贝克氏酵母

试剂1M LiCl 50% PEG3350 (氯化锂转化法只能PEG3350,不能用PEG8000,PEG3350在北京莱博生物有售,80元/100克)2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效,对酿酒酵母有效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用。感受态毕氏酵母的制备1. 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；培养基里有流沙样的菌体在流动2. 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；3. 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；4. 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；5. 按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；

[b]1. 目的[/b] 对《食品安全国家标准 食品生生物学检验 霉菌和酵母计数》GB4789.15-2016进行细化，指导微生物实验室霉菌和酵母计数检测具体操作。[b]2. 适用范围[/b]本操作规程适用于食品、化妆品及一次性筷子中霉菌和酵母菌的计数。[b]3. 设备及材料[/b]冰箱、霉菌培养箱、拍击式均质、显微镜、电子天平、高压灭菌器及其他灭菌和常规检测用器皿、材料。[b]4. 培养基及试剂[/b] 生理盐水（0.85%氯化钠溶液） 孟加拉红培养基或马铃薯葡萄粮琼脂[b]5. 检验程序 [/b] [table][tr][td=1,1,35] [/td][/tr][tr][td] [/td][td][img=,527,469]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/03/202403181712248843_5332_3247208_3.png[/img][/td][/tr][/table][b] 6. 操作步骤6.1 1:10样品匀液制 [/b]以生理盐水做样品稀释液。6.1.1食品样品 样品适宜时，取25g/ml样品加入装有225ml稀释液的均质袋中，用拍击式均质器充分混匀；如果样品硬度较大，不宜使用拍击式均质器时，取25g样品加入装有225ml稀释液的椎形瓶中充分振摇，制成1:10样品匀液。6.1.2 化妆品样品 油性液体，取10g/ml样品，先加入5ml灭菌石腊混匀，再加10 ml灭菌吐温80，42℃水浴，加75ml灭菌生理盐水，拍击均质1min，制成1：10样品匀液； 水溶性液体、膏、霜、粉剂等，称10 g样品加90ml灭菌生理盐水，拍击均质1min，制成1：10样品匀液 疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10 g/ml样品加10 ml灭菌液体腊和10 ml灭菌吐温80，再加入70 ml灭菌生理盐水，拍击均质3 min，制成1：10样品匀液。6.1.3 一次性筷子样品 取一次性筷子25g（通常取6双，表面积约为50平方厘米）加入装有225ml稀释液的无菌袋中充分振摇，作为1:10的样品匀液。[b]6.2 样品匀液稀释[/b]用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]取1ml 1:10的样品匀液注入装有9ml稀释液的试管中，另换一个枪头，反复吹吸，制成1:100样品匀液。按此法依次制备10倍递增稀释的系列样品匀液。根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入2个无菌平皿内。同进分别取1ml样品稀释液加入2个平皿作空白对照。[b]6.3 倾注平皿[/b] 将冷却至46℃的孟加拉红培养基倾注平皿，及时转动平皿使培养基和样品匀液混合均匀。[b]注意：[/b]孟加拉红培养基可置46±1℃的水浴箱中保温，但不应超过4小时。凝固后的培养基只可复溶一次，否则将影响培养基质量。[b]6.4 培养[/b] 待琼脂凝固后，将平皿倒置，于28±1℃霉菌培养，3天后观观察，5天记录结果。[b]6.5 计数[/b] 肉眼观察，选取菌落数在10-150CFU的平板计数。根据检测要求，计数霉菌和酵母的总和或分别计数霉菌数和酵母数。霉菌、酵母和细菌的菌落鉴别可参照以下方法。[align=left]6.5.1肉眼观察菌落特征[/align][align=left]通常情况下肉眼观察，霉菌、酵母、细菌三种菌落在孟加拉红培基上的特征如下：[/align] [table][tr][td=1,1,83] 霉菌菌落[/td][td=1,1,482] 绒毛状、棉絮状、蛛网状。具有菌丝体，菌落较大，扁平，较干燥。颜色多样，白色、黑色、黄色多见，菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致，菌落周围有晕圈。[/td][/tr][tr][td=1,1,83] 酵母菌菌落[/td][td=1,1,482] 菌落较细菌大且厚，质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色均一。光滑、湿润、常带黏性，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。培养时间较长时可呈皱缩状，表面较干燥。位于琼脂内的菌落，可呈铁饼形、三角形及多角形。[/td][/tr][tr][td=1,1,83] 细菌菌落[/td][td=1,1,482] 由于受到抑制，通常会很小，红色，常呈橄榄形。[/td][/tr][/table]6.5.2 低倍镜观察菌落边缘形态肉眼观察菌落形态无法区别孟加拉红培养基上酵母和细菌时，可用低倍普通光学显微镜观察平板表面菌落边缘较薄较透光的部分，在边缘能看到细胞的是酵母，看不见的则是细菌。 [table=565][tr][td=1,1,83] 霉菌菌落[/td][td=1,1,482] 边缘可见明显的菌丝体。[/td][/tr][tr][td=1,1,83] 酵母菌菌落[/td][td=1,1,482] 边缘较规整，调节聚焦螺旋可见到细腻如细沙的结构。若无法确认可用接种针从边缘稍稍刮开菌落，即可在镜下见到卵圆形的细胞。[/td][/tr][tr][td=1,1,83] 细菌菌落[/td][td=1,1,482] 菌落紧密，边缘整齐，不易透光，看不到细沙粒样的结构。[/td][/tr][/table]6.5.3 染色法观察挑取菌落用亚甲基蓝或革兰氏染色，酵母菌霉菌在低倍镜下即可见到细胞或菌丝，而细菌不可见，无菌丝的酵母体积较大，在40倍显微镜下清晰可见，细菌则需在油镜下才能清楚观察。[b]7. 结果记录与报告[/b]7.1 结果记录计算两个平板菌落的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数计算。7.1.1 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他夹板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.2 若所有平板上菌落数均小于10CFU，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.3 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。7.2 报告7.2.1 菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。7.2.2 菌落数大于或等于100时，可将前3位数字采用“四舍五入”原则修约，取前两位数字，后面用0补齐位数表示结果（例如：结果为1210可表示为1200）；也可采用两位有效数字乘以10的指数形式来表示（例如：结果为1210可表示为1.2*10[sup]3[/sup]）。7.2.3 称重取样以CFU/g为单位，体积取样以CFU/ml为单位。7.2.4 根据检测要求分别报告霉菌和酵母数，或报告霉菌和酵母总数。[b]8. 参考文件[/b]《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》 GB 4789.15-2016《一次性筷子 第1部分 木筷》 GB19790-2005《化妆品微生物标准检验方法》 GB 7918-1987

求大神解释一下，食品国标4789.15中，霉菌和酵母测定，计数怎么计，标准是小于或等于50cfu/g，测得，霉菌1cfu，酵母7cfu（稀释10倍），是总得计数40cfu/g合格，还是霉菌5cfu/g，酵母35cfu/g不合格。标准50是总和50，还是各25的意思。急急急！