电泳实验装置

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我是整毛细管电泳仪器装置的新手，想找一些也是从事毛细管电泳装置的朋友，以便以后向你们请教相关的知识和经验，看见后请加我为好友吧。谢谢啦！！[em0809]

想做自由流电泳方面的探索实验，望接触过这方面的前辈指点一二？谢谢本人比较急，求助好心人 现在在实验装置设置阶段， 有许些问题

[b]＊样品制备[/b][list][*]样品必须完全溶解于上样缓冲液，否则不能在凝胶中移动。样品太浓可能产生假相。[*]样品缓冲液包含盐类（维持样品）、甘油（增加重量从而使样品下沉至点样孔）、以及示踪染料（以便监测电泳进程）。[*]样品缓冲液可以分装成小部分冻存。[*]缓冲液加到凝胶上之后才能点样。[*]样品缓冲液中的示踪染料可以指示什么时候终止电泳。两种最常用的染料是漠酚蓝(BPB) 与二甲基苯青FF 。[/list][b]＊标准分子质量[/b][list][*]标准分子质量应同时电泳，用来检测电泳进展以及分析结果。[*]使用相适应的标准分子质量。[*]胶连同分子质量标准物一起拍照。标上各条带的大小。[*]标准分子质量有带标记的与不带标记的两种。标记可以是荧光、发光体或者放射性元素。如果手边没有带标记的标准物，可以将染色后的胶与事后标记的印迹相比较。[*]在每一块胶的同一泳道点上标准物。把标准物加在第一个泳道，就能知道胶的方向。[*]点上正对照与负对照。[/list][b]＊样式[/b][list][*]琼脂糖凝胶一般以水平方向进行电泳，而聚丙烯酰胺凝胶则是以垂直方向进行电泳。潜水型胶是一种水平方向胶，凝胶被浸淹在电泳槽的底部。[*]凝胶可以制成多种大小。测序胶必须制成大胶，但是对于大多筛选与转移用胶，甚至包括双向凝胶来说，只要不是把分子量相近的条带区分割，小型胶就可以了。[*]毛细管电泳利用开口狭小的毛细管来进行DNA 、蛋白质和其他小分子的自动高效分离。分离是与检测分析相连，就像色谱仪器一样。只有专门实验室才有毛细管电泳设备。[/list][b]＊凝胶[/b][list][*]聚丙烯酰胺VS 琼脂糖。尽管凝胶电泳可以在滤纸、醋酸纤维素、淀粉或者其他基质上进行，大多数研究者还是只采用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。两种都是多孔性胶，像分子筛样起作用（聚丙烯酰胺或者琼脂糖的百分比越高孔越小）。理论上，任何一种都可以用来分离DNA 、RNA 或者蛋白质。但是，聚丙烯酰胺在低百分比浓度时很软，难以用手操作。一般采用高百分比浓度，用以分析蛋白质和小核苷酸。[*]低百分比琼脂糖凝胶相对较硬，易于操作，用来分离目的分子，如DNA和RNA或者巨大的蛋白质和蛋白质复体。[*]胶的浓度必须与片断大小相适应。[*]每次切去胶的同一小角。这样，万一胶掉落、翻转或在转移过程中放置凝胶，都能给定位做参考。[/list][b]＊缓冲液[/b][list][*]大多数电泳缓冲液配成高浓度母液，在电泳前稀释。[*]每一种缓冲液在某一电流时会有特定的电压。要认识每一种缓冲液的特性，这样，出错时，就马上可以注意到。[/list][b]＊电源[/b][list][*]电源输出有几种模式：稳压(mV) 、稳流（安培，或者简称安）以及稳功率（瓦特，瓦） 。许多型号允许设定程序，在各种模式之间自动转换。这样可以使用最佳的电压（ 在电泳过程中可能发生变化）同时不超出容量。[*]不是所有的电源输出装置都相同，所以不能简单地将电泳装置接到任意装置上。要清楚你需要什么电流或者电压，然后找出需要的装置。[*]大多数实验室都有不止一个电源装置用于测序胶（要求高电压）、电泳转移（要求高电流）以及用于琼脂糖和聚丙烯酰胺电泳（使用大范围的电压）的装置。很少有电源装置能同时满足所有的要求。[*]变性蛋白胶与DNA和RNA胶中的样品会从负极（阴极）移到正极（阳极） 。用红色导线接正极（＋），黑色导线接负极（一）。可以用同一个电源输出装置同时进行几块胶的电泳，但是没问过其他人前不要这样做，因为电泳条件会发生变化。[*]设置闹钟提醒自己察看胶。特别是当你要察看低分子质量的分子时，样品很容易跑出胶进入缓冲液中。[*]接触任何东西前，确信电泳装置必须处于断电状态。如果电源没被切断，不要进行任何操作！ 电流效应[/list][b]固定[/b][list][*]凝胶是否需要固定取决于用途。需要染色的胶一般需要固定，而用于转移的胶则不需要固定。[/list][b]＊干燥[/b][list][*]通过出去胶上的水，胶基质变薄。干燥之后的胶在放射自显影后条带更清晰。[*]在凝胶干燥仪上干燥一块胶不需1小时。凝胶干燥仪可以加热，从而加快干燥过程。[/list][b]＊染色[/b][list][*]DNA与RNA的染色可以通过在电泳前把染料加到样品中完成，也可以在事后染色。[*]蛋白质胶在电泳后染色。[/list][b]＊记录[/b][list][*]凝胶经溴化乙锭染色后的Polaroid照片与蛋白质凝胶的35 mm照片是最常用的记录方式。[*]数字记录与分析系统最常使用，所有数据可以直接用来演示。[*]各种转移的记录方式取决于体系与实验。例如，放射自显影与化学发光结果可以记录在X射线胶片上，而信号可用光密度计定量。[/list][b]＊确定分子质量[/b][list][*]蛋白质的分子质量可用SDS-PAGE确定，而DNA与RNA的分子质量可以由琼脂糖凝胶电泳来确定。对某一分子而言，其分子质量的对数与其Rf（相对迁移距离）存在线性关系。以标准物的迁移距离对其分子质量的对数作图，得到标准曲线，而样品的Rf 值一也就是分子质量一可以由图外推得到。1.制胶，胶的浓度应最适宜分离分子质量相近的分子。同时电泳分子质量标准物，其范围涵盖有目的分子的大致大小。2.跑胶，防止染料前沿跑出胶的边际。3.胶染色，拍照。如果样品是放射性标记的，你可以使用放射性标记的标准物或者把胶与放射自显影胶片相比较。4.测定从样品孔到每一标准条带的距离。计算每个数值的对数，画到常规图纸的Y 轴上。X 轴上是迁移的距离（以厘米计最方便）。对大多数标准物条带应该得到一条盲线。5.把样品迁移距离画到图上。外推标准曲线，确定分子质量。[/list]

凝胶电泳仪器的发展 电泳系统虽然只是作为生化分离分析所必需的常规仪器，但它的进展与其他大型仪器设备一样，同样是非常迅速的。从1809年的第一次电泳实验所用的雏型装置到1946年第一台商品自由移界电泳系统问世经历了一个多世纪。但此后的50多年电泳仪器的发展却极其迅猛，特别是电泳介质由流动相改为凝胶后，各种各样的凝胶电泳装置便层出不穷以适应各种研究工作和生产实践的需要。

电泳槽是凝胶电泳系统的核心部分，其系统的迅猛发展主要也是体现在电泳槽上。根据电泳的原理，凝胶都是放在两个缓冲腔之间，电场通过凝胶连接两个缓冲腔。缓冲液和凝胶之问的接触可以是直接的液体接触，也可以间接通过凝胶条或滤纸条。管状凝胶电泳和垂直板状电泳大多采取直接液体接触方式。这种方式可以有效地使用电场，但在装置设计上有一些困难，如液体泄漏，电安全和操作麻烦等问题。水平板状电泳槽大多通过间接方式，用滤纸桥搭接以及最近使用缓冲液制作的凝胶条和滤纸条搭接，即半干技术，后种方式使装置简化，操作也大大方便。

生化实验讲义(理论部分)－－电泳技术 　　4.1 电泳技术发展简史1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。4.2 电泳的基本原理电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm 14 cm，厚度为1mm～2 mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生电场强度（E），L是电极间距离。在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷与电场强度的乘积。这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F’）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即：

凝胶电泳（英语：Gel electrophoresis）或称胶体电泳 是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法（如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹）检测之前部分提纯分子。凝胶电泳仪 - 使用方法凝胶电泳被广泛用于分子生物学、遗传学和生物化学：1.大的DNA或者RNA分子通常利用琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）分离，也可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。2.蛋白质的凝胶电泳通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行（SDS-PAGE），或者非变性凝胶电泳，或二维电泳。 SDS-PAGE 蛋白质凝胶电泳图。 3.毛细管电泳 　4.酶谱法（zymography） 5.变性梯度胶凝电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE） 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、 DNA的分子大小。度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 2、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 3、 DNA分子的构象DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而开环双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

根据电泳仪原理、电泳仪功能、电泳仪的使用方法、电泳仪的用途不同可以为：琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维薄膜电泳、高效毛细管电泳、琼脂糖电泳、SDS-PAGE凝胶电泳、蛋白质电泳、血清蛋白电泳、dna电泳、血红蛋白电泳、蛋白质双向电泳、免疫电泳、等电聚焦电泳、单细胞凝胶电泳、蛋白质凝胶电泳、质粒电泳、对流免疫电泳、变性电泳等。电泳仪分类：1、毛细管电泳仪：其主要部件有0～30kV可调稳压稳流电源，内径小于100μm(常用50～75μm)、长度一般为30～100cm的弹性石英毛细管、电极槽、检测器和进样装置。检测器有紫外／可见分光检测器、激光诱导荧光检测器和电化学检测器，前者最为常用。进样方法有电动法(电迁移)、压力法(正压力、负压力)和虹吸法。成套仪器还配有自动冲洗、自动进样、温度控制、数据采集和处理等部件。 2、常规电泳仪：其组成部件为可调稳压稳流电源，垂直电泳槽，水平电泳槽，电极连接线，支持体【非凝胶性支持体区带电泳（支持体有：①淀粉②纤维素粉③玻璃粉，硅胶等) ；凝胶支持体区带电泳支持体有：①淀粉液②聚丙烯酰胺凝胶③琼脂（糖）凝胶】；陶瓷板，抽水泵，输水管，冰水曹等部件组成。3、其他电泳仪：Tiselius或微量电泳、显微电泳、等电点聚焦电泳技术、等速电泳技术、密度梯度电泳等。是一种非支持体的电泳仪也称为自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等很少使用。毛细管电泳仪、凝胶电泳仪、垂直电泳仪、微电泳仪、高压电泳仪、水平电泳仪、高效毛细管电泳仪、双向电泳仪、bio rad 电泳仪、脉冲场电泳仪、伯乐电泳仪、北京六一电泳仪上海巴玖均可提供！

电泳技术发展简史 1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。 1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。 从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。 由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。4.2 电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。 电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm ? 14 cm，厚度为1mm～2 mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。

我正在做 DNA损伤要用彗星实验进行验证　　但是我不知道用哪种电泳好些　？？有哪位高人愿意帮帮忙　　？？？　　顺便能不能附上一份关于那种电泳的相关原理和使用手册？？

目　　录第一章 　　实验材料1．1 IPG预制胶条及载体两性电解质1．2 蛋白质定量试剂盒及其试剂1．3 试剂盒及其试剂1．4 化学试剂1．5 蛋白质Marker1．6 染色试剂1．7 注意事项第二章　　SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 1 溶液的配制2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制2. 3 操作方法2. 4 注意事项第三章　　双向电泳3. 1 溶液配制3. 2 操作步骤3. 3 注意事项附录1 双向电泳完整的操作步骤附录2　　聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3　　细胞样品的一般处理步骤附录4　　组织样品的一般处理步骤附录5　　我方主要工作人员通讯录[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=18952]双向电泳实验培训资料[/url]

本人最近想做自由流电泳这一块的实验？请问有前辈做过吗？ 望指点一下

火箭电泳实际是一种定量免疫电泳。其原理为：在电场作用下，抗原在含定量抗体的琼脂介质中泳动，二者比例在合适时在较短时间内形成状似火箭或锥形的沉淀线，而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系，因此本法可以测定样品中抗原的含量。一、材料1. 诊断血清（抗体）：抗人IgG或IgA免疫血清。2. 待检血清（抗原）：人血清。3. 参考血清。4. pH8.6，离子强度0.05 M 巴比妥缓冲液配制（见对流免疫电泳实验）。5. 其它：琼脂粉，微量进样器，打孔器，玻璃板，电泳仪。二、方法1. 抗体琼脂板的制备同单向扩散法，但注意稀释液应用pH8.6离子强度0.05 M 的巴比妥缓冲液。2. 打孔见下图。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/B1361084635_small.jpg3. 将用缓冲液稀释的适宜浓度的参考血清及适当稀释的抗原（人血清）分别加入各孔中，每孔10或20 μl，要求加量准确而不外溢。4. 把加完样的免疫琼脂板放入电泳槽中进行电泳，电压4~6 V/cm，电泳时间1~5 h，直到大部分抗原孔前端出现顶端尖窄而完全闭合的火箭状沉淀线，关闭电源。5. 取下琼脂板，以抗原孔中心为起点，量出各火箭状沉淀线的高度。同单向琼脂扩散法绘制标准曲线，查出待检血清中Ig含量。

之前一直在做的微流控芯片，没有毛细管电泳的经验，因为课题要做片上电泳（说白了就是在芯片的沟道中电泳），所以想先做做普通的毛细管电泳的实验了解一下。可实验室条件不允许，没有毛细管电泳仪（见都没见过，呜呜），只好自己搭建实验平台。我想问一下自己如何搭建毛细管电泳实验平台的想法是否可行？如果可行，需要解决的问题主要是什么？ 课题要求，检测方式要是电喷雾离化+质谱。先把自己想到的问题罗列一下吧，（本人毛细管电泳盲，可能问题很BC，勿怪嘿嘿）1）首先想到的就是进样问题，文献中罗列的有电动进样，压力进样(包括重力)，扩散进样 我想请问如果要自己搭建，哪一种方式最为方便和可靠？2）还有就是缓冲液的选择，如果我希望电泳后接电喷雾电离，缓冲液用什么好？3）电泳的管子我想就用Polymicro Technologies 的熔融石英毛细管，不知是否可行？这个课题偏仪器，对于毛细管电泳检测对象没有要求，对保留时间重复性要求不高。目前想到的问题就这些，希望和大家多多讨论。谢谢啦

对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向扩散技术高10-15倍。血清蛋白在pH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。所以游动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。这样抗原体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。一、材料1. 诊断血清：免抗人免疫血清2. 待检血清：人血清3. 阴性对照血清4. pH8.6、离子强度0.05 M 巴比妥缓冲液配方：巴比妥1.84 g，巴比妥钠10.3 g，加蒸馏水1000 ml，调pH至8.6。5. 缓冲琼脂板：将纯化的琼脂用pH8.6离子强度0.025的巴比妥缓冲液（用0.05 M 的巴比妥缓冲液稀释一倍即可）配成1.5%的琼脂，加入0.01~0.02%流柳汞防腐，保存冰箱内备用。6. 电泳仪7. 其他：生理盐水、打孔器、微量进样器二、方法1. 琼脂板的制备根据需要可选用大玻板（6 cm×9 cm）和（小玻片）两种。大玻板约需琼脂10 ml，小玻片约需3.5 ml，凝固后按图打孔，方法同琼脂扩散实验。2. 加样：左侧孔内加患者血清（原血清及10倍稀释血清各占一孔），右侧内加抗血清，每片应有阳性对照。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/B1361084632_small.jpg3. 电泳用国产普通电泳仪。其内加0.05 m pH8.6的巴比妥缓冲液，加至电泳槽高度的三分之二处，注意两槽内液面尽量水平。将加好样品的玻板置于电泳槽上，抗原端接负极，抗体端接正极，用2~4层滤纸浸湿作盐桥，滤纸与琼脂板联接处为0.5 cm。以板宽度计算电流，以板的长度计算电压。要求电流量为2~3 mA/cm，即大板为20 mA，小板为10 mA。电压为4~6 V/cm。通电45分钟—2小时后观察结果。4. 结果观察在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。5. 影响结果的因素（1）抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度的增加，抗原抗体的比例发生变化，沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间，并可出现不典型的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。（2）组电泳缓冲液其电泳结果以巴比妥钠—盐酸缓冲液灵敏度最高。巴比妥—巴比妥钠次之，Tris缓冲液更差。（3）电压与电流时电泳时间需要长些：电压电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实验结果。一般选择5 ml/cm，电泳时间改为1.5小时。

对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向扩散技术高10-15倍。血清蛋白在pH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。所以游动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。这样抗原体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。一、材料1. 诊断血清：免抗人免疫血清2. 待检血清：人血清3. 阴性对照血清4. pH8.6、离子强度0.05 M 巴比妥缓冲液配方：巴比妥1.84 g，巴比妥钠10.3 g，加蒸馏水1000 ml，调pH至8.6。5. 缓冲琼脂板：将纯化的琼脂用pH8.6离子强度0.025的巴比妥缓冲液（用0.05 M 的巴比妥缓冲液稀释一倍即可）配成1.5%的琼脂，加入0.01~0.02%流柳汞防腐，保存冰箱内备用。6. 电泳仪7. 其他：生理盐水、打孔器、微量进样器二、方法1. 琼脂板的制备根据需要可选用大玻板（6 cm×9 cm）和（小玻片）两种。大玻板约需琼脂10 ml，小玻片约需3.5 ml，凝固后按图打孔，方法同琼脂扩散实验。2. 加样：左侧孔内加患者血清（原血清及10倍稀释血清各占一孔），右侧内加抗血清，每片应有阳性对照。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/B1361084632_small.jpg3. 电泳用国产普通电泳仪。其内加0.05 m pH8.6的巴比妥缓冲液，加至电泳槽高度的三分之二处，注意两槽内液面尽量水平。将加好样品的玻板置于电泳槽上，抗原端接负极，抗体端接正极，用2~4层滤纸浸湿作盐桥，滤纸与琼脂板联接处为0.5 cm。以板宽度计算电流，以板的长度计算电压。要求电流量为2~3 mA/cm，即大板为20 mA，小板为10 mA。电压为4~6 V/cm。通电45分钟—2小时后观察结果。4. 结果观察在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。5. 影响结果的因素（1）抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度的增加，抗原抗体的比例发生变化，沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间，并可出现不典型的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。（2）组电泳缓冲液其电泳结果以巴比妥钠—盐酸缓冲液灵敏度最高。巴比妥—巴比妥钠次之，Tris缓冲液更差。（3）电压与电流时电泳时间需要长些：电压电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实验结果。一般选择5 ml/cm，电泳时间改为1.5小时。

电泳实验需要注意什么？

电泳现象　　 电泳是指带电粒子在电场作用下向电性相反的方向迁移的现象。利用这种现象对某些化学或生物化学物质进行分离分析的技术称为电泳技术，可完成电泳分离的仪器称为电泳仪。 　　 不同的物质粒子在同一电场中，由于它们之间有效电荷、形状、大小的差别，它们的电泳迁移就会不同，所以有可能得到分离。也就是说，物质粒子在电场中迁移速度的不同是电泳分离的基础。　　 毛细管电泳是将电泳的场所置于毛细管中的一种电泳分离方法，它的装置结构非常简单，通常由高压电源、铂电极、缓冲液池、样品池、毛细管、检测器和分析记录仪构成。　　 利用上述的仪器，我们就可以进行毛细管电泳分离。它的基本流程有进样、分离和检测三步骤。　　 总的来说，毛细管电泳非常广泛地应用于生命科学中生物样品的分离分析，特别是蛋白质分离、糖分析、DNA测序、手性分离、单细胞分析等。

电泳现象　　 电泳是指带电粒子在电场作用下向电性相反的方向迁移的现象。利用这种现象对某些化学或生物化学物质进行分离分析的技术称为电泳技术，可完成电泳分离的仪器称为电泳仪。 　　 不同的物质粒子在同一电场中，由于它们之间有效电荷、形状、大小的差别，它们的电泳迁移就会不同，所以有可能得到分离。也就是说，物质粒子在电场中迁移速度的不同是电泳分离的基础。　　 毛细管电泳是将电泳的场所置于毛细管中的一种电泳分离方法，它的装置结构非常简单，通常由高压电源、铂电极、缓冲液池、样品池、毛细管、检测器和分析记录仪构成。　　 利用上述的仪器，我们就可以进行毛细管电泳分离。它的基本流程有进样、分离和检测三步骤。　　 总的来说，毛细管电泳非常广泛地应用于生命科学中生物样品的分离分析，特别是蛋白质分离、糖分析、DNA测序、手性分离、单细胞分析等。

琼脂糖电泳步骤之超级基础篇一、电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽，根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶最终越薄越好。实验记录备查 二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和bufferBuffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。5.拔梳子，放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。 三、上样电泳[

免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离，然后于凝胶槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散，在比例适宜部位形成特异的抗原抗体沉淀弧线。每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物，故可用抗原成分分析；且可以根据其迁移率与抗体所出现的特异反应进行鉴定。一、材料1. 待检标本（抗原）：正常人血清。2. 抗体：正常人血清的家兔免疫血清。3. 1.5%离子琼脂（系用巴比妥缓冲液配制的）。4. 电泳仪。5. pH8.6、离子强度0.05 M 巴比妥缓冲液配方：巴比妥1.84 g，巴比妥钠10.3 g，加蒸馏水1000 ml，调pH至8.6。6. 其它：载物玻片，直径3毫米打孔器，20 mm×2 mm 玻璃铸型，微量进样器。二、方法1. 取载物玻片（7.5×2.5 cm）加上3.5 ml 1.5%琼脂凝胶，制成2毫米厚的琼脂板。2. 按图位置，在琼脂板未凝固时，放入抗血清槽铸型，注意勿使铸型全部浸入琼脂中，待凝固时再打孔。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/A1361084544_small.jpg3. 加待检标本：用微量进样器往孔中加1~5 μl。4. 电泳：电压9~7 V/cm，泳动15~20小时。5. 电泳后取出抗血清槽铸型，加入抗血清，进行双扩散，一般在24小时内沉淀弧出全。6. 观察结果：或描绘、拍照或进行染色，染色后的标本便于结果分析及保存。

各位好，我做毛细管电泳筛选酶抑制剂，想做固定化酶，现在刚开始做实验，老板和师哥师姐都没做这个的，所以有很多问题。想请教一下：想在毛细管（内径75μm）内壁涂覆键合物质，需要什么装置，注射器可以吗，有商用的这种注射器吗？

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第一节 概 述一. DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端， 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言， 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。二. 凝胶电泳琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide， EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%， DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

用于毛细管电泳。看实验室之前有人用磷酸氢二钠和柠檬酸配置的，步骤是怎样的呢？

电泳实验要求很高，有的时候某一元素出现了问题，都会影响大家的实验结果，对于实验所用的水大家认为对实验结果有影响么？影响大么？自己有没有亲身经历过实验中水出现问题，导致实验的失败？

双向电泳篇 1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？ 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？ 这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（ 80 ％满）的矿物油。 3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？ 电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。 4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？ 刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动。 5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？ 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（ pH4 ），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。 6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？ 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。 7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。 8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ 等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。 9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？ 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。 10. 怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？ 可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。 11. 为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？ 横的脱尾可能是： 1 ）一向等电聚焦不完全； 2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。 12. 什么成分会影响 2D 胶的效果？ 核酸，盐，去垢剂等等。 13. 2D 胶的上样量应该在什么范围？ 上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克（银染）到 500 微克（考染）之间。 14. 我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？ 蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。 透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（ 不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。