大鼠脑固定器

研究背景 颅骨除了容纳、支持和保护脑组织，在头面部外形的塑造方面也承担了一定的责任。在严重的颅脑外伤、脑出血、颅内占位等情况下，需要紧急开颅手术缓解颅内高压，术后则会遗留颅骨缺损的问题，给患者的身心造成了严重的影响。颅骨成形术对颅骨缺损的修复和脑神经功能的恢复都有重要的意义。但用于颅骨成形术的传统生物材料都有着各自的优缺点，至今没有一个理想的解决方案，特别是传统生物材料都不能降解的致命缺陷对于儿童颅骨缺损的修复尤其不利，因此设计制备一种具有成骨活性的生物可降解颅骨修复材料非常迫切。 颅骨修复与其它长骨修复有较大的差异，主要表现在以下三个方面。 首先，颅骨修复除了需要快速成骨，还需要足够的力学支撑发挥保护作用，这就使得材料的孔隙率、孔径和力学强度之间产生了很难平衡的矛盾。 其次，颅骨的发育是膜内成骨作用的过程。在膜内成骨的过程中，骨髓间充质细胞在不形成软骨的情况下就直接分化为成骨细胞，紧接着形成包括额骨、顶骨以及部分枕骨的一系列扁平骨。这样一个相对复杂的成骨方式也决定了颅骨修复较其它长骨的修复更为困难。并且在颅脑外伤、肿瘤等原因造成的颅骨缺损中，硬脑膜常被损坏而缺损，对骨修复的过程更增加了困难。 再者，颅骨除了本身容纳、保护脑组织的作用外，还兼具塑形美容的作用，且颅骨的形状较复杂，个性化要求高，而传统的的人工骨材料规格单一、不可定制。因此，研发一种新的人工骨材料满足颅骨修复的特殊要求势在必行。 方法与结果 该研究采用复合支架的形式，将仿生矿化胶原与可降解生物相容性高分子材料——聚己内酯结合起来，采用溶剂造孔的方式，制备了一系列具有不同孔径分布及孔隙率特征的可植入骨修复支架材料。采用大鼠颅骨临界骨缺损动物模型对各组材料在体内的生物相容性及成骨性能进行评价，筛选出成骨性能最佳且力学强度可以接受的材料。 图1 不同孔结构特征支架SEM形貌及孔径统计分布 其中，最为重要的评价环节为影像学评价，已确定各个实验组之间在不同时间点的成骨情况差异。该研究中采取了Micro-CT（inspeXio SMX-90CT Plus, Shimadzu，日本岛津无损检测）透视并扫描4%多聚甲醛固定24h后的样本，扫描后经三维等值画图软件重建并进行成骨体积分析测定。通过X线透视及CT扫描影像评估样品植入前后的形状、骨密度，并通过成骨体积的测量进行定量分析。 图2 岛津Micro-CT三维重构结果 图3 根据Micro-CT结构计算的相对成骨体积 术后各组大鼠典型的Micro-CT扫描三维重建结果如图2所示。术后4周，模型组大鼠仅有少量针状骨结构位于缺损区，G1、G2、G4组大鼠骨桥位于缺损边缘，G3组大鼠骨桥部分通过缺损。术后8周，空白对照组大鼠缺损区中心有较多针状骨结构，边缘存在骨桥结构。G1、G2、G4组大鼠骨桥部分通过缺损，G3组大鼠骨桥通过缺损最长点。术后12周，模型组大鼠骨桥部分通过缺损，而G1、G2、G3、G4各组大鼠骨桥均通过了缺损最长点，而G3、G4组密度更接近于周围的骨组织，尤其是G3组，95%以上区域已成骨，部分缺损边界已显示不清。 定量分析通过三维重建软件测算出各组大鼠缺损部位的成骨体积，如图3所示。各组大鼠成骨体积在4周，8周，12周时都与空白对照组有显著性差异（P0.05），并且在各个时间点，G3组（pMC 1:10）矿化胶原基颅骨修复材料较G1、G2、G4组成骨体积更多，差异有统计学意义（P0.05）。 图4 Micro-CT重构的矢状位结果 术后各组大鼠Micro-CT正中矢状位影像如图4所示。术后4周，空白对照组缺损区边缘极少量点状高密度影，各实验组缺损区密度均匀增高，颅骨内面靠近硬膜一侧密度较对侧增高更明显。术后8周，空白对照组缺损区可见少量片状密度增高影，各实验组缺损区出现较大面积条状或片状密度增高影，且密度与周围骨质相近。术后12周，空白对照组可见条状密度增高影，各实验组缺损区域密度升高影面积较前明显增加，尤其是G3、G4组，缺损区大部分已被高密度影所占据，且密度和周围正常骨质非常相似。 图5 缺损区组织HE染色 图5所示为术后各组大鼠颅骨正中矢状位石蜡切片HE染色结果，新生成骨被染成密度均匀的粉红色。可以看到4周时，缺损区仅少量点状成骨，各实验组缺损区材料内部可见较密集的斑片状新生成骨。术后8周，对照组新生成骨较少，各实验组新生成骨由斑片状连接成长条状，部分跨越缺损区，新生成骨位于颅骨内侧面硬膜外层。术后12周，对照组缺损区可见部分条状新生成骨，各实验组材料内部和边缘皆有新骨形成，可观察到明显的骨小梁结构，尤其是G3组材料几乎完全降解，大部分被新生的自体骨结构所替代，尤其是靠近硬膜一侧，新生骨结构已与周围正常骨的结构相同。 总结与讨论 本部分研究采用大鼠颅骨临界骨缺损动物模型评价了不同溶剂配比的矿化胶原颅骨修复材料在体内的成骨性能。从影像学、组织学不同角度观察了材料诱导骨长入的过程，并进行了定量分析，筛选出成骨性能和力学强度达到最佳平衡的骨材料溶剂配比，既可以保证一定的力学强度，并且诱导成骨作用最好，为进一步颅骨修复材料的研发奠定了基础。 文献题目：《Tuning pore features of mineralized collagen/PCL scaffolds for cranial bone regeneration in a rat model》使用仪器：岛津5SMX-90CTPlus-1909第一作者：王硕原文链接：https://doi.org/10.1016/j.msec.2019.110186 声明 1、文章来源：Materials Science & Engineering C2、因篇幅有限，仅显示第一作者。3、本文不提供文献原文，如有需要请自行前往原文链接查看。4、所引用文献仅供读者研究和学习参考，不得用于其他营利性活动。

由华中科技大学武汉光电国家实验室(筹)骆清铭教授、龚辉教授研究团队获取的一套大鼠全脑高分辨数据集，近期发布在欧盟人脑计划(Human Brain Project, HBP)的神经信息平台(Neuroinformatics Platform, NIP)上。这标志着该团队建立的“鼠脑最精细脑图谱基础数据库”为欧盟人脑计划正式采用。　　此次发布在HBP-NIP上的数据集由该研究团队独立完成，样本为Golgi-Cox法染色的Sprague Dawley大鼠全脑，用显微光学切片断层成像(MOST)系统获取了全脑图像，成像分辨率为 0.35μ m×0.35μ m×1μ m，共包含16216层矢状原始切面。该数据集也同时在全脑网络可视化(Visible Brain-wide Networks, VBN)网站进行了共享，访问地址为 https://vbn.org.cn/2D/id3.html。　　HBP是2013年经欧盟委员会批准发起的旗舰级拨款项目，汇集了欧洲神经科学领域的众多科研团队与神经科学前沿研究课题，有超过120个参与机构和10亿欧元的项目资金。神经信息平台是HBP的重要组成部分，用于神经科学数据的发布与检索，近期发布的是神经信息平台的第一个公开版本，可直接通过 https://nip.humanbrainproject.eu 访问。HBP还同时发布了脑模拟平台、高性能计算平台、医学信息平台、神经形态计算平台和神经机器人平台，可通过 https://collab.humanbrainproject.eu 注册、登录和使用。

2021年4月，中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔阿不力孜、贺玖明团队在分析化学一区《Analytical Chemistry》期刊发表封面文章，题为“Mapping metabolic networks in the brain by using ambient mass spectrometry imaging and metabolomics”的研究成果，采用自主研发的质谱成像空间代谢组学技术，全面绘制了大鼠脑代谢网络，深入解析了东莨菪碱致大鼠记忆功能障碍模型脑的代谢变化。　　封面文章　　研究背景　　大脑是结构最复杂的器官之一，主要功能与其微区的分子相互作用密切相关。大脑的小分子调节机制对理解中枢神经功能、精神疾病机理和药物研发有很大的帮助。动物的认知过程和行为控制均依赖于脑部强大的中枢神经网络——神经连接体。科学家进行了很多研究，但是对脑部小分子网络的研究仍有不足。　　分子成像技术是研究大脑中DNA、RNA、蛋白质和代谢产物的强大工具。质谱成像技术(MSI)是一种检测大脑中蛋白质、代谢物和脂质物质的高灵敏度和高通量分子成像技术，在肿瘤边缘诊断、肿瘤生物标志物发现、药物分布和机理阐述等领域有广泛的应用。　　本文作者开发了一种基于敞开式空气动力辅助解吸电喷雾离子化质谱成像(AFADESI-MSI)技术的代谢网络映射方法，对大鼠脑不同极性的小分子代谢物(m/z 50-500 Da)进行微区分布研究，不仅鉴定出脑部几乎所有重要的代谢物，还绘制了包含神经递质、嘌呤，有机酸，多胺，胆碱、碳水化合物和脂类等20条通路的代谢网络，并使用这种代谢网络映射质谱成像方法解析了东莨菪碱致大鼠记忆功能障碍模型脑的代谢变化，为中枢神经系统疾病的治疗提供新的信息和见解。研究思路　　研究方法　　1.样本准备　　Sprague-Dawley大鼠模型腹腔注射东莨菪碱后被杀死(处理组，3只)，对照组大鼠(3只)也用同样方法杀死。获取大鼠整个大脑，在低温下将大脑切成连续的矢状切片(暴露出海马和纹状体)，用于Nissl 染色、H&E染色和质谱成像检测。　　2.空间代谢组实验　　使用AFADESI-MSI分析，代谢物质量数范围50-500 Da，质谱分辨率70,000。　　3.数据处理和代谢网络分析　　原始数据经过转化，再使用自建MassImager软件获取成像结果 在获取差异代谢物的高分辨率质谱信息后，使用Metaboanalys在线数据挖掘软件以褐家鼠(rattus norvegicus)为参考完成代谢物高通量定性，并输出代谢网络信息。大脑中复杂网络可视化使用Cyctoscope软件完成。　　4.统计分析　　两组大脑样本选择相同的微区，并将组织学和特征离子图像叠加进行确认。数据处理结果使用t检验(n = 3)进一步验证。大脑微区包括松果体、中脑导水管、脑桥、梨状皮质、延髓、丘脑、纹状体、海马、胼胝体、嗅球、大脑皮层、小脑皮层、穹窿、小脑延髓和丘脑。　　研究结果　　1.AFADESI-MSI用于大脑中极性代谢物的定位　　如图1所示，将大鼠大脑连续矢状切面通过ESI探针对逐个像素进行扫描，并将解吸的代谢物离子传输到高分辨率质量分析仪进行分析。图1E是大鼠脑部某个像素点的一个代表性质谱图，在该图中可以观察到数千个代谢物的峰。AFADESI-MSI图像还表明脑部不同功能性区域中代谢物浓度的变化。图1A-D显示了代表性代谢产物图像，在松果体、纹状体、海马、胼胝体和嗅球等亚区域具有特定分布。这些异质代谢分布与大鼠脑的功能和结构复杂性高度一致。　　实验结果表明，AFADESI-MSI的空间分辨率小于100μm，代谢物质量最大差异为0.001Da，同一物质的检测动态范围高达1000倍。如图1所示，通过AFADESI-MSI可在大鼠脑部检测到一些呈特征性分布有代表性的极性代谢物，其强度范围从0到104甚至到106。　　图1 (A-E)使用AFADESI-MSI获得的用于构建大鼠大脑代谢网络图的代表性极性内源性代谢物 　　(F)AFADESI-MSI数据采集过程 　　2.在大鼠脑绘制特定区域分布的极性代谢物图谱　　使用AFADESI-MSI在正离子和负离子模式下分别获得298个和372个微区轮廓清晰的代谢物离子图像。使用精确分子量并结合同位素丰度，通过人类代谢组数据库(HMDB)对离子图像进行识别，鉴定出多种内源极性代谢物，包括氨基酸、核苷酸或核苷、碳水化合物、脂肪酸和神经递质等。　　中枢神经系统(CNS)的特定功能和特定解剖区域相关。例如，乙酰胆碱在大脑皮层中高度表达 γ-氨基丁酸是一种抑制性神经递质，其在大脑皮层的信号强度较低，在中脑、嗅球和下丘脑中的浓度较高 多巴胺在纹状体含量较高 组胺(一种兴奋性神经递质)主要分布于丘脑和下丘脑。松果体在睡眠和光周期调节中起着重要的作用，并且由于其体积小容易被忽视。在松果体区域中，作者检测到106种极性代谢物，例如吲哚乙醛、吲哚、5' -甲硫基腺苷和褪黑激素，它们在该微结构的表达最高。褪黑激素由松果体分泌，起到调节昼夜节律的作用。质谱成像结果表明褪黑激素只能在松果体检测到。褪黑激素的上游代谢物血清素(5-HT)在松果体中也有特定的分布。此外一些未知的代谢物也仅在大鼠大脑的某个很小但特定的区域中。以上结果表明，AFADESI-MSI方法可以直接检测极性代谢产物，并具有高特异性，能呈现其在大脑微区分布的图像。　　3.在大鼠脑中绘制微区代谢网络图　　要了解大脑的结构区域发生的复杂代谢过程，不仅应准确表征代谢物，还要研究其相关性。从大鼠脑微区中提取代谢谱进行代谢网络重建。从15个微区提取的MSI数据进行峰挑选和峰对齐(图1F)，包括松果体、中脑导水管、脑桥、梨状皮质、延髓、丘脑、纹状体、海马、胼胝体、嗅球、大脑皮层、小脑皮层、穹窿、小脑延髓和丘脑，然后使用基于KEGG数据库的Metaboanalyst软件进行代谢网络分析。共找到20条KEGG代谢通路，包含126个具有微区信息的代谢物，图2显示了涉及丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代谢、花生四烯酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、肌酸途径、GABA能突触、葡萄糖代谢、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢、甘氨酸-丝氨酸和苏氨酸的代谢、组氨酸代谢、赖氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、多胺代谢途径、嘌呤代谢、嘧啶代谢和TCA循环、色氨酸代谢、酪氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸和异亮氨酸代谢和类固醇激素合成途径。质谱成像方法提供了一种直接获取代谢网络信息的途径，以系统地深入了解大脑的代谢活动。　　图2 通过AFADESI-MSI和Metaboanalyst获得的大鼠脑中的代谢网络　　图3A展示了嘌呤代谢的分布和代谢途径，共包含17个核苷酸及相关代谢产物，饼图代表了某种代谢物在不同大脑微区的相对含量和分布，图3A中显示出不同代谢物的不同局部特征。例如腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)在大脑皮层和松果体中高表达，但在胼胝体和穹窿中含量较低。图3B显示了大脑不同区域的AMP分布，AMP在大脑皮层和松果体中含量很高，而在胼胝体和穹窿中含量较低。这些结果表明，大脑中代谢物分布呈现出功能性区域的差异性。这些空间和代谢途径的上游-下游转换过程为大脑局部代谢活动提供丰富信息。也证明质谱成像方法能够提供直接获取代谢网络信息的方法。　　图3 (A)通过AFADESI-MSI获得的大鼠脑中嘌呤代谢途径和相关代谢产物分布 　　(B)腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)在大鼠脑不同区域的分布 　　4.神经递质的代谢网络解析　　神经递质在大脑不同区域具有极为复杂的代谢调节网络，使这些区域的中枢神经能够从事复杂的活动。作者分析了关键神经递质的代谢调控网络，分别为多巴胺、γ-氨基丁酸、腺苷、组胺、乙酰胆碱、5-羟色胺、谷氨酸和谷氨酰胺。图4A显示了神经递质以及相关代谢产物在大鼠脑的分布特征，它们联系非常紧密(图4B)，这些神经元彼此相互作用并形成复杂的调节网络。　　图4 |(A)大鼠脑中神经递质及其相关代谢产物的分布 　　(B)神经递质调节和代谢网络 　　5.从大鼠脑的代谢网络映射中发掘空间变化　　东莨菪碱治疗的大鼠是一种学习和记忆障碍模型，通常用于研究抗遗忘药疗效。本文作者使用AFADESI-MSI分析了对照组和东莨菪碱治疗的大鼠矢状脑切片，将发现的代谢物全面映射代谢网络，并通过代谢组学分析发现空间代谢变化。不仅可以对药物准确定量，还可以检测代谢网络相关的数百种内源性代谢物在大脑特定区域的分布。图5显示了代谢网络中检测到的各种代谢物，以及在不同大脑微区代谢物的明显改变。如图5A所示，找到三种代谢物(N-甲酰基尿氨酸、L-色氨酸和5-羟色氨酸)，属于色氨酸代谢途径，意味着东莨菪碱会干扰色氨酸的代谢过程。作者分析了东莨菪碱治疗组大鼠脑的十个微区，发现脑桥中有16种表达异常的代谢产物，而在大脑皮层中发现了7种。表明在东莨菪碱治疗下，脑桥和大脑皮层可能是受影响最严重的区域。　　图5 东莨菪碱模型大脑中极性代谢网络的变化　　图6显示了其中几种异常表达的代谢产物的分布，例如腺嘌呤在小脑皮层被下调 组胺在中脑导水管中下调 桥脑中的磷酸乙醇胺、大脑皮层中的2-氧戊二酸、纹状体中的多巴胺、胼胝体中的抗坏血酸、下丘脑中的谷胱甘肽、小脑皮层中的L-天冬氨酸和L-天冬氨酸也有所变化，这些代谢物的质谱成像结果(图6A-H)和相对定量结果(图6I1-18)进一步表明，大脑中药物作用后代谢物的多样性和区域特异性。这些代谢物不分区分析、含量进行全脑平均后，代谢物的微区含量差异很容易被削减。在空间上的代谢变化表明，在东莨菪碱治疗后，大鼠脑微区的代谢网络发生紊乱。但是代谢物和代谢酶是代谢网络的关键因素，基于空间分辨的代谢组学信息为发现酶或基因异常提供了线索，但若要完成完整的代谢网络分析必须进一步验证蛋白质和基因表达水平。　　图6 在东莨菪碱治疗后大鼠模型的脑部质谱成像结果和代谢产物的统计结果　　研究结论　　本文作者开发了一种空间分辨代谢网络作图方法，通过无需衍生化、特定标记或复杂样品预处理的高通量AFADESI-MSI方法和代谢组学策略，在具有复杂结构化脑组织中发现代谢分子变化。能检测出多种极性内源性代谢物，并绘制相关代谢网络，提供组织微区分布的图谱。还将多种功能性小分子(例如核苷酸、多胺、肌酸、神经酰胺代谢物)含量分布可视化。这些代谢物构成大鼠脑关键代谢网络，为理解大鼠脑的作用机制和功能探索提供新的见解。在本文中，该方法被用于东莨菪碱处理的大鼠模型脑部的代谢研究。结合微区统计数据，该方法可以绘制代谢网络图、发现某些途径代谢产物的明显失调，而且还能描绘与神经疾病直接相关微区中发生的代谢变化。