自动细胞计数仪

全自动血细胞分析仪——能依靠它们去计数吗？库尔特原理库尔特原理指出：悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过小孔管时，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。这主要是根据血细胞与稀释剂相比，血细胞是不良导体的特性而提出的。起初，原始的库尔特计数器只能计算和测量红细胞。后来，随着技术的不断发展和设备的不断改进，临床医生还可以利用它来计算和测量白细胞。到20世纪70年代，技术的进一步发展使技术人员能够分离血小板。全自动细胞计数器的演进传统意义上的血细胞计数器是通过研究外周血涂片，使用血细胞仪和白细胞分类计数而手动完成的（也称为100个细胞涂片分类，手动白细胞分类计数或手动计数器）。根据库尔特原理导致了库尔特计数器的发明，随后又开发出了技术先进的全自动血液细胞分析仪。自此，仪器的技术水平得到不断提高。由于技术的进步，一台仪器可以分析越来越多的参数，从而大大提高了血液检测的效率，减少在多台仪器上分析一个样品的情况。现代的细胞分析仪能够测量白细胞（WBC）、白细胞分类（五分类）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）、平均红细胞体积（MCV）、平均血小板体积，并且可以自动计算血细胞比容（HCT）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度，血小板比积和血小板分布宽度。自动分析仪的其他重要因素包括它们运行的速度和每批次可以处理的样本数量（大处理容量可以减少周转时间）。即时检验（POCT）即时检验（[/

超微量细胞自动分析技术在常规的细胞学实验中，无论是对于细胞培养中的细胞数量检测，还是药物对于细胞的毒性杀伤作用研究，或者是在下游实验前的细胞密度确认，都需要对细胞进行计数，有些时候还需要以染色的方法进行细胞存活率分析。目前，大部分实验室仍旧采用的是显微镜结合细胞计数板的计数方法，虽然成本低廉，但是操作繁琐，大部分细胞需要先稀释再计数，并且计数结果因人而异，系统偏差较大，另外计数板需要清洗，一旦清洗不够彻底会带来样品的交叉污染，因此，一旦样品较多就会消耗大量时间，影响研究的效率。也有一些实验室购置了能够自动进行细胞计数的仪器，可是当前的细胞计数仪均存在需要专门的试剂清洗以及样品进样针容易被细胞团堵塞等问题，无论是使用成本还是维护成本都居高不下。这些问题的存在不仅影响了自动化细胞计数的普及，同时也继续使细胞计数成为常规研究中的速度瓶颈。一款使用维护成本低，自动化程度高的细胞计数仪成为了许多细胞学研究者的呼声。根据这些用户的需求，GE Healthcare Life Sciences 最新推出了具有革命性进化设计的全自动细胞计数分析仪--Cytorecon，该仪器采用了高分辨率的CCD成像技术及自動軟件分析功能，仪器可以快速完成包括贴壁细胞、悬浮细胞、白细胞、培养细胞、酵母细胞等细胞样品的计数和浓度计算，结合成熟的台盼蓝染色技术，还可以快速完成细胞存活率的分析。除了细胞样品以外，仪器出色的性能甚至支持一些细菌和微生物样品的浓度计算。在进样的设计上，Cytorecon采用了20孔的特制样品盘设计，只需要用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]在样品盘上点上11ul样品，即可直接检测。即使超过107浓度的细胞，也能不需稀释即完成浓度分析。采用样品盘进样不仅通量高，而且一次规避了后续运行需要购买专门试剂、样品需要稀释、进样针会堵塞、不能同时测多个样品等一系列传统细胞计数仪器存在的问题。仪器内置了方便上手的控制分析软件，通过简单的参数设置就可以设定拍摄的样品数量，以及完成细胞大小、对比度和存活性的定义。有了如此方便的帮手，相信细胞计数将会变得无比轻松，您再也无需枯燥地对着显微镜，以损耗视力的代价通过人工逐个逐个进行细胞计数了。

iCELLigence全自动细胞分析仪让您远离MTT实验不断重复还无法得到统一结果的烦恼，让您不再因只看到其中的一个点而损失了其它的细胞生物学信息而无计可施，因为它可以清楚的记录下细胞完整的一生！ 一：全自动细胞分析仪仪器原理 iCELLigence实时无标记全自动细胞分析仪是一款新型的细胞分析平台，具有实时监测、高信息量、无需标记、全自动化、高灵敏度和高准确性等独特优点。该细胞分析仪通过嵌在E-plate板上孔底的微电子感应器阻抗变化去感受细胞的有无以及贴壁、黏附和生长程度的改变。在细胞毒性检测中，可实时、直观的反应细胞增殖、存活、凋亡、形态变化等细胞生物学变化。 二：全自动细胞分析仪仪器优势 iCELLigence全自动细胞分析仪的传感器阻抗技术在细胞分析中具有其独特的优势：它为整个的细胞毒性检测分析过程中提供了全程无损伤的监控，实时、连续显示的数据让您可以更加自信更加清楚的进行细胞毒性检测操作和其它的细胞分析，而不是假定细胞处于合适的处理阶段。一连串实时获取和显示的数据让您处理每一步结果都可以通过机理来预测，同时也可以结合全自动细胞分析仪实时的读数来决定传统终点细胞毒性检测分析的最佳时间点。只需几个简单的操作步骤您就可以获得高信息量的、直观的、准确的结果，就可以让您的细胞实验变得更加省时高效。 三：全自动细胞分析仪的应用领域基于iCELLigence全自动细胞分析仪的技术优势，该系统在基础生命科学领域具有广泛的应用，如细胞质量控制、细胞毒性检测、细胞粘附和细胞伸展等。

[b][url=http://www.f-lab.cn/cell-analyzers/ctc-enumeration.html]CTC细胞计数成像系统[/url][/b]集细胞荧光成像和罕见细胞计数功能于一体,自动聚焦成像，能够探测超级罕见细胞,包括[color=#333333]循环肿瘤[/color]细胞(Circulating Tumor Cells, CTCs),CTCs细胞。CTC细胞计数成像系统采用Nikon Ti-2倒置荧光显微镜,配备自动扫描显微镜载物台,自动聚焦器件,高灵敏度荧光CCD相机和LED激发光源组建而成。[img=CTC细胞计数成像系统]http://www.f-lab.cn/Upload/CTCs-enumeration.JPG[/img][img=CTC细胞计数成像系统]http://www.f-lab.cn/Upload/CTC-enumeration.JPG[/img]CTC细胞计数成像系统：[url]http://www.f-lab.cn/cell-analyzers/ctc-enumeration.html[/url][b][/b]

Cellscreen系统第一次实现了可重复对细胞培养进行观察。无需染色、无需制样，通过光学图像分析将细胞培养的生长曲线保存；与其它现有测试方法相比，Cellscreen系统对细胞培养无损伤性，独立性。第一次实现了对同一细胞培养区域进行多次测量。Cellscreen技术证明是一种精确的、可靠的、自定义实验条件、操作方便、节省成本的方法。Cellscreen能优化和加速新产品和测试程序的开发。 Cellscreen应用领域 Cellscreen模块化设计能适用于更广范的领域，例如： 制药研究：Cellscreen系统能缩短常规科研究时间，能拍摄细胞生长因子的各种因素，如毒性测试及生物适应性的测试。 生物技术研究：Cellscreen系统适用于增殖研究、过程（培养基）最优化、质量控制。另外，用于拍摄克隆细胞实验的新性质，如应用在新的治疗蛋白和抗体的研究。 Cellscreen系统的优势： l缩短制药研发的时间周期 l对细胞培养无损伤—细胞可再用于其它研究 l可扩展的详细的结果描述，对细胞培养过程的文档和图像存档 l与现有的方法相比，更精确——可靠、重复性、自定义 l很容易融入到日常实验 l很容易操作Multiwellplate l特别低的操作成本-对所有的测量只需要一个培养皿，不需试剂、不需对细胞染色。 l节省时间—不需样品制备 l技术成熟—innovatesAG图像识别技术 l模块化设计—系统可扩展其它分析模块 Cellscreen系统模块化设计： 为满足广泛的分析需求，Cellscreen系统是按模块化设计，能运行不同的软件系统。硬件由一个双处理器电脑及控制单元组成，控制单元通过高精度电机台自动聚焦、自动调光来控制显微镜；不同的软件模块对数码相机获取的图像进行分析，分析所得的图像和数据存储在终端数据库。 软件模块包括： l悬浮细胞的增殖研究模块（PS模块） l贴壁细胞的增殖研究模块（PA） l克隆细胞实验模块（CL） 细胞增殖研究模块（PS和PA）能重复观测细胞培养的生长因子，CL模块观察克隆细胞，并能追随到起源的单克隆细胞。 克隆细胞实验模块（CL） 在整个培养过程中，CL模块自动监控单个克隆细胞到群体的生长过程；为了证明细胞群体的单克隆细胞起源，需要监控整个生长过程。 Cellscreen系统用40倍放大系数抓取容器低部的16幅图像，它能代表整个容器的状态。 所有获得的图像和数据存档到数据库，因此可以跟踪任何生物群体的成长过程，证明生物群体起源的单克隆细胞。 很好的保护—Cellscreen的培养器 Cellscreen的培养器精确的安装在显微镜上，在测量过程中，对您贵重的细胞培养，它保持一个稳定的环境。对温度和CO2的浓度能精确的控制。培养器可以长时间或频繁的监控微量滴定盘，而不需移动它。 贴壁细胞的增殖研究模块（PA） PA模块通过测量细胞覆盖区域，用户可以观察到贴壁细胞的增殖。PA以40放大倍数获得图像。系统可以自由选择培养皿的区域。这系统适用于所有通用的微量滴定盘规格（6-96眼）。结果以图像和曲线的形式表示出来。PA模块将所有的图像和结果存档，输出格式CSV（兼容Excel格式）。 PA模块精确的测量至少80%细胞的生长因子，用于科研、发展、研制新产品。 悬浮细胞的增殖研究模块（PS） PS模块通常应用在对细胞生长因子影响的研究。为了获得生长曲线，悬浮液里培育的细胞数量被重复的量化——时间、原料、操作的消耗成本。对同一培养皿里的细胞生长，PS模块能重复计数、消除对每次测量都需要更换盘子的影响。 另外，Cellscreen系统对每个细胞进行计数，相对现存的细胞计数方法，它有很高的精确性。PS模块用的是100放大倍数，它获得的图像有很好的分辨率，能提供出细胞直径和细胞形状的一些信息。 Cellscreen系统概述 很容易综合到您的日常工作中——易学易用 实验和测量的标准化 在准备阶段，用户按要求设定实验配置。对实验条件有详细选择和描述，例如：微量滴定盘上的哪个培养皿，培养皿里哪个区域需要检测；另外一些参数需要选定，如：体积、细胞类型、培养方法、细胞直径。因为无需吸液管，其它方法中隐含的误差就很容易避免。 图像清晰、分析准确 现在的测量方法里，用CCD相机拍摄图像，对每一幅图片用相同的技术指标聚焦。 Cellscreen精确的控制技术保证，在每一个测量过程中，准确的拍摄培养皿的同一区域；因此对每一选择的区域，用户可以跟踪细胞的生长过程；PS软件对选定区域的细胞进行计数；CL和PA软件用来测定克隆细胞和悬浮细胞的表面区域。 广泛和详细的结果陈述 用户可以选择结果的描述方式：如照片、生长曲线、细胞浓度曲线图或幻灯片，用来证明细胞生长发育的全过程。所有的信息，如实验设置、图像的获得、处理结果以及一些简单的实验文档都自动保存在终端数据库。

谈到血常规检查，大家马上会想到WBC、RBC计数，虽然现在各种全自动和半自动的三分类、五分类血球分析仪已经普及，但在广大基层单位，条件尚不许可，仍然是一台显微镜加一块计数板，“目视计数法”还有顽强的生命力，及很强的实用价值，即使在仪器铺天盖地，大口吞噬“人工检验市场”的今天，我们依旧需要手工法进行样本复检、机器校正等工作。目视计数法在我们的印象中无非是数数方格，传统的计数法是按操作规程之规定，先找到相应的方格，但老方法中几十年来都一成不变的计数区域用到实际工作中并不让人感觉舒适和便利，当出现细胞数过多，堆得密密麻麻时，更容易视觉疲劳和出错；且动辄采血20μl，有些病人不易采足量（在同时进行多项检验时，更易出现采不到量而必须多次穿刺，增加了病人的痛苦）。因此，改进一下计数区域和采血量，寻找一种人性化的方法就很有其必要性了。对于这个问题，我研究了一套解决方案，并在工作中使用了近十年，一直感觉良好。下面，我就把该方案贴出来，和大家做一交流。一、RBC、PLT计数改进法：1. RBC：取血10μl加入红细胞稀释液3.0ml内混匀充池（即稀释300倍）2. PTL：取血10μl加入血小板计数液0.29ml内混匀充池（即稀释30倍）下面是计数池中间的那部分结构图，以红笔勾出的阴影部分为本法计数区域（两个细长长条区域）http://bbs.labsky.com/uploads/2010-5/2010-05-12_224036.jpg【计算】RBC数 / L = 计数区红细胞总数 / 100 ×10^12 / LPLT数 / L = 计数区血小板总数 ×10^9 / L二、WBC计数改进法：方法1：此法又可称为“盘龙法”，它覆盖面广，可较好的中和细胞不易分布均匀的固有误差，适用于精确计数。【操作】（同原法） 取血20μl加入白细胞计数液0.38ml内混匀充池（稀释20倍） 计数区域见下图所标示（蓝色箭头示意为计数起止方向）http://bbs.labsky.com/uploads/2010-5/2010-05-12_224121.jpg【计算】（亦同原法） WBC数 / L= 计数区白细胞总数 / 20 ×10^9 / L方法2：此法较上法简便而易于操作，采血量少，更不易疲劳和利于连续计数多量标本，且可灵活应对白细胞过低和过高的特殊情况，但准确性和精密度比上法稍差，适用于日常工作。【操作】取血10μl加入白细胞计数液0.29ml内混匀充池（即稀释30倍）（1）当白细胞数在合理区间时的计数区域（即用红线勾出的四个长条形区域）：http://bbs.labsky.com/uploads/2010-5/2010-05-12_224324.jpg【计算】WBC数 / L = 计数区白细胞总数 / 10 ×10^9 / L（2）当白细胞数低于4.0 ×10^9 / L时，不必加量采血重做，计数区域：http://bbs.labsky.com/uploads/2010-5/2010-05-12_224506.jpg【计算】WBC数 / L = 计数区白细胞总数 / 20 ×10^9 / L（3）当白细胞数高于80 ×10^9 / L时，亦不必进行二次稀释，计数区域与新法计数RBC或PLT的计数区域相同，请见上面的第一幅贴图【计算】WBC数 / L = 计数区白细胞总数 ×10^9 / L我的这套方法好用与否，大家一试便知。最终的计算公式是怎么推导来的，这里我就不做详细论述，大家可以自己试着推导一下，如果对我的文章有疑异的，可以随时和我联系，欢迎大家批评和指正。我的QQ：59889501 作者：景德镇第二医院检验科 黄知进

由于传统的血球计数板已不能满足高速发展的细胞研究需要，市场上各种自动细胞计数的设备越来越多。常见的主要分为两 类：基于图像的细胞计数仪(Automated vision-based counter)和基于库尔特电阻抗原理的细胞计数仪。两者主要区别在于，前者扫描仪器视野内图像，依靠设定的上下限细胞大小来进行图像识别，而后者根据细胞通过小孔引起电位变化来计算细胞个数（关于库尔特原理，详见此处），两者原理不同，因此所获得的效果也大相径庭。以下对各类细胞计数仪的计数准确性、可重复性、快捷性做结果数据比较，建议读者根据您自身需要选购适合您使用的细胞计数仪。【准确性比较】http://www.bioon.com/tech/UploadFiles_3081/201107/2011072416480295.jpg图1. 不同细胞浓度下各种细胞计数仪的计数结果与实际数值的对比上图可见：血球计数板在高细胞密度 时，计数结果与实际细胞密度有偏差，而基于图像的细胞计数仪则在多个浓度下均有较大偏差。这表明基于库尔特原理的细胞计数仪（Coulter counter和Scepter cytometer）在计数准确性上优于其他两种细胞仪。（样品为常见的COS7细胞）【可重复性比较】http://www.bioon.com/tech/UploadFiles_3081/201107/2011072416514090.jpg 图3. 不同细胞浓度下细胞计数的可重复性比较上图可见：基于库尔特原理细胞计数仪的可重复性均明显好于血球计数板和基于图像的细胞计数仪。（样品为19种细胞系）【快捷性】http://www.bioon.com/tech/UploadFiles_3081/201107/2011072416541552.jpg图5. 三种细胞计数法的计数时间对比上图可见：传统的血球计数板的计数时间远长于其他两种计数。库尔特原理计数法与基于图像的细胞计数法相比，计数速度更为稳定，而且计数时间约为后者的一半。（样品为常见的SF9，MCF7，HEK293细胞）

流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。

液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。（4）冷冻保存之细胞浓度：①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。3、步骤：（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106存活率：225/243﹦92.6%

中国科技网讯 据物理学家组织网近日报道，美国麻省理工学院和佐治亚理工学院研究人员开发出利用机器人操纵来自动发现和记录活体大脑中神经元信息的方法，即用一种全细胞膜片钳制动一个微小的空心玻璃针，在神经细胞的膜上开孔，以记录其内部电活性。该研究成果刊登在5月6日《自然·方法》期刊上。 这种深入大脑中神经元内部运作的方式可提供大量有用的信息，如电活性模式、细胞内部状况、甚至基因在某一时刻被闭合的剖面。然而，能够实现这个入口非常困难，目前世界上只有极少数实验室在进行尝试，这种自动发现和记录活体大脑中神经元信息的最新方法有望改变该领域研究现状。研究人员证明，在一个细胞检测的计算机程序的引导下，与人工相比，该自动装置识别和记录活老鼠大脑中的神经元信息具有更好的精度和速度。 采用新型自动化装置消除了对活体细胞的活动进行数月定向和长期搜索的需要。采用这种技术，科学家可将大脑中数千个细胞划分成不同类型，还可绘制其彼此之间的连接，并从正常细胞中找出病变细胞。 研究人员称，该方法在研究大脑疾病方面将会尤其有用，如精神分裂症、帕金森氏症、自闭症和癫痫。科学家们一直难以描述这些疾病中一个细胞与其具有电活回路和性能的分子集成。描绘出疾病如何改变活体大脑内特定细胞分子，将会更好地发现药物的靶标。 如果通过人工对这种精密仪器进行操作，需花上4个月的训练时间，最终还可能不是很精准，于是研究人员将这项任务交与机器人来操作，其机械手臂由计算机程序做指导。研究人员说，在神经科学中使用机器人来研究有生命的动物还仅仅是个开始，而像这样的机器人可能被用于在大脑中有目标点地注入药物，或提供基因治疗载体，希望新方法也能激励神经学家追求各类机器人自动化，例如在光遗传学方面，利用光有针对性地干扰神经回路和确定神经元在大脑功能中发挥的因果作用。(记者 华凌) 《科技日报》（2012-05-11 二版）

热销细胞网推出的流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来.细胞热销网是针对细胞的一个专业平台，在这里有关于细胞的设备，仪器等产品。

原标题 “纳米生物间谍”技术能进入活细胞取样 可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性 科技日报讯 据物理学家组织网近日报道，美国加利福尼亚大学圣克鲁兹分校（UCSC）研究人员开发出一种机器人式的“纳米生物间谍”系统，能从单个活细胞内提取出微量样本，进行RNA或DNA测序，而不会杀死细胞。研究人员表示，这种单细胞“纳米生物间谍”技术是一种了解活细胞内部动态过程的有力工具。相关论文发表在最近出版的美国化学协会《纳米》杂志上。 “我们能从活细胞中拿走一个‘生物间谍’，再把它送回该细胞，在几天内这样重复多次而不会杀死细胞。如果用其他技术，你不得不牺牲这个细胞才能分析它。”该生物传感与生物电技术小组负责人、UCSC巴斯金工程学院生物分子工程教授内德·波曼德说。 “纳米生物间谍”平台是研究小组用纳米吸液管开发的最新设备。纳米吸液管是一种小玻璃管，取液端越来越细，至尖端直径仅50到100纳米。波曼德说：“我能在实验室造出纳米吸液管，这不需要昂贵的纳米制造设备。但要进入一个细胞，问题是即使在高倍显微镜下，你也看不见吸液管尖端，不知道它偏离了细胞有多远。” 实验室博士后研究员亚当·赛格尔解决了这一问题。他基于在一台改造过的扫描离子电导显微镜（SICM），开发出一种反馈控制系统。该系统能利用通过纳米吸液管尖端的离子流作为反馈信号，在尖端接近细胞表面时探测其中的液滴。在尖端进入细胞之前，一种自动控制系统能定位它在细胞上面的位置，然后尖端很快插入穿透细胞膜，通过操控电压有控制地提取一小点细胞内物质。由于吸液管尖端极精细，对细胞造成的损害极微小。 研究小组用这种系统从活细胞中提取的微量细胞物质，估计只有50毫微微升（千万亿分之一升），约一个人体细胞百分之一的量。他们从单个人体癌细胞中提取物质并进行RNA测序，还从人类成纤维细胞中提取了线粒体并对其进行了DNA测序。“人们已经知道，线粒体和多种神经退化疾病有关。该技术可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性。”波曼德说。 该技术应用前景广阔。波曼德希望能与其他研究人员合作，探索其更多用途。“对于癌症生物学家、干细胞生物学家等想要了解细胞内部情况的科学家来说，这是一种多功能的平台。”（常丽君）来源：中国科技网-科技日报 2014年01月20日

许多关于细胞利用的一些生物学应用，如微生物学、细胞培养、血液检查等要求我们在实验中确定细胞的浓度。细胞计数非常简单，需要有一个计数板，称为血细胞计数板，或血细胞计数器。19世纪法国解剖学家Louis-Charles Malassez发明了这种血细胞计数板。血细胞计数板是由一片较厚的特制玻片构成，中间有一个垂直线网格。网格的尺寸是给定的，因此每条线覆盖的区域是已知的，这样就可以对一定体积内的溶液中的细胞数量进行计数，为后期的血细胞检测奠定基础。最为常见的血细胞计数板类型的中部有一个“H”形结构，上面有两个像镜子一样抛光的网格表面，并可在上面加上外罩。加载血细胞计数板开始进行计数之前，用擦镜纸拭去灰尘颗粒，确保血细胞计数板及其盖玻片处于洁净状态。安装在血细胞计数板上的盖玻片是特制的，明显厚于传统的显微镜盖玻片，这是因为它必须能够克服液滴的表面张力。确保在加载细胞悬液之前，先将盖玻片放置在计数表面，然后将吸液头和样本放进其中的一个V型孔中，并小心地挤出样本。利用毛细管作用充填盖玻片下部的区域。必须放入足够的液体以便覆盖整个镜片的表面，通常需要大约10ul，但不要溢出表面。您可以在一台血细胞计数板中加载两个样本，每个样本进入两个网格。将加载完的血细胞计数板放置在显微镜台上，然后将计数格在低倍镜焦距中显示。将样本静置几分钟，不要移动盖玻片，以免产生气泡导致计数困难。在血细胞计数板上进行血细胞计数一个血细胞计数板的整个网格包括9个方格，每个方格的面积为1mm2。血细胞计数板的中心区域有25个较大的方格，每个大的方格中又包含16个小方格。当进行计数时，仅对那些位于大方格两侧的各行中的细胞进行计数，以避免重复计数。悬液必须稀释到足够的程度，这样，细胞或其它颗粒才能均匀分布，不会再网格中相互重叠。为了判断细胞的活性，通常采用一种特殊的染色剂（如用台盼蓝稀释样本）。这种染色方法，又称为染色

有没有国产的细胞计数器(仪)？哪个牌子的好一点？一般什么价位？谢谢！

离心PBS液1 ml洗涤，吹打制成待测细胞悬液取1 ul悬液+9 ul PBS细胞计数：1. 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.2. 用10 ul枪头将细胞悬液注入计数板，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3. 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)的细胞数目。4. 计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： (细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)×106

早就听说flowjo的补偿自动调节功能，上网寻觅一圈都没有找到相应教程，实在忍不了了，就自己在此写个教程，希望能帮助到其他同学，废话不多。上教程，如果大家觉得不错，赏两个叮当，让我有更多的动力在为大家奉献一些小教程。1.样品制备，及数据采集我们实验室是BD公司的流式机，采集软件是cellqust pro，我的习惯都是采集数据以后，转用FLOWJO再继续分析，制图。样品制备同常。下面以脾淋巴细胞CD4,CD8分群来做一简单介绍。数据采集中，仍然要使用阴性管调节 阈值 电压 ，圈定大概的淋巴细胞的门。完成后，收细胞，保存数据为none.001转cd4-pe的单阳样品，不用调节补偿，直接收细胞，保存数据为cd4-pe.002。同样，转cd8-fitc的单阳样品，不用调节补偿，直接收细胞，保存数据为cd8-fitc.003最后上样品和control组，收细胞，保存数据为sample.004，如果有control组，假设为control.005（以上处理跟常规处理的主要区别，就是补偿调节都是0%，即不调节补偿，省去了补偿调节这一步，收细胞的速度是不是快了不是一点两点咧.)2，自动补偿调节将数据导入flowjo，本人用的是win环境下的lfowjo7.6.2xx版，有同学反应，文件不能导入或者导入细胞数是0，同学们可以试试将数据文件夹放在全英文路径下，同时有的从MAC系统拷来的目录，可以试着对文件夹从命名一下，也要是全英文，可能可以解决文件打不开的问题。将以上文件全部拖拽进flowjo，使用NONE.001圈定淋巴细胞门LYM.将门拖拽到allsample让门应用到所有样本上。这时候我们可以先看看sample.004的散点图，因为没有调节补偿，根本不是我们所能使用的图，更化不了象限，所以，我们开始调节补偿。

流式细胞胞仪的分析及分选原理流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和数字信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。在对细胞悬液中的单个细胞或其超微结构进行多参数快速自动分析过程中，每秒钟能测量数千个至数万个细胞，能在分析过程中按实验设计要求对特定细胞进行分析，带细胞分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。一、工作原理流式细胞仪的工作原理借鉴了荧光显微镜技术，将荧光显微镜的激发光源改为激光，使其具有了更好的单色性与激发[/

用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。

高内涵技术优势高内涵细胞成像分析系统由三个部分组成：全自动高速显微成像，全自动图像分析和数据管理。全自动高速显微成像在短时间内生成大量的图像，全自动图像分析从这些图像中提取大量的数据，数据管理软件负责建档存储、注释比较、检索分享这些图像和数据。高内涵，意味着丰富的信息。这些信息包括：单个细胞图像和各项指标，细胞群体的统计分析结果，细胞数量和形态的改变，亚细胞结构的变化，荧光信号随时间的变化，荧光信号空间分布的改变等等。人们往往因为特定的问题去设计实验，在图像中找到答案的同时，其他的信息会带来意外的新发现。

4.1 流式细胞仪基本原理1. 生物学颗粒分析原理① 流式细胞技术是在单细胞水平上，对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，现已成为现代医学研究最先进的分析技术之一。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。② 生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。③ 流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 ④ 流式细胞仪是在荧光显微镜技术、血细胞计数仪和喷墨技术的基础上发展起来的。⑤ 鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，与水平方向的激光束垂直相交，染色的细胞受激光照射后发出荧光，这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。2. 流式细胞仪细胞分选原理在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使液柱断裂成一连串均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，从而达到细胞分类收集的目的。4.2 流式细胞仪的分类和基本结构1. 流式细胞仪的分类流式细胞仪根据功能不同可分为临床型(亦称台式机)和科研型（亦称大型机）。流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。http://www.care100.com/yqxjpkc/images/112.gif

本课程小而精，是一块生物分析技术的重要拼图，短短7分钟的时间，一站式解答流式细胞分选技术的各种关键疑问，帮助你建立起对流式细胞分选术的整体认知。本课程主要涉及流式细胞分选技术的目的、注意事项、分选仪的

简单介绍一下细胞培养技术，本人这段时间主要做细胞工作，和大家共勉吧！细胞培养技术一、细胞培养的条件和要求 二、细胞分离 三.体外培养细胞龄的计算四.细胞鉴别试验 五、细胞计数六、细胞传代 七、细胞的冻存和复苏 八、细胞培养用水处理 九、选择小牛血清的微量细胞培养检查法 十、葡萄糖测定法 十一、乳酸测定法十二、细胞培养方式

北京和睦家医院 孙芾　王厚芳 流式细胞术(FCM)是70年代初发展起来的一项高新技术，80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了第一台流式细胞仪，到目前在医学院校、科研机构和医院已经有100多台。　　 FCM采用流式细胞仪对细胞悬液进行快速分析，通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。FCM综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点，还有对所需细胞进行分选等特殊功能。随着该仪器性能的不断完善，操作简单的各新型流式细胞仪相继问世。新试剂的不断发现使试验费用日益降低，FCM也从研究室逐步进入临床实验室，成为常规实验诊断的重要手段，不仅为临床提供了重要的诊断依据，也使检验科室的诊断水平、实验技术提高到一个新的高度。

[align=center][b][size=14.0pt]数据完整性在细胞计数中的要求[/size][/b][/align][align=center][size=11.0pt]会议时间：2020年3月20日14:00[/size][/align][b][size=12.0pt]内容介绍：[/size][/b]GMP体系中数据完整性的基本要求，不同大小的细胞计数的不同要求以及vicell的技术优势和数据完整性介绍。[b][size=12.0pt]讲师介绍：[/size] [size=11.0pt]丁华平:[/size][/b][size=11.0pt]10[/size][size=11.0pt]年以上的重组蛋白/抗体的细胞培养和纯化工艺开发和工艺放大研究和管理工作经验，包括CHO、大肠杆菌；有CMC技术转移和200L/250L/2000L工艺放大经验，熟悉并了解cGMP、PAT、QbD和NDA的要求； CMC项目管理经验丰富； 在培养基开发、细胞培养平台技术开发、工艺过程控制和工艺放大至200L/250L/2000L生物反应器方面经验丰富。[/size]报名地址：[url]https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_10387.html[/url]

1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪(flow cytonletry，FCM)是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland —Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter Parker Horst Kamentsky1 Gohde、Fulwyler Herzen—berg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用⋯。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术和的13臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅 主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊 概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。

流式细胞仪（Flowcytometry）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。

二、仪器、用品与试剂0.4 % w/v 台盼兰trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline 血球计数盘及盖玻片(Hem℃ytometer and coverslip) 计数器(counter) 低倍倒立显微镜 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 三、操作步骤（一）细胞计数3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色 ( 或红色- Erythrosin bluish) 。3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数x 2/ 4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占 10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。（二）细胞活力1、将细胞悬液以 0.5ml加入试管中。2、加入 0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色 2一 3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用 。