等特点的通用型质量分析器。　　该项目结合柴之芳院士在放射化学、核化学等研究方向中丰富的质谱应用经验，实现EIT质量分析器性能指标达到国际先进水平，并在核物理、放射化学、环境科学等领域的应用。　　基于该项目的研究成果，可以进一步开发以EIT质量分析器为核心的有超高分辨率、高精度质量分析需求领域的定制产品，也可以开发用于环境监测、食品检测、生物医疗等领域的通用在线超高分辨率大气压电离质谱产品。　　目前，院士专家工作站已完成EIT质量分析器的原理研究、质谱整机各模块的设计与制造，已达到第一阶段技术指标考核要求，申请发明专利3项，与院士团队联合发表论文1篇。　　柴之芳院士常教导学生，有志于科学研究的人要安心，要清净，要踏实。周振率领的禾信同样是一家愿意“十年磨一剑”的科技企业。如今两支有共同梦想的团队聚在一起，正在以共同步调向质谱强国梦继续进发。

随着生命科学研究的深入开展,科学界对解析复杂生物大分子结构以揭示生命现象的渴望日益增加。在各种结构生物学技术快速发展的背景下,结构质谱技术凭借其独特的优势,日益成为连接静态结构与动态功能、实现从分子到细胞的跨尺度研究的重要手段。在12月12-15日即将召开的“第十四届质谱网络会（iCMS 2023）”同期，特别新增了“结构质谱新方法”主题专场,来自全国的顶尖科学家团队将汇聚一堂,围绕氢/重氢交换质谱、化学交联质谱、原位质谱等前沿技术,报告他们在蛋白质结构生物学研究中的最新进展。本次主题会议的召开,恰逢结构质谱技术发展的重要机遇,必将推动该领域技术的重要突破及交叉创新,开启生命科学研究的新篇章。热忱欢迎质谱界的科技工作者报名参会交流、了解前沿动态、开拓合作视野。部分报告预告如下，点击报名  》》》会议主持人：中山大学 教授 李惠琳中山大学药学院教授，博士生导师。主要从事生物质谱新技术的开发及应用，侧重于（1）开发整合结构质谱技术（包括native top-down MS, HDX-MS, CX-MS等），用于药物作用分子机制及蛋白复合物结构研究；（2）Middle-down/top-down蛋白质组学新技术的开发及应用。共发表SCI收录论文40篇，其中第一作者或通讯作者15篇，主要发表在Nat. Chem.、Anal. Chem.等期刊；2014年获得American Society of Mass Spectrometry Postdoctoral Career Development Award；2019年入选“珠江人才计划”青年拔尖人才；主持国家自然科学基金项目3项。报告人：香港理工大学 教授 姚钟平报告题目：氢氘交换质谱揭示β-内酰胺酶与抑制剂相互作用的动态构象复旦大学学士及硕士,香港科技大学博士,香港理工大学应用生物及化学科技学系教授。长期从事质谱、分析化学、化学生物学、组学的交叉学科研究，主要发展和应用质谱技术解决化学、生物、食品安全、信息科学等领域的基础和应用问题，在Nature Communications, PNAS, JACS等期刊发表论文100多篇。现任香港研究资助局专家委员会委员、深圳市中药药学及分子药理学重点实验室副主任、中国化学会有机分析专业委员会委员、Frontiers in Chemistry副主编以及Analytica Chimica Acta, Rapid Communications in Mass Spectrometry,《中国质谱学报》,《分析测试学报》等期刊编委。会上,姚钟平教授将作主题为《氢氘交换质谱揭示β-内酰胺酶与抑制剂相互作用的动态构象》的报告。利用氢氘交换质谱（HDX-MS）并结合原态离子迁移质谱（Native IM-MS）以及分子动态(MD)模拟，发现不同亚型的A型β-内酰胺酶在几个主要的结构域存在显著的动态构象差异。进一步研究了A型β-内酰胺酶与抑制蛋白结合界面的动态结构变化，结果揭示了H10区域是一个可调节β-内酰胺酶抑制作用的别构部位。报告人：浙江大学 研究员 周默为报告题目：非变性质谱剖析异质性蛋白复合体结构和功能信息浙江大学首位“求是实验岗”研究员，分析化学专业，长期从事前沿生物质谱技术和仪器的开发工作。2008年本科毕业于武汉大学，2013年博士毕业于美国俄亥俄州立大学，之后两站博士后分别在美国FDA和西北太平洋国家实验室PNNL。2018年成为PNNL的研究员开展独立研究，培养多名博士后和学生。2023年加入浙江大学。截至目前共发表60余篇学术论文，代表作包括在Angewandte Chemie, Nature Communications, Analytical Chemistry等期刊的论文。现任自上而下蛋白组协会（Consortium for Top Down Proteomics）的青年委员会主席，曾担任美国质谱协会（ASMS）的出版委员会委员、短课程讲师、评审委员等学术任职，努力推动新分析测试技术的开发和跨学科领域的应用研究。本次会议中，周默为研究员将为介绍题为《非变性质谱剖析异质性蛋白复合体结构和功能信息》的报告。精准表征生物大分子的微观结构对各类生物工程、生物医药领域的研究至关重要。由于大部分质谱检测到的分子量范围有限，在分析之前生物大分子需要先被剪切为分子量更小的片段。但是剪切和碎片化的过程中会丢失一些关键的结构信息。前沿质谱技术提高了仪器的分子量上限，使非变性条件“自上而下”研究完整的生物大分子更加容易。我将以具体案例，阐述自上而下非变性质谱技术在异质性蛋白质复合体结构和功能解析中的贡献，以及与其他方法的互补性。报告人：北京大学 研究员 王冠博报告题目：生物样本中蛋白高级结构的质谱分析北京大学生物医学前沿创新中心研究员。北京大学学士，美国马萨诸塞大学博士，曾于荷兰乌特勒支大学暨荷兰蛋白组学中心从事博士后研究；曾任南京师范大学教授、博士生导师。主要从事免疫反应相关蛋白质的高级结构及相互作用研究，以生物质谱为核心工具，结合新型分析设备研发，应用于生物物理学、蛋白质药物分析等领域。长年与国际药企合作研发新型药物表征技术并应用于新药研发。获国际国内授权专利，出版《Mass Spectrometry in Biopharmaceutical Analysis》等专著、译著、合著多部。任中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业分会委员、国际学术组织Consortium for Top-Down Proteomics青委会委员。本次会议中，王冠博研究员将围绕生物样本中蛋白高级结构的质谱分析主题分享报告。生物质谱已成为蛋白质多次结构表征的重要工具。为将蛋白结构质谱技术的应用拓展至生物样本乃至临床样本中，我们针对背景基质复杂、糖基化等修饰异质性高、超大分子量颗粒结构层次多样等问题，以非变性质谱等质谱手段为核心工具开发了一系列组合策略，提供生物样本乃至临床样本中的蛋白高级结构和相互作用关系信息。报告人：中国科学院大连化学物理研究所 研究员 王方军报告题目：高能紫外激光解离-串联质谱仪器研发和应用2011年于中科院大连化物所获博士学位，师从邹汉法研究员。研究工作致力于生物大分子质谱新仪器、新方法及其在生命健康领域的应用研究，搭建了世界首台50-150 nm可调波长极紫外激光超快解离-串联质谱；提出了位点光解离碎片产率和原位化学标记效率定量表征蛋白质结构变化的两种质谱分析新原理，实现亚微克蛋白质复合物序列和结构变化单氨基酸位点分辨表征；发展了蛋白质-纳米材料界面相互作用精细结构的质谱分析新方法等。在Nat. Protoc.，J. Am. Chem. Soc.，Cell Chem. Biol.，Chem. Sci.，Anal. Chem.等期刊发表论文130余篇，他引5000余次。本次会议中，王方军研究员将分享题为《高能紫外激光解离-串联质谱仪器研发和应用》的报告。高能/真空紫外激光解离是表征生物大分子序列和动态结构的前沿结构质谱表征技术，但相关仪器和理论都亟待发展。报告人将介绍近年来自主研发的皮秒脉冲极紫外激光解离装置和蛋白质原位光化学标记仪器的原理、主要参数、与商品化质谱对比、及在蛋白质瞬态结构表征、蛋白-蛋白识别和相互作用机制分析等方面的应用情况。报告人：中国科学院大连化学物理研究所 研究员 赵群报告题目：活细胞内蛋白质原位构象和相互作用规模化解析新方法研究中国科学院大连化学物理研究所研究员，博士生导师。本科毕业于西北大学化学基地班。同年进入大连化学物理研究所攻读博士学位，师从张玉奎院士和张丽华研究员，2014年获得理学博士学位。毕业后留所工作至今，主要从事蛋白质组定性定量及相互作用分析新技术研究，共发表学术论文62篇，其中近五年以通讯/第一作者（含共同）在Nat. Commun., Angew. Chem. Int. Ed.，Anal. Chem.等SCI期刊发表论文23篇；已获20项发明专利授权。作为课题负责人承担国家重点研发计划，作为项目负责人承担国家自然科学基金面上基金等，2023年获国家自然科学基金优秀青年基金支持；2018年入选大连市科技之星，2020年入选中国科学院青年促进会会员，2023年获中国化学会菁青化学新锐奖；兼任《色谱》青年编委、中国化工学会理事、中国蛋白质组学会青年委员、中科院青促会沈阳分会委员等。本次会议中，赵群研究员将围绕题为《活细胞内蛋白质原位构象和相互作用规模化解析新方法研究》的报告。作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合体等形式行使其特定的生物学功能。不同于细胞外的离体环境，细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合体的结构和功能起着至关重要的作用。因此，实现细胞内蛋白质相互作用的精准解析对于深入研究其生物学功能，进而理解生命现象本质具有重要意义。近年来，化学交联质谱技术已逐渐成为蛋白质复合物解析的重要手段。它是利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质内/间的氨基酸以共价键连接起来，再利用质谱对交联肽段进行鉴定，进而实现蛋白质相互作用的组成、界面和位点的解析。现有化学交联技术主要用于解析体外表达纯化的或细胞裂解液中的蛋白质复合物，而在细胞内蛋白质复合物的原位构像解析方面仍处于起步阶段。 针对上述问题，我们团队发展了一系列新型高生物兼容性的可透膜多功能化学交联剂，实现了活细胞内蛋白质复合物构像的原位交联捕获；建立了多种高选择性的低丰度交联肽段的富集方法和高可信度的交联肽段鉴定方法，显著提高了原位交联信息的鉴定灵敏度、覆盖度和准确度；进而，通过靶向富集特定亚细胞器内的交联蛋白质复合物，实现了亚细胞器空间分辨的蛋白质相互作用精准解析；在上述基础上，利用基于化学交联距离约束的分子动力学技术获得了蛋白质复合物的动态系综构像，实现了活细胞微环境下蛋白质复合物组成、相互作用界面及作用位点的规模化精准解析，为规模化地揭示蛋白质复合物功能状态下的结构调控机制提供了重要的技术支撑。为了分享质谱技术及应用的最新进展，促进各相关单位的交流与合作， 仪器信息网与北美华人质谱学会（CASMS）将于2023年12月12-15日联合举办第十四届质谱网络会议（iCMS2023）  。以上仅是部分报告嘉宾的分享预告，更多精彩内容请参加会议页面：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/iCMS2023/ （点击下图去报名）》》》

来自美国Scripps研究所的国际著名蛋白质组学专家 John R. Yates 教授应邀出席了近日召开的第五届亚洲与大洋洲质谱会议暨第33届中国质谱学会学术年会，并作大会报告。Yates 教授在他的报告的前半部分中详细介绍了蛋白质组学的发展历程和未来的发展方向。 Yates教授与本网宋苑苑博士在会议间隙合影留念 鸟枪法蛋白质组学的演变 提到蛋白质组学的发展，自然绕不开质谱技术的发展。在过去的100年里，质谱技术可以说是以指数级的速度迅猛发展。这种进步可以部分归功于机械、电子和计算机工业领域的创新。但一些偶然的颠覆性突破，可能才是质谱技术的发展在质上取得飞跃的根本原因。大规模蛋白分析或是蛋白组学之所以成为可能，正是由于这些颠覆性的突破而导致的。 当质谱具备分析有机分子的能力的时候，自然而然的，分析氨基酸和小肽就成为了下一个目标。由于这些两性和极性分子缺少挥发性以及早期质谱质量范围的限制，导致分析工作十分复杂。为了解决这个问题，人们巧妙地利用衍生化的办法来使这些被改性的氨基酸和小肽气化。同时利用EI源来碎片化这些分子，以实现肽段测序。随着高分辨率、精确质量仪器的出现，精确质量被作为一个工具用于小肽的测序。而对于小肽分析能力的获得使得我们可以利用酶解和酸解的办法对蛋白进行分析。通过产生重叠的肽碎片，蛋白的序列就可能被重建。很显然，这种策略将产生非常复杂的肽段混合物，从而对当时的分离技术（GC）提出了更高的要求。那时，最大的挑战来自于如何省去繁琐的衍生化步骤而实现肽的离子化，否则科学家的分析对象只能局限于那些高丰度蛋白。 一个颠覆性的突破发生在1981年，也就是快原子轰击（FAB）的发展。这是第一次使得人们可以无需对肽（其分子量可以达到 〉1-2KDa）进行改性就可以完成很稳定的离子化。而这也对质谱仪器的质量范围提出了更高的要求。很快，这种离子源技术就被Hunt等人整合到了串联质谱上，从而为肽段测序提供了一种稳定的方法。 尽管FAB-MS和FAB-MSMS对于肽和蛋白分析而言是一个巨大的突破，但它们最主要的缺陷是很难直接与液相分离连接。1989年Fenn等人验证了电喷雾离子化（ESI）技术在蛋白分析方面的应用。除了可以电离大分子蛋白以及进行准确的质荷比测量外，这个方法的另一个突出特点就是实现了在大气压下的电离。这就简化了液相分离与质谱之间的接口。而在ESI这一颠覆性的创新出现后的几年里，FAB就渐渐被边缘化了。尽管和基质辅助激光解吸附离子化（MALDI）技术类似，围绕着这项技术的最初热情是集中在完整的蛋白质量的测量上，但是ESI的一个明显优势是通过与色谱技术（如：NanoLC）联用来完成更高效率的肽和蛋白的测序。 仪器控制语言（ICL）是由Finnigan MAT最先开发出来的一项具有颠覆性的创新技术。它具有一个初级的“智能”水平，可以实现自动数据采集、数据交互和根据实时数据对仪器操作进行控制。ICL事后被证明可以提高MSMS和其他实验的效率，从而使得大规模蛋白组学成为可能。现在它已成为所有用于蛋白质组学的质谱仪器的一项标准技术。 “鸟枪法”应用于蛋白质组学是一个很重要的里程碑。在用鸟枪法为基因组测序的时候，先将基因组DNA打断，分段测序，然后利用计算机重组在一起，从而确定一个生物的基因组序列。鸟枪法在蛋白质组研究中的应用方式与此相类似。首先将蛋白质混合物降解成肽段的混合物，再送入质谱进行分析，从而得到各肽段的质量数。为了得到更丰富的序列信息，质谱仪会选取某些肽段进行再次破碎（即二级质谱），得到更小的氨基酸序列片段。检索软件根据二级质谱信息与相应的数据库匹配，可得到肽段的确切序列，进而拼接成混合物中各蛋白质的完整序列，从而鉴定各蛋白。因此可以说，串联质谱对于“鸟枪法”在蛋白组学中的应用是至关重要的，它们使得大规模、高通量的数据分析成为可能。这对于传统的蛋白分析方法而言，是颠覆性的。 大规模数据分析技术的发展使对蛋白混合物直接分析成为可能，人们可以即时收集和破译数以千计的串联质谱谱图。由于样品处理过程的简化，使得样品损失降到最低，从而可以达到一个很高的效率和灵敏度。这一点对于那些始终暴露于新的、活性表面的低丰度蛋白分析尤为重要，因为这种暴露会导致大量的样品损失。 随着分析蛋白复合物和亚细胞区室方法的建立，下一步的目标自然就对准了开发对完整细胞分析的方法。全细胞分析是一个很复杂的工作。开发全细胞分析方法的挑战主要来自于两个方面：首先,需要开发合适的消解蛋白混合物的策略；其次，要有好的方法来分离这些复杂的肽混合物。在全蛋白组分析中，对溶液中蛋白的初始消解是一个非常关键的起始点，因为高效且完全的消解对于获得高的蛋白组覆盖度至关重要。而蛋白组分离的目的则是为了尽可能在最短的时间里提高峰容量和分离效率。要实现这一个目标其实是很困难的。如果峰宽过窄，由于质谱仪扫描速度的限制，可能导致肽峰的丢失。因此，分离效率必须要和质谱仪器的扫描速度匹配。良好的分离对于降低离子抑制以及提高动态范围是很重要的，同时，它也推动了一次分析过程的蛋白序列覆盖度的不断提高。鉴定蛋白功能 蛋白组学的另一个重要任务是鉴定在一个基因序列里被编码的蛋白的功能和作用。鸟枪蛋白组技术使人们能够通过一些新的策略，而快速获取这些信息。这些策略包括：基于“牵连犯罪” 概念的方法；根据活性将蛋白富集再鉴定；全细胞或细胞器分析等。 定性蛋白组学的最终目的是完成对所有存在蛋白的全覆盖。要达到这个目的，所有的蛋白需要被适当地消解并可溶。使用多蛋白酶消解可以提高序列覆盖度。此外，像电子转移解离（ETD）这样的新方法可以使人们有效地碎片化更大尺寸的肽段。高的序列覆盖度有益于分辨蛋白的亚型。对于复杂的混合物，例如细胞或组织裂解液，离子抑制和动态范围是两个挑战。如果能够很好地降低或消除离子抑制，那么就可以更加均一地实现肽的离子化，从而改善定性和定量分析。动态范围方面的挑战除了与离子抑制有关外，主要是和质谱仪器的检出限有关。除了离子抑制和动态范围外，第三个问题是质谱的峰容量。针对这个问题，可采用的一个变通的策略就是所谓的“数据独立采集（DIA）”，它已成为一个商品化技术。随着质谱仪器扫描速度变得越来越快，采用DIA技术进行鉴别也就变得越发可行。我们可以看到，每一代串联质谱较之其上一代都会有显著的改进，这推动着鸟枪蛋白组学向获得一个完整蛋白组发展。不过，如何判定何时算是我们获得了一个完整蛋白组依然是很困难的。此外，获得一个完整蛋白组的关键是要有一个合理的实验策略，而非采用一个耗时的“蛮力搜索”策略。生物体系的调控 可用于修饰蛋白的分子结构非常之多。这些修饰有些是具有明显的调控功能的，有些则只是改变蛋白的化学特性，而没有明显的调控功能。具有调控功能的修饰通常是可逆的，一个例外是蛋白水解过程。 质谱在很久以前就被用于对蛋白修饰的分析。对于高度规则的分子（如蛋白）进行质量测量是鉴定那些意料之外的新增分子结构的一个很直接的方法。随着基因组测序开始出现以及蛋白鉴定方法的发展，修饰鉴定的基本思路开始有所变化。Yates等人证明了可以采用数据检索方法通过串联质谱数据来鉴定翻译后修饰。快速破译修饰蛋白或肽的串联质谱图和明确修饰位点的能力使人们可以进行相应的大规模分析工作，从而更好地了解修饰的生物学机理。此外，大规模修饰位点的分析已经拓展到包括所有可被富集的修饰，这也同时促进了新的富集方法的发展。蛋白定量 稳定同位素标签（SIL）的发明使人们产生了利用质谱数据进行分子定量的想法。再者，对于体内代谢研究而言（例如：确定氨基酸的重要性），SIL也是定量质谱的一个必要要素。 早期的蛋白质组定量涉及到双向凝胶电泳的使用，但这一方法对于蛋白染色有着很高的要求。而质谱技术与双向凝胶电泳的结合使得人们可以比较容易地对凝胶上的蛋白进行分析和鉴定，从而也使双向凝胶电泳在生物学研究中得到充分利用。基于质谱技术的蛋白鉴定方法大大减少了鉴定时间和工作量，同时也可以实现蛋白鉴别和定量的结合。 为了得到更加准确的定量方法，SIL方法与质谱被结合在一起，以用于完整蛋白的分析。一些采用稳定同位素代谢标记方法或使用含标签的试剂（如稳定同位素标记的氨基酸）进行共价标记的手段随之出现。1999年，Gygi等人提出了一种不同的方法，即同位素编码的亲和标签（ICAT）。尽管ICAT方法在概念上很完美，但在实际当中还是有不少缺陷，例如：其鉴别和定量常常是基于一个多肽/蛋白分子，从而导致统计学分析很受局限。此外，由于为了富集需要使用基于抗生素蛋白的体系，从而使多肽回收也很困难。体内标记整个动物 将稳定同位素标签引入到人体和动物体内是为了用于测量分子的最终代谢产物。代谢分析通过痕量同位素标记的氨基酸和诸如同位素比率质谱技术来实现。代谢稳定同位素标记对于研究动物生物学而言是个非常有力的方法。整体动物标记使研究课题可以涉及到较之细胞系更为复杂的体系，并可以更好地反映有机体生物学机理。动物体的稳定同位素标记使人们可以使用组织或器官进行疾病研究。此外，组织和器官实际上是许多不同细胞类型的集合，换句话说是系统的系统，所以最终，研究目的会指向理解这些细胞的合集是究竟如何发挥它们的功能的上来。定量与鉴别的悖论 对于鸟枪蛋白组学而言，定量与鉴别同时进行的策略会产生一个自相矛盾的悖论。在一个全模式下对一个复杂体系中的蛋白进行鉴别，这需要快速的扫描仪器和高效的色谱以实现MSMS峰容量的最大化。仪器应当能够快速地采集一个肽段的数据，然后移向下一个新的肽段。而肽段定量则需要采集到足够多的数据点，从而实现准确测量两个形态之间的差别。“明快”对“持久”，这两个相互矛盾的需求导致了人们会对用于定量的数据质量做出一定的妥协，原因在于针对肽段鉴别的检出限往往要超过定量限。另一个问题是在定量实验中，对于“存在或不存在”的测量。为了对一个测量结果进行后续计算，大多数软件工具要求被重和轻同位素标记的肽段均要存在。而当不同标记的肽段比例超过10:1时，定量效率就会开始下滑，一些大的变化可能会被漏掉。一些非标记方法，例如光谱计数，能够更好地测定一些大的变化，但是它们的准确度不如标记方法。未来展望 为了充分了解人体生物学，科学家们必须要开始了解蛋白的亚型和修饰的功能，这也对相应的分离和测量技术提出了更高的要求。为了满足这一需要，我们需要可靠的方法来实现对完整蛋白的分子量和序列的测试。“由上而下”的质谱技术目前仍然在发展当中，我们期待着未来能有突破性的创新出现，以降低质谱的成本和复杂性，从而能使更多的人使用它。而就当下的过渡阶段而言，在过去的几年里，针对5-10 KDa的肽段的测序和表征，质谱分析器已经有了长足的进步，不过能够将蛋白切到5-10 KDa肽段的蛋白酶剪切或化学剪切方法仍需进一步发展。更高分辨率的质谱结合ETD能够使得对于这些中等尺寸的多肽的表征更加容易。 蛋白复合体代表了细胞内的一个更高阶的结构。确定蛋白亚型或被修饰后的形态如何影响蛋白复合体的功能或活性将是下一步的工作。同时，我们也期待质谱仪器能够通过科技进步和激烈的商业竞争而继续以一个较快的速度发展。为了给蛋白质组学提供更好的工具，质谱仪器的扫描速度和灵敏度将会得到进一步提升。(主编当班) Acknowledgement To help us to finish this story, Prof. Yates kindly provided instrument.com.cn with his perspective article (2013) on which the first half of his presentation at the conference is based. We herein would like to appreciate Prof. Yates for his full support to our work.

超高分子量嵌段共聚物自组装的挑战 嵌段共聚物（BCPs）是一种特殊材料，具有两个或以上化学上不同的单体单元形成不连续的高分子嵌段，转而又以共价键连接在一起。在融化相，这些材料组成嵌段之间的热力学不相容造成微相分离。这导致了周期性纳米材料（四种常见结构见图1）的形成，它们的形态可以通过改变分子组成来控制，而它们的尺寸和周期性则由分子量的变化来决定。它们的结构和组成多样性提供了获得多种表面纳米结构的可能性，这些表面纳米结构可用于大量应用，例如纳米电子学、抗反射涂层、光学活性表面化学传感器或药物输送。图1. 四种基本共聚物结构。 对于使用可见光的光电应用，需要具有横向周期性大于150nm的BCPs。因此，出现了一种子类材料，叫做超高分子量（UHMW）嵌段共聚物。长链聚合物的高度缠结特性形成了这些BCPs，但是却引起了自组装过程的其他问题。尤其是相分离的缓慢开始使得近乎所有过程都不适合工业应用。近期，一组来自都柏林大学、波尔多大学和谢菲尔德大学的研究人员提出了UHMW BCPs(800kg/mol)的超快自组装的方法，在气相溶剂退火法（SVA）阶段利用可控的溶胀动力学，从而退火时间与平常数小时或数天相比将缩短到分钟。在他们的研究工作中，证明了通过快速并控制使膜膨胀到非常高的溶剂浓度，有可能在10分钟内诱导UHMW poly(styrene)-b-poly-2-vinylpyridine (PS-b-P2VP)系统的相分离。为了得到这个结果，大量研究了干膜厚度、聚合物膜内溶剂浓度、溶胀时间和速率对BCP膜的形态和结构演化的影响。GISAXS测试揭示了溶剂浓度对UHMW嵌段共聚物结构的影响 具有高分子量体系的长聚合物链在干膜中显示有较高的链缠结。已知UHMW BCP的聚合物流动性是高度依赖于溶胀比的，那在SVA过程中通过向BCP膜中加入相对中性的溶剂是有可能解决这一问题的。这样溶剂的分子将在两个嵌段之间产生屏蔽作用，从而减少聚合物之间的相互作用。在上述研究中，选用了氯仿和四氢呋喃（THF）的混合物作为退火溶剂。 随后用掠入射小角X射线散射（GISAXS）研究166nm的BCP膜在宏观区域上随溶剂浓度变化的形态演变。与透射模式下的SAXS实验相比，掠入射模式（X射线光束在样品表面反射）转变成了表面敏感探测技术，在大表面区域上分析材料的结构且无需额外的样品制备。如图1所观察到的，通过GISAXS测试随着溶剂浓度的增加，内部结构发生了明显的变化。铸膜样品只出现微弱的散射点，表明表面主要是无序的胶束结构。随着溶剂浓度的增加，从GISAXS散射图谱上明显看出，ϕs~0.80以下，BCP链仍处于缠结状态而无法自组装成界限清晰的微区。只有在浓度等于或高于0.8时，有序垂直层状形态才开始逐步形成。使用散射峰的位置，计算结构在ϕs = 0.83和ϕs = 0.86的平面域间距分别是（~ 184 nm）和（~ 191 nm）,而一旦溶剂浓度的值达到0.88结构会失序。图2.（a-h）二维GISAXS散射数据。8个图中显示PS-B-P2VP膜的形态随退火溶剂浓度ϕs的变化而变化。（i）在每个样品的Yoneda位置的1DGISAXS图像。强度分布显示为一阶散射峰，二阶散射峰分别用红色和蓝色表示为1和2。 铸膜（在没有溶剂的情况下测试）出现一个弱散射峰，用绿色表示为m。 通过AFM分析对这些值进行了进一步的证实，并且典型的FIB/SEM实验结果证明层状结构在整个膜上的延伸。为了证明BPC结构的传输能力，自组装膜也被用作模板制备金属氧化物纳米结构。这些材料也被进一步用作硬膜，来生产统一的高宽比硅纳米壁结构（高500nm，间距190nm）。 这一研究工作为超高分子量嵌段共聚物在工业适用的时间内通过高精度气相退火进行自组装的可行性奠定了基础。在大约10分钟的时间内实现了相分离，产生了间距超过190nm的层状特征。在整个过程中，GISAXS测量与其他探测技术共同用于控制过程的效率并评估不同参数的影响。

ADC药物作为一类新兴的生物治疗药，其结构更为复杂，质量表征挑战也随之升级。在ADC的定量和定性表征中，质谱凭借其独特的能力发挥着不可或缺的作用，可以从完整分子水平、亚基水平、肽段水平和小分子分析等方面对ADC进行多维度的表征（如图1所示）。图1. 质谱多维度表征ADC的方法[1]ADC质谱表征策略√ 丰富的项目经验夏尔巴生物在ADC项目开发方面积累了丰富的经验，涵盖半胱氨酸随机偶联、糖基化定点偶联、半胱氨酸定点偶联、双抗ADC以及双载荷ADC等多种类型。目前，已有5个项目进入临床阶段、多个项目处于临床前阶段。√ 高效的ADC质谱表征流程夏尔巴生物凭借深厚的表征经验和先进的分析平台，成功打造出一套全面、高效的ADC质谱表征策略，可对不同偶联方式的ADC药物进行全方位表征，涵盖分子量、偶联位点、偶联位点占有率、偶联杂质、二硫键和翻译后修饰等，确保分析的全面性和深入性。这套质谱表征流程有效克服了在DAR（药物抗体比）分析、复杂肽段偶联位点的质谱表征研究方面的难题，实现了在完整分子水平的精准分析，充分为产品质量保驾护航。本文聚焦于药物抗体比（DAR, drug-to-antibody ratio）和偶联位点这两个ADC药物的关键质量属性，深入介绍夏尔巴生物的质谱表征方法。药物抗体比（DAR, drug-to-antibody ratio）的质谱表征ADC常用的偶联方式一般分为随机偶联和定点偶联，随机偶联包括赖氨酸随机偶联和半胱氨酸随机偶联；定点偶联方式较多，包括引入反应性半胱氨酸定点偶联、引入非天然氨基酸定点偶联、糖基化偶联、抗体间二硫键桥接偶联、其他酶促反应偶联等。半胱氨酸随机偶联过程如图2所示，由于半胱氨酸随机偶联ADC的轻链和重链以及重链和重链之间的二硫键被破坏，RP-LC/MS方法流动相中的有机溶剂会破坏非共价连接的立体空间结构，无法在完整分子水平分析DAR值和载荷分布情况。图2. 半胱氨酸随机偶联ADC偶联过程和结构展示[2] 而非变性质谱法（Native MS）由于其自身的特性，尤其是体积排阻色谱（Size exclusion chromatography, SEC）和质谱联用，很好的弥补了这种缺陷。SEC-MS法通常选择与质谱兼容的乙酸铵作为流动相体系，液相分离过程中无有机相参与，对柱温要求较低，分子的非共价结构得以保留，从而可以在完整分子水平进行DAR值分析。疏水作用色谱（HIC）通常以含盐的水溶液作为流动相，检测过程中不会引入有机相，也适用于在完整分子水平进行DAR值分析，通常被作为半胱氨酸偶联ADC的DAR值检测放行方法。但是HIC法本身不具备DAR值组分鉴定的能力，所以在HIC方法开发过程中，需要收集不同的组分，借助Native MS鉴定每个峰的组成。HIC法DAR值检测典型图谱见图3A，相应的Native-MS鉴定结果如图3B所示。图3. HIC和Native MS检测DAR值结果[2]定点偶联ADC在偶联过程中一般不会打开分子的链间二硫键，所以传统的RP-LC/MS法可以进行完整水平的DAR值分析。经典的糖定点偶联过程如图4所示，偶联过程中链间的二硫键得以保留，RP-LC/MS法以有机溶剂和水作为流动相，经过反相分离后进行质谱检测，对质谱结果解卷积分析后即可得到平均DAR值和载荷分布。图4. 糖定点偶联ADC的偶联过程[3]双载荷ADC（dual-payload）是在抗体上偶联两种不同的载荷，其自身异质性较强，常规分析方法很难实现两种载荷的DAR值检测，质谱可以根据带有不同载荷分子的分子量差异进行总DAR值以及两种不同载荷DAR值（DAR-A和DAR-B）的表征研究（图5）。图5. 双载荷ADC质谱表征[4]质谱分析DAR相较于常规分析方法的另一个优势在于可以在完整分子和亚基水平分别评估，如图6所示，对完整分子进行DTT还原后，可以检出轻链和重链上分别偶联的linker-payload数量，加权计算得出平均DAR值，与完整分子量检测结果交叉验证，可以得到更准确的ADC结构信息。图6. 质谱在完整分子和亚基水平DAR值检测结果ADC偶联位点的质谱表征研究肽图分析（LC-MS/MS法）是表征大分子药物的强大工具，将ADC样品酶解后，利用LC-MS/MS分析，从而确证氨基酸序列、翻译后修饰、二硫键连接形式，通过一级和二级质谱信号对肽段序列和linker-payload特征碎片进行确认即可获得偶联位点信息。图7. 肽图法质谱分析流程对于含有多个偶联位点的肽段，偶联位点的鉴定会更复杂，如图8所示，铰链区酶切肽段含有两个半胱氨酸偶联位点（~CPPC~），肽段有可能偶联一个或者两个linker-payload，这时就需要通过一级质谱判断肽段偶联的linker-payload数量，结合二级质谱信息判断偶联发生位点。图8. 偶联一个和两个linker-payload肽段质谱鉴定结果综上所述，夏尔巴生物的质谱分析平台具备生物大分子的全面表征分析能力，可以实现抗体、融合蛋白以及随机/定点不同偶联方式的不同分子形式ADC药物的全面表征研究和分析方法开发，可以根据需求为客户提供Top-down、Middle-down、Bottom up等基于质谱的、全面的生物大分子结构表征研究和质量控制策略，助力客户产品提质增效。参考文献1) Zhu X, Huo S, Xue C, et al. Current LC-MS-based strategies for characterization and quantification of antibody-drug conjugates[J]. Journal of pharmaceutical analysis, 2020, 10(3): 209-220.2) Valliere-Douglass JF, Hengel SM, Pan LY. Approaches to Interchain Cysteine-Linked ADC Characterization by Mass Spectrometry. Mol Pharm. 2015 Jun 1 12(6):1774-83.3) van Geel R, Wijdeven MA, Heesbeen R, Verkade JM, Wasiel AA, van Berkel SS, van Delft FL. Chemoenzymatic Conjugation of Toxic Payloads to the Globally Conserved N-Glycan of Native mAbs Provides Homogeneous and Highly Efficacious Antibody-Drug Conjugates. Bioconjug Chem. 2015 Nov 18 26(11):2233-42.4) Yamazaki C M , Yamaguchi A , Anami Y ,et al.Antibody-drug conjugates with dual payloads for combating breast tumor heterogeneity and drug resistance[J].Nature Communications[2024-03-05].关于夏尔巴生物夏尔巴生物专注于提供抗体、融合蛋白、ADC（抗体偶联药物）等药物的开发和商业化生产，致力于“帮助优质客户开发出全球老百姓用得起的高质量生物药”。公司已组建了一支具有丰富经验的国际化人才团队，并助力完成了40多个项目的申报注册以及10个产品的国内外上市，满足了250多万病人的用药需求。目前，夏尔巴生物在苏州已有60,000L的总产能，生产线的建设标准同时符合NMPA、FDA和EMA等GMP要求。同时，夏尔巴生物在杭州基地还有172,000L产能在建，其中4条20,000L的生物反应罐已建成。夏尔巴生物致力于为优质客户提供优质的技术服务，可提供行业领先的一站式解决方案，协助客户加速将创新成果实现商业化，惠及更多患者。“利他以恒，匠心致远”，以分享、帮助、成就、共赢的理念，帮助优质客户开发出全球老百姓用得起的高质量生物药，是夏尔巴生物的理想和目标。