卢立康唑

利用eXtended Performance（XP）色谱柱改进美国药典（USP）噻康唑有机杂质分析方法 Kenneth D.Berthelette、Mia Summers和Kenneth J.Fountain 沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德 方案优势 ■ 使用XP色谱柱改进耗时的USP美国药典有机杂质分析方法，实现更快速的分析并减少溶剂的使用量，同时仍符合美国药典章指南的规定。 ■ 将样品运行时间缩短80%，从而提高了生产能力。 ■ 将溶剂用量减少90%，降低了运行成本。 沃特世提供的解决方案 ACQUITY UPLC® H-Class系统 Alliance® HPLC系统 XSelect&trade CSH&trade C18色谱柱 Empower® 3软件 eXtended Performance [XP] 2.5 &mu m色谱柱 TruView&trade LCMS认证最大回收样品瓶 关键词 美国药典方法、噻康唑、ACQUITY UPLC色谱柱计算器、沃特世反相色谱柱选择表、仿制药 引言 全世界的制药企业在日常工作中都需要对仿制药中的有机杂质进行分析。使用较为陈旧的仪器和色谱柱技术进行有机杂质分析，因为需要长时间使用大量的溶剂，所以既耗时又费钱。然而通过使用显著改进的仪器和色谱柱技术有机杂质分析会变得更高效。2.5&mu m 粒径的eXtended Performance（XP）色谱柱设计用于高效液相色谱和超高效液相色谱。该色谱柱是改进美国药典方法的理想选择，因为其能够使色谱分析工作者实现更小粒径和低扩散系统带来的利益，同时能够符合美国药典章色谱分析指南的规定。章列出了允许的方法变化幅度。 噻康唑是一种用于治疗酵母菌感染的咪唑类抗真菌化合物。被转换的方法是噻康唑有机杂质的分析方法2。有机杂质分析方法用于测定样品中是否存在杂质及其含量。该XP色谱柱方法是从最初在HPLC系统上的色谱柱规模的美国药典方法缩放至HPLC和UPLC仪器上的。在HPLC仪器上使用XP色谱柱对现行美国药典方法进行改进能够缩短运行时间，从而提高了常规分析实验室的样品通量。而在UPLC系统上使用XP色谱柱则可以比HPLC进一步缩短运行时间并减少溶剂的使用，从而节约了总成本。 实验条件 Alliance 2695 HPLC色谱条件 流动相： 44:40:28乙腈/甲醇/水加2 mL氢氧化铵 分离模式： 等度洗脱 检测波长： 219 nm 色谱柱（L1）： XSelect CSH C18，4.6 x 250 mm，5 &mu m， 部件号：186005291；XSelect CSH C18 XP，4.6 x 150 mm，2.5 &mu m， 部件号：186006729；XSelect CSH C18 XP，4.6 x 100 mm，2.5 &mu m， 部件号：186006111 柱温： 25 ℃ 洗针液： 95:5乙腈/水 样品清洗液： 95:5水/乙腈 密封垫冲洗液： 50:50甲醇/水 流速： 根据方法调整 进样量： 根据方法调整 ACQUITY UPLC H-Class色谱条件 流动相： 44:40:28 乙腈/甲醇/水加2 mL氢氧化铵 分离模式： 等度洗脱 检测波长： 219 nm 色谱柱（L1）： XSelect CSH C18 XP，4.6 x 150 mm，2.5 &mu m， 部件号：186006729；XSelect CSH C18 XP，4.6 x 100 mm，2.5 &mu m， 部件号：186006111；XSelect CSH C18 XP，2.1 x 150 mm，2.5 &mu m， 部件号：186006727 柱温： 25℃ 洗针液： 95:5乙腈/水 样品清洗液： 95:5水/乙腈 密封垫冲洗液： 50:50甲醇/水 流速： 根据方法调整 进样量： 根据方法调整 数据管理： Empower 3软件 样品描述 用100%的甲醇将噻康唑样品制备成表1所述的浓度。将样品转移至一个进样用的TruView最大回收样品瓶中（部件号：186005662CV）。 结果与讨论 全世界制药企业都需要对常规方法制备的噻康唑进行日常分析。本应用纪要使用美国药典专论中规定的有机杂质分析方法，在几种不同规格的色谱柱上对噻康唑及其有关物质A、B、C的分离进行了比较。因为噻康唑许多杂质缺乏实际可用性，所以将噻康唑有关物质A、B、C用作低浓度杂质标准品。美国药典所列的有机杂质分析方法用于分析复杂的样品处方。样品中多种成分的有效分离通常需要使用更长的色谱柱。使用较大填料粒径（&ge 3.5 &mu m）的长色谱柱会使运行时间加长，溶剂使用量增大。例如，最初的美国药典中的噻康唑有机杂质分析需要使用4.6 x 250 mm，5 &mu m的色谱柱，分离时间长达30分钟，每分析一个样品需要耗费30 mL溶剂。但是，使用2.5&mu m粒径的eXtended Performance（XP）色谱柱，可以在缩短运行时间的同时仍然符合考核的要求。由于运行时间缩短，样品通量得到了提高，每次分析所需溶剂减少，从而降低了总成本。现行的美国药典章色谱分析指南规定了允许的方法变化幅度。这些允许的变化包括± 70%的色谱柱长度变化，-50%的粒径变化，± 50%的流速变化。1美国药典要求有关物质B和C之间的分离度要达到1.5，本应用纪要证明:在不同的色谱柱和不同的色谱系统之间进行的方法转换完全满足对这两个难分离化合物的苛刻要求。 在HPLC仪器上使用XP色谱柱进行有机杂质分析 噻康唑的有机杂质分析方法需要使用L1专用色谱柱，为该分离而列出的色谱柱是LiChrosorb RP-182。参照沃特世反相液相色谱柱选择表，本文选用更先进的XSelect CSH C18固定相色谱柱。之所以选择XSelect CSH C18色谱柱是由于其与所列出的色谱柱相类似，并且能提供适用于HPLC UPLC仪器的各种规格和粒径。本文首先使用一根XSelect CSH C18，4.6x250mm，5&mu m色谱柱在Alliance HPLC系统上运行美国药典方法，流速1.0mL/min。如表2所示，本次分离符合考核标准。本次分离的总运行时间为30分钟，在连续批量分析样品时，将面临着时间和成本管理的双重挑战。如果使用原始的美国药典方法， 8小时的一个工作日仅能分析16个样品，要消耗480mL溶剂。通过使用XP色谱柱，在同样的8小时工作日内可分析80个样品，且仅需使用240mL溶剂，显著地提高了样品通量并降低了运行成本。 在不同的系统上使用2.5&mu m XP色谱柱改进的标准方法具有通用性，同时仍符合美国药典章指南的要求，如图1所示。XP色谱柱是一款2.5-&mu m颗粒的HPLC和UPLC色谱柱，经高效填装并能够承受UHPLC系统的高压，使XP色谱柱在HPLC和UPLC仪器上均能使用。 本纪要的标准方法首先从最初的4.6 x 250 mm，5 &mu m色谱柱转换至4.6 x 150 mm，2.5 &mu mXP色谱柱，用以说明使用更小粒径的色谱柱可以缩短运行时间。使用更小的粒径还可以提高分离能力，用色谱柱长度与粒径的比值（L/dp）即可预测。在本例中，L/dp从50,000（初始条件）提高到60,000（4.6 x 150 mm XP色谱柱）。根据ACQUITY UPLC色谱柱计算器的计算，用于该XP色谱柱的最佳流速为2.0 mL/min3。但是，这个流速超出了美国药典章指南规定的变化范围。故采用1.0 mL/min的流速以保证符合美国药典指南的规定，同时也适应HPLC系统反压的限制。噻康唑及其有关物质在原始色谱柱上与在4.6 x 150 mm XP色谱柱上的分离进行了对比，如图2A-B所示。4.6 x 150 mm XP色谱柱将运行时间缩短43%，分离度提高5%，如图2所示。 接着使用一根更短的4.6 x 100 mm，2.5 &mu m XP色谱柱进行分离，用以说明在实现更快速分离的同时，仍保持着合格的分离度。运行时间的缩短对于有机杂质分析尤其有用归因于附加的分离复杂性，这些方法一般比其他方法具有较长的运行时间。需要注意的一个重要问题是，不一定任何时候都会选用具有较低分离能力（L/dp 40,000）的较短色谱柱。例如在辅料和杂质洗脱时间很接近的情况下可能需要保持原始的分离能力。图2C显示了使用4.6 x 100 mm，2.5&mu m XP色谱柱进行分离时，与初始条件相比，运行时间缩短57%，并且仍然符合所有的考核标准，如图2所示。在这种情况下，L/dp从50,000（初始条件）降低至40,000导致有关物质B与C之间的分离度降低15%；但分离度仍然符合要求，这取决于原始分离的复杂程度。 在UPLC仪器上使用XP色谱柱进行有机杂质分析 如图1所示，通过同时使用XP色谱柱和ACQUITY UPLC色谱柱计算器，该方法可以从Alliance HPLC系统转换至ACQUITY UPLC H-Class系统上。更新的仪器，例如ACQUITY UPLC H-Class系统，可以实现更快速、更高效的分离，归因于其高反压耐受能力、进样之间更快速的平衡以及显著降低的系统体积和扩散。为了对比HPLC和UPLC系统之间的分离能力，将图2B中所示的使用4.6 x 150 mm，2.5 &mu m颗粒的 XP色谱柱进行的有机杂质分析方法在ACQUITY UPLC H-Class系统上重新运行，如图3A所示。仅仪器本身的变化&mdash &mdash 从HPLC变到UPLC，会使B与C色谱峰之间的分离度增加5%，使运行时间缩短12%，如表2和表3所示。分离度的增大归因于UPLC系统的低系统体积和低扩散，因为这两个属性都可以改善峰形。 为进一步说明UPLC仪器的优点，如图3B所示在UPLC系统上使用4.6 x 100 mm XP色谱柱进行分离。此分离操作使B与C色谱峰之间的分离度从使用HPLC系统时的1.6（参见表2）提高到使用UPLC系统时的1.8（参见表3）。在UPLC系统上使用4.6 x 100 mm XP色谱柱，得到与在HPLC系统上用原始方法分离相同的分离度，但是比原始方法快57%。 最后，将标准方法转换至一根2.1 x 150 mm 2.5 &mu m XP色谱柱上。这根色谱柱的测试结果说明通过减小色谱柱的内径，在保留相同分离度的同时，还能进一步缩短运行时间，并且大大减少溶剂用量。根据ACQUITY UPLC色谱柱计算器的计算，适合这根色谱柱的流速为0.42 mL/min。但这个流速超出了美国药典章指南的要求，因此实验使用符合规定的0.5 mL/min流速。分析得到的色谱图（如图3C所示）显示，如表3所示与原始条件相比运行时间缩短80%，而适用性要求仍很容易达到。此外，仅仅通过减小色谱柱的内径分析就比使用4.6 x 150 mm XP色谱柱快63%，如图3A所示。最后，通过使用2.1 x 150 mm XP色谱柱，与原始的标准方法相比，溶剂用量减少90%，显著地节约了成本。当对流速进行调整，以保持在美国药典章指南规定的范围内时，B和C色谱峰的分离度从1.9下降至1.8，但仍符合考核标准。 结论 在进行既耗时又费钱的有机杂质分析时，在现有HPLC系统上使用eXtended Performance [XP] 2.5 &mu m色谱柱，与原始的美国药典方法相比，可以缩短运行时间和减少溶剂用量57%。通过将XP色谱柱与UPLC仪器相结合，运行时间可减少80%，溶剂用量可减少90%。既能在HPLC仪器上运行又能在UPLC仪器上运行的XP色谱柱的实用性可以用于在遵循现行美国药典章指南的同时，改进美国药典方法。在常规分析实验室中，使用经更小粒径色谱柱改进的美国药典方法，可以节约大量的时间和运行成本。 参考文献 1. USP General Chapter , USP35-NF30, 258. The United States Pharmacopeial Convention, official from August 1, 2012. 2. USP Monograph. Tioconazole, USP35-NF30, 4875. The United States Pharmacopeial Convention, official from August 1, 2012. 3. Jones MD, Alden P, Fountain KJ, Aubin A. Implementation of Methods Translation between Liquid Chromatography Instrumentation. Waters Application Note 720003721en. 2010 Sept.

据报道“全球每年消耗的抗生素总量90％用在食源动物身上，致使细菌耐药性和药物残留等问题日益突出。”本文以硝基咪唑类、硝基呋喃类、硝基喹啉类为例，针对饲料中兽残抗生素检测提供了高效智能前处理解决方案。本方案适用于饲料中异丙硝唑、甲硝唑、替硝唑、塞克硝唑、卡硝唑、奥硝唑、地美硝唑、罗硝唑8种硝基咪唑类药物，呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林4种硝基呋喃类药物和卡巴氧、喹乙醇、乙酰甲喹、喹烯酮4种喹啉类药物的前处理方案。本方案适用于畜禽配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料和精料补充料中硝基咪唑类、硝基呋喃类和喹啉类药物的前处理方案。本标准的检出限为0.05 mg/kg，定量限为0.10 mg/kg。实验步骤：一、提取称取试样2 g(精确至.01 g)于50 mL离心管中，准确加入200 mL提取液（甲醇V:乙腈V:超纯水V，3:3:4）用MultiVortex多样品涡旋混合器混合后，水浴超声提取10 min，振荡15 min。8000 rpm离心5 min，取1.00 mL上清液于40℃下用FV64全自动智能氮吹仪吹至近干，残余物用0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液5.0 mL溶解，超声10 min，备用。二、净化将HLB固相萃取柱固定于iSPE-864全自动智能固相萃取仪上，固相萃取条件如下：将洗脱液用FV64全自动智能氮吹仪吹干。准确加入60%乙腈溶液1.00 mL溶解残余物，使用MultiVortex多样品涡旋混合器混匀后，超声10 min，过0.22 μm微孔滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。注:操作过程中注意避光,试样上机前酌情稀释,避免造成仪器污染。所用Detelogy智能前处理设备建议选型● 高转速搭载3mm圆周振幅，保证每个样品充分混合● 外观灵巧轻便，主机低重心设计，运行噪声低，进阶实现稳健高转速● 5寸高清触屏，支持手动自动双模式，中英文界面自由切换● 64位高通量，氮吹针自动下降● 支持全自动延时氮吹和延时增压● 10.1寸高清触屏控制，可存方法● 8通道，批量处理64位样品● 自动完成活化、上样、淋洗、氮吹、洗脱等固相萃取全流程

p 　　“这一个项目我做了7年，这辈子能做几个这样的项目?它就像我的孩子一样，对于自己的孩子，哪怕再难、再苦我都要坚持。” /p p 　　“做科研就不能怕走弯路，我跌跌撞撞地走了这么多年，只是为了基因测序技术的国产化，哪怕没有资金和支持，我也要坚持做下去，因为这是我的‘孩子’。” /p p 　　说这话的人是中国科学院北京基因组研究所技术研发中心常务副主任、副研究员任鲁风。多年来，他不断地调整着研究方向，不断地学习不同学科的知识，为的就是研制出中国人自己的基因测序仪。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2015810545267550.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201508/insimg/14b6e2f4-ff1d-4525-b4b3-9fa5b7c70aab.jpg" / /p p style=" text-align: center " 任鲁风 /p p 　 strong 　初试牛刀 /strong /p p 　　22岁，毕业于南开大学生物系的任鲁风进入天津市某医院从事遗传性耳聋基因方面的基础研究，一个偶然的机会，他与基因结下了不解之缘。 /p p 　　在那里，他第一次接触到了“基因芯片”，这种在当时还很“时髦”的检测技术，就像给他“注射了一针兴奋剂”。当他得知北京一家公司正在建立基因芯片技术团队时，便毫不犹豫地放弃了在医院刚刚得到的晋升职位和稳定的工作，来到北京寻找他的梦想。 /p p 　　他的梦想与努力没有被辜负，经过多年心血与集体攻关，2003年由任鲁风主要完成的全球第一款SARS病毒全基因组芯片问世，并荣获了首都“抗击SARS集体一等功”。 /p p 　　“当时的基因芯片应用涉及了人类、动物、植物及病毒等方面，主要偏重于在基础研究中的应用，其中针对病毒进行鉴别检测的基因芯片是应用研究中主要的方向。”任鲁风向记者介绍说。 /p p 　　在他看来，在此之前，没有其他分子检测技术能够实现检测靶标的通量概念，基因芯片是第一种可以大规模并行化进行基因靶点检测的实用技术，“如果能够根据其特点应用于恰当的实践领域，将有其广阔的市场前景”。 /p p 　　可是好景不长，SARS过后，和国内众多新兴产业的轨迹一样，基因芯片产业进入了一个波谷期，公司内部业务调整，使得他不得不再次转行，寻找突破口。 /p p 　　2004年，他所在的部门裁撤，开始转岗从事基因治疗新药的研发和临床前实验研究工作。“不安分”的他总觉得还是没有找到自己的“归宿”，他始终坚信，没有应用前景的研究只能锁在象牙塔中，直到他进入中科院基因组所。 /p p 　　碰撞出的基因测序仪 /p p 　　2008年，中科院北京基因组所时任副所长于军研究员，也是任鲁风的博士生导师，针对生命科学仪器的发展提出了模块化DNA分析系统的概念，即对于DNA进行不同层次的分析时，可以是少数几种分子生物学核心技术的一种或多种的集成。此后，在与中科院半导体所的科研交流中，双方一拍即合，提出了研发当时技术复杂度最高，同时也是未来预期应用最广泛的第二代高通量基因测序仪的思路。 /p p 　　这个多学科碰撞出的火花，让当时刚刚进入测序技术研究领域的任鲁风激动不已。“进入研究组后，我才发现，原来我对基因组学、基因测序的了解是那么的浅显。”任鲁风说。 /p p 　　研究小组提出用不同学科领域的技术解决生命科学领域应用的问题。经过生物学和物理学两个看似完全不相干的团队历时半年的相互交流学习，任鲁风和同事们了解了半导体材料和相关的光电技术，也向他们普及了基因检测的相关知识。最终，联合研究组确定了研发基因测序仪所采取的技术路线。 /p p strong 　　再难也要做下去 /strong /p p 　　“2008年的时候，当时买一台类似的测序仪要花400万元，中科院给我们两年半时间，用406万元经费开发出一台测序仪，说实话当时我也觉得挺难的。”回忆起当年情景，任鲁风感慨万千。 /p p 　　“第一年走的弯路非常多，在摸索技术路线时，我们发现了很多问题。到2009年9月，项目要进行中期汇报时，我们才刚刚在仪器研发和技术开发方面入了门。当时非常焦虑，但是再难也要走下去。”任鲁风说。 /p p 　　从2009年9月到2011年4月验收结题，实际上他们只花了一年半时间便完成了这台基因测序仪原理样机的研发。个中曲折，已不能尽数。 /p p 　　功夫不负有心人。2011年3月，第一台基因测序仪原理样机搭建完成并功能实现，同年4月通过了中科院专家组的现场验收。 /p p 　　基因测序仪原理样机的研发成功不仅仅给了研究组信心，同样也为基因组所的学术方向结构完整性提供了有力的支持。在基因组所的“一三五”发展规划中，测序技术研发占据了非常重要的地位。任鲁风在当年博士毕业留所，自信满满地带领新成立的DNA测序技术研究开发中心团队进入下一个攻坚阶段——工程样机的开发工作，但却遇到了极大的困难，差点导致夭折。 /p p 　　工程样机的开发工作涉及到对仪器系统的全面重新设计，对各个部件都需要从工程化角度评估和测试，需要远远高于原理样机研发时所需要的经费。因为种种原因，这个项目虽然得到了研究所最大程度的支持，但一两百万元的经费对于这项工程来说实在是杯水车薪，争取国家项目资助又因为种种原因未获成功，开发工作一度陷入断粮状况。“最少的时候直接参与开发工作的只剩两三个人，我不得不争取一些小的项目咬牙支撑这个项目走下去。”任鲁风回忆起工程样机开发阶段的艰难也会有些唏嘘。 /p p 　　峰回路转，2013年10月，项目组与紫鑫药业达成协议，共建中科紫鑫公司实现基因测序仪项目产业化。科研项目的产业化转化所带来的资金和发展契机让任鲁风看到了希望。 /p p 　　“直到2015年1月，中科紫鑫已经完成了20多台机器，准备投放到遴选出的试用用户手里，让他们做免费的试用，我需要业内的评价。”任鲁风说。 /p p 　　国产自主知识产权的基因测序技术对国家的意义、国家在国际上的战略地位以及对精准医学的发展意义重大。任鲁风告诉记者，“我们的机器上市之后，国外的垄断企业一定会大幅度降价，对我国整体基因产业发展也会有更多的推进作用。” /p p 　　“这一个项目我做了7年，这辈子能做几个这样的项目?它就像我的孩子一样，对于自己的孩子，哪怕再难、再苦我都要坚持。”任鲁风说。 /p