呋喃戊糖基

点评 | 朱锦芳（NIH）2022年5月23日，上海交通大学基础医学院生化与分子细胞生物学系童雪梅教授课题组及其合作团队，上海市免疫学研究所李斌研究员课题组和复旦大学附属华山医院/脑科学转化研究院杨辉研究员，在Nature Metabolism杂志在线发表题为 Non-oxidative pentose phosphate pathway controls regulatory T cell function by integrating metabolism and epigenetics 的研究论文，揭示非氧化磷酸戊糖途径（非氧化PPP）对调节性T（Treg）细胞代谢模式及细胞功能的调控机制。Nature Metabolism同期发表伦敦帝国理工学院Margarita Dominguez-Villar博士为该研究撰写的News & Views特评，认为该文章发现非氧化PPP在Treg细胞活化和功能调控中的中心地位（a central regulator）。表达特征转录因子Foxp3的Treg细胞是一类具有免疫抑制功能的CD4+ T细胞亚群，维持机体免疫系统稳态，防止免疫过激诱发自身免疫病。已知葡萄糖酵解、脂肪酸氧化和氨基酸分解代谢等都参与 Treg 细胞功能调控。PPP是一条不产生ATP的葡萄糖分解代谢途径，由生成NADPH的氧化PPP和产生5-磷酸核糖的非氧化PPP组成。非氧化PPP包括4个代谢酶催化的5步可逆反应，可以通过改变代谢物流向来满足细胞的功能需求。非氧化PPP是否参与免疫细胞如Treg细胞的代谢与功能调控尚不清楚。转酮醇酶TKT是非氧化PPP中催化两步可逆反应的代谢酶。童雪梅团队已发现TKT在肝脏、脂肪和肠道中调控糖脂代谢平衡的重要作用（Li M et al, Cancer Research, 2019 Tian N et al, Diabetes, 2020 Tian N et al, Cell Death & Disease, 2021）。在本研究中，研究人员通过构建Treg细胞特异性敲除TKT的小鼠模型，深入探究非氧化PPP是否和如何调控Treg细胞代谢及功能。他们研究发现，Treg细胞特异性敲除TKT的小鼠出生3周后发生严重自身免疫性疾病，并且在断奶之后相继死亡，其表型与缺失Foxp3基因的小鼠相似。进一步研究发现，敲除TKT在不影响Treg数目和转录因子Foxp3 水平的情况下，阻断Treg细胞的免疫抑制功能。为了排除炎症反应的影响，研究者根据Foxp3基因位于X染色体和雌鼠X染色体选择性失活的特点，构建了在同一只鼠中既有TKT缺失又有TKT正常表达的Treg细胞嵌合小鼠模型。该小鼠Treg细胞的转录组和表观遗传组分析表明，TKT缺失导致Treg细胞中87.9%的差异表达基因被下调，染色质可及性降低。这些被下调的基因几乎全部为效应性Treg特征性基因，表明非氧化PPP对调控Treg细胞免疫抑制功能是必需的。研究者进一步发现，TKT缺失导致Treg 细胞NADPH 减少和氧化应激增加，葡萄糖进入线粒体氧化减少，脂肪酸氧化增加，氨基酸分解代谢显著增强，分解代谢重构使线粒体功能受损。同时，被氧化应激和线粒体损伤诱发的还原性TCA循环使α-酮戊二酸/琥珀酸及α-酮戊二酸/富马酸比率降低，DNA甲基化增加，抑制Treg细胞特征性功能基因表达，导致其免疫抑制性功能丧失。文章也发现非氧化PPP中的另外一个代谢酶——转醛醇酶（TAL），对维持效应性Treg特征性功能基因表达也不可或缺。此外，在自身免疫性病人外周血 Treg细胞中，TKT水平显著降低。综上所述，此研究首次揭示非氧化PPP对于调控Treg细胞中糖、脂和蛋白质分解代谢稳态、维持代谢物依赖的表观遗传修饰和功能基因表达有关键作用，即非氧化PPP可以通过整合三大营养物质代谢和表观遗传修饰控制Treg细胞功能。这项研究将为通过调控Treg功能防治自身免疫性疾病和其它免疫相关疾病提供新策略新手段。非氧化 PPP 通过整合代谢组和表观遗传组调控Treg细胞功能上海交通大学医学院博士生刘琪、阿拉巴马大学伯明翰分校博士生朱方明和上海市免疫学研究所博士生刘鑫男是该研究论文的共同第一作者。此项研究得到复旦大学生物医学研究院叶丹研究员、海军军医大学附属长征医院风湿免疫科徐沪济主任、上海交通大学附属仁济医院沈南主任、上海交通大学基础医学院徐天乐教授、清华大学药学院胡泽平研究员、阿拉巴马大学伯明翰分校胡晖教授等合作实验室的大力协助。通讯作者为童雪梅教授、李斌研究员和杨辉研究员。专家点评朱锦芳Jeff Zhu (Chief, Molecular and Cellular Immunoregulation Section, NIH)调节性T细胞（Tregs）在维持免疫耐受和免疫稳态中发挥关键作用，并且参与调节感染和癌症中的各种免疫反应。一方面，Treg功能的丧失通常与自身免疫和过度炎症有关；另一方面，肿瘤微环境中激活的Treg往往会抑制肿瘤免疫。因此，了解Treg的产生、激活及其获得抑制性功能的机制不仅将拓展基础免疫学认知，而且将为各种免疫相关疾病提供新颖有效的临床疗法。不同的代谢途径在控制Treg和效应性辅助型CD4+ T（Th）细胞的发育和分化中作用不同。经典观点认为，Tregs更倾向于脂肪酸氧化，而效应Th细胞主要利用葡萄糖作为能量来源。在本项工作中，童雪梅团队及其合作实验室共同发现，非氧化磷酸戊糖途径（非氧化PPP）在控制Treg细胞激活和抑制功能中起着关键作用。非氧化PPP是葡萄糖分解代谢的一个分支，它在Treg和效应性Th细胞中的功能尚不清楚。令人惊奇的是，在Treg中敲除非氧化性PPP中的重要酶—转酮醇酶（TKT），小鼠会产生致死性自身免疫病。Treg细胞特异性 TKT 缺失导致其失去免疫抑制功能，却不影响其发育和Foxp3蛋白表达。机制上，童雪梅及其合作团队发现TKT缺失诱导线粒体氧化应激和还原性TCA循环，导致α-酮戊二酸（α-KG）水平降低。α-KG作为重要的表观遗传辅助因子，能调控组蛋白和DNA去甲基化酶的功能。TKT缺失时，Treg中众多基因的DNA甲基化增加，染色质可及性下降。并且，α-KG补充能够改善由Treg特异性TKT 缺失引起的自身免疫反应。此外，在临床自身免疫性疾病患者外周血Treg中，TKT水平被下调。Treg获得抑制功能需要被激活，TKT缺失诱发的自身免疫反应是由活化Treg特征性基因表达减少所导致的。由于Treg细胞群体的异质性，单细胞分析可以为TKT如何调节Treg激活和表观修饰提供一个更清晰的解释。然而，该研究发现在大约1000个激活态Treg特征基因中，只有124个受到TKT缺失的影响，却诱发了显著的小鼠自身免疫病表型，表明这个小的基因群体包含对Treg功能至关重要的效应分子，例如IL-10和TIGIT等。因此，本项研究发现令人印象非常深刻。本项工作不仅促进我们全面认识Treg细胞激活和功能的机理，而且在未来治疗人类疾病方面具有潜在重要转化价值。原文和特评链接：https://www.nature.com/articles/s42255-022-00575-z，https://www.nature.com/articles/s42255-022-00574-0

硝基呋喃类药物（Nitrofurans）是一类合成的抗菌药物，它们作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢，从而起抑菌作用。目前在医疗上应用较广者有：呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮。呋喃西林只供局部应用，后两者则可供系统治疗应用。目前在医疗上应用较广者有：呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮。呋喃西林只供局部应用，后两者则可供系统治疗应用。 硝基呋喃类药物很不稳定，很容易生成代谢物。硝基呋喃类药物在动物体内迅速分解产生代谢物，代谢物在体内与细胞膜蛋白结合成结合态。由于代谢物比较稳定也有致癌作用，所以在食品安全的检测中检测硝基呋喃代谢物。常见的硝基呋喃代谢物的衍生物有如下四种，包括：3-氨基-2-恶唑酮（AOZ）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-乙内酰脲(AHD)和氨基脲(SEM)。 本方案建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8030联用检测水产品中硝基呋喃类代谢物的残留量的测试方法。样品经处理后，用超高效液相色谱LC-30A在4.0 min内完成分离，三重四极杆质谱仪LCMS-8030进行定量分析。对四种硝基呋喃类代谢物残留的线性、精密度、检出限（LOD）、定量限（LOQ）进行了验证。3-氨基-2-恶唑酮（AOZ）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-乙内酰脲(AHD)和氨基脲(SEM)在1~200 &mu g/L内线性良好，相关系数均大于0.999；分别用浓度为1 µ g/L、10 µ g/L和50 µ g/L的混合标准溶液进行了精密度实验，实验结果表明连续6次进样保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.28 ~ 0.07%和4.76 ~ 1.68%间，仪器精密度良好。满足《GB/T 21311-2007 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检验方法 高效液相色谱串联质谱法》的检测要求。 了解详情，请点击《超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留》。 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所为扩大中国事业的规模，于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司。 目前，岛津企业管理（中国）有限公司在中国全境拥有13个分公司，事业规模正在不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心；覆盖全国30个省的销售代理商网络；60多个技术服务站，构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。 岛津作为全球化的生产基地，已构筑起了不仅面向中国客户，同时也面向全世界的产品生产、供应体系，并力图构建起一个符合中国市场要求的产品生产体制。 以&ldquo 为了人类和地球的健康&rdquo 为目标，岛津人将始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn/an/ 。

新突破新guan肺炎自2019年暴发以来，给全社会带来了灾难性的影响，不仅对quan世界人民的健康造成了巨大威胁，还对全球经济产生了震荡性的影响。因此，对新guan肺炎的研究也显得愈发重要。近期，来自北京大学医学部jing准医疗多组学研究中心的黄超兰团队、中国科学院院士高福团队以及中国科学院天津工业生物技术研究所高峰团队，通过采用基于质谱的糖基化修饰鉴定技术，对新guan肺炎颗粒上S蛋白的O-糖基化修饰图谱进行了整体描绘，进而提出了“O-Follow-N”的O糖基化修饰规律，为新guan肺炎的致病机制探索提供了研究基础。而这项出色的研究，也于2021年8月2日以“O-glycosylation pattern of the SARS-CoV-2 spike protein reveals an“O-Follow-N” rule”为题发表在了Cell Research期刊上。糖基化修饰（Glycosylation）是蛋白质主要的翻译后修饰类型，其广泛参与细胞黏附、识别、信号转导等重要过程，影响蛋白质的分泌、运输和稳态调控，可发生在细胞50-70%的蛋白质上，2021年糖基化修饰鉴定被Nature Methods评为zui值得关注的技术之一。根据糖苷链类型，蛋白质糖基化修饰可以分为四类：（1）N-连接糖基化；（2）O-连接糖基化；（3）C-连接糖基化；（4）糖基磷脂酰肌醇锚定。其中O-糖基化修饰，是在高尔基体中产生。它在人体中有70余种常见糖型，无特定氨基酸结构域。目前，对O-糖基化修饰研究存在许多困难，比如：1糖基化修饰的糖链形成无固定模版；2受200多种糖基转移酶的复杂调控；3糖基化肽段剂量水平低；4规模化糖链结构解析通量低；5糖链构成微不均一性，定性与定量困难；6功能性糖基化位点及关键糖结构指认困难。受这些因素影响，对O-糖基化修饰的研究也是少之又少。现阶段，对于大规模、高通量的蛋白质翻译后修饰的研究，zuihao的途径就是利用基于高分辨质谱的蛋白质组学技术。在这篇报道中，黄教授等团队，就是通过基于质谱的蛋白质组学技术，克服一系列困难，shou次对新guan病毒上S蛋白的O-糖基化进行了综合性描绘。实验中，研究者为获得天然状态下S蛋白的N-和O-糖基化修饰完整图谱，首先从SARS-CoV-2病毒颗粒上获得S蛋白，并使用了LysC+Trypsin, Chymotrypsin, GluC, Elastase 以及 alpha-Lytic等多种蛋白酶将S蛋白酶解成肽段。而对于这种复杂糖蛋白酶解后产生的肽段，普通质谱很难进行检测。研究者则采用了具有超高分辨率的Orbitrap Eclipse 三合一质谱仪，并利用三合一仪器多种碎裂功能中的阶梯HCD（stepped collisional energy SCE），HCD（Higher-energy collisional dissociation）以及组合式的HCDpdEThcD三种碎裂方法进行质谱分析。图1. Orbitrap Eclipse 三合一质谱仪Orbitrap Eclipse三合一质谱仪是一台不仅拥有着CID, HCD, ETD HD, EThcD HD, ETciD, UVPD, PTCR等多种碎裂模式的质谱仪，而且还具有高达50万的分辨率，能够对多种形式的修饰肽段进行jing准定性与定量，为研究者提供了更坚实的硬件基础。研究中，研究者共鉴定到了39个糖基化修饰位点。其中包括此前已报道的22个N-糖基化修饰位点，以及17个O-糖基化修饰位点。值得注意的是，这17个O-糖基化修饰位点是shou次从SARS-CoV-2病毒颗粒中提取的S蛋白上鉴定到的。并且通过深入分析这些位点，研究者发现在这17个位点中，有11个位点位于糖基化的天冬酰胺（Asn, N）附近。为了更准确的对这一现象进行挖掘，研究者将NxS/T共有基序内糖基化的N每一侧的3个氨基酸定义为“N±1-3”。分析结果显示，11个O-糖基化修饰位点分布在“N±1-3”的位置上，位点信息确定的位点有10个，其中7个位点分布在“N+2”的位置上。研究者还通过开展定点突变实验进一步证实N糖基化修饰的存在是“N±1-3”的位置上出现O-糖基化修饰的先决条件。基于以上分析，研究者提出SARS-CoV-2病毒S蛋白的糖基化修饰存在O-糖基化修饰追随N-糖基化修饰发生的现象，并将这一现象命名为“O-Follow-N”规律。图2.新guan病毒S蛋白上符合“O-Follow-N”规律的O糖基化修饰（点击查看大图）小结Summary研究基于前沿的质谱分析技术，通过使用超高分辨的三合一质谱仪Orbitrap Eclipse，揭示了新guan病毒上S蛋白的O糖基化修饰谱，进而提出了O 糖基化修饰的“O-Follow-N”规律，同时这一规律也可能适用于其它蛋白。这个规律提示O-糖基化修饰具有潜在的调控新机制，特别是N-和O-糖基化修饰之间可能存在的协同作用，未来有望在极大程度上推动糖生物学领域的研究。黄超兰（北京大学医学部jing准医疗多组学研究中心主任）问根据您的经验，O-糖基化修饰鉴定的难点在哪里？答对于所有的蛋白翻译后修饰鉴定都普遍存在着几个相同的难点：（1）修饰丰度相对较低，难以直接鉴定，往往需要进行修饰富集，因此对样本量等要求较高；（2）修饰调节为动态变化过程，鉴定重复性会相对低一点。而对于O-糖基化修饰，因其特殊性，又有几个其他因素影响：（1）糖基化修饰的糖链形成无固定模版，且受多种糖基转移酶的复杂调控；（2）规模化糖链结构解析通量低，定性与定量困难；（3）功能性糖基化位点及关键糖结构指认困难。问Orbitrap Eclipse Tribrid三合一质谱联用仪在该研究中发挥了怎样的作用？答在我们的实验体系中，使用了多种蛋白酶对S蛋白进行处理，因此会产生长短不一，形式各异的肽段，而这就要求配套的质谱仪器能够具有多种碎裂模式，而 Orbitrap Eclipse质谱仪就很好地满足了我们的需求。并且Orbitrap Eclipse具有很好的分辨率以及稳定性，这对我们的实验提供了很大帮助。问新guan病毒颗粒上提取的S蛋白O-糖基化修饰图谱的揭示对新xing冠状病毒肺炎的研究有哪些帮助？答我们在实验中发现了“O-Follow-N”变化规律，这对研究糖基化的变化具有很好的提示作用。并且这个规律也显示O-糖基化修饰具有潜在的调控新机制，特别是N-和O-糖基化修饰之间可能存在的协同作用，未来有望在极大程度上推动糖生物学领域的研究。专家介绍黄超兰教授长期致力于质谱和蛋白质组学前沿新技术和方法的研究开发，应用范围包括生物学基础、医学和临床研究，是高度跨界，善于交叉学科整合，战略规划制定和人员管理的quan方位技能科学家。如需合作转载本文，请文末留言。这样的应用图书馆不来了解一下？点击进入小程序完成注册即刻抽取盲盒好礼