液相维生素

前段时间拿到一个饲料样品，要检测饲料中维生素A和维生素K3，看标准两者用的流动相都是甲醇-水，第一反映就是不是可以梯度洗脱同时测定两个成分，采用定时变换检测波长的方法实现检测。结果很失败，在此分享一下分析过程。 先看标准方法： GB/T 17817-2010 饲料中维生素A的测定 高效液相色谱法[img=,682,136]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292030_01_1638724_3.png[/img][img=,690,336]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292030_02_1638724_3.png[/img] GB/T 7294-2009 饲料添加剂亚硫酸氢钠甲萘醌（维生素K3）[img=,690,506]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292024_01_1638724_3.png[/img] GB/T 18872-2002 饲料中维生素K3的测定 高效液相色谱法 维生素K3的检测原理是在碱性条件下，水溶性的亚硫酸氢钠甲萘醌脱去亚硫酸氢钠生成脂溶性的甲萘醌，用三氯甲烷萃取，吸取适量经甲醇稀释后上机检测。[img=,680,508]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292025_01_1638724_3.png[/img]一、第一次实验：按标准维生素K3的提取过程太麻烦了，且三氯甲烷并不是随便可以买到，那能不能像维生素A一样直接甲醇提取后检测？1、查维生素K3（亚硫酸氢钠甲萘醌）理化特性:易溶于水和热乙醇，难溶于冰乙醇，不溶于苯和乙醚，水溶液PH4.7-7.常温下稳定，遇光易分解。看下面的结构式：[img=,247,199]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292009_01_1638724_3.png[/img]看性质肯定可以溶解在90%甲醇-水里，取亚硫酸氢钠甲萘醌适量，在棕色容量瓶中90%甲醇溶解后上机检测。2、结果出峰极快，受亚硫酸根强极性基团的影响，维生素K3在反相色谱上完全不保留且峰形很差，说明不能直接提取后上机检测，第一次以失败告终。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709081927_01_1638724_3.jpg[/img]二、第二次实验：老实的按标准方法（GB/T 18872-2002 饲料中维生素K3的测定 高效液相色谱法）？显然不好，还是不能同时测定维生素A和维生素K3，能不能碱性条件下脱亚硫酸氢钠后纯甲醇提取后上机检测呢？1、由于维生素A的提取方法是65度纯甲醇超声提取30分钟，那么就先取适量维生素A和维生素K3置100mL棕色容量瓶中，由于手上没有氢氧化铵，所以加入5mL碳酸钠溶液代替，加入后超声振摇1min，即有白色沉淀析出（可能是碳酸钠与甲萘醌的混合物），立即加入80mL甲醇，65度超声提取30分钟，过滤取，取滤液稀释至合适浓度上机检测。2、结果几乎无甲萘醌峰出现，观察提取液的颜色，基本可以确定是甲萘醌都氧化成了[color=#cc0000]羟基苯醌[/color]。如下呈褐色的滤液。第二次失败。[img=,602,337]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292059_01_1638724_3.png[/img] 还有一个原因是用甲醇提取与用三氯甲烷提取有明显的区别，是甲醇与碳酸钠溶液是有一定互溶性的，而三氯甲烷与碳酸钠溶液不互溶。甲醇的碳酸钠溶液可能也会促进甲萘醌的破坏。三、第三次实验1、实验方法：维生素A与维生素K3分别按标准方法提取，再吸取甲萘醌的三氯甲烷溶液适量置提取好的维生素A提取液中，混匀，上机检测，梯度洗脱程序如下：[img=,509,384]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709292142_01_1638724_3.png[/img]2、结果甲萘醌与维生素A可以实现分离与同时检测，但每针的分析时间太长，与分别单独检测维生素A与维生素K3，每针分析时间只要10分钟相比，没有优势，如果还要同时分析维生素D与维生素E的话，分析时间就会更长，另外也有可能存在提取维生素A时有少量甲萘醌生成，造成结果偏高的误差。其它实验证明维生素A、D、E可能在98%甲醇下同时分析。至此，第三次实验也算失败。[img=,620,512]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709300842_01_1638724_3.jpg[/img]　　　　　　　　　　　　　维生素Ｋ3（7.1min）与维生素Ａ(21.4min)同时检测图谱[img=,581,500]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709300842_02_1638724_3.jpg[/img]　　　　　　　　　　　　　　　　维生素Ａ样品图谱（98%甲醇等度洗脱）[img=,588,492]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709300842_03_1638724_3.jpg[/img]　　　　　　　　　　　　　　　维生素Ｋ3样品图谱（80%甲醇等度洗脱） 综上，本次最终还是选择按标准方法分别检测维生素A与维生素K3，在检测维生素K3由标准方法的旋转振荡器改为普通摇床振荡。这次的经验告诉我，要改进方法真的不容易，进行方法开发前一定要充分了解待测组分的理化性质，充分理解参考文献的检测原理与注意事项。看到亚硫酸根有没有人会考虑使用离子对试剂四丁基氢氧化铵和四丁基溴化铵的，估计也是不行的，碱性条件下会水解。

仪器： LC-100高效液相色谱仪色谱柱： SHOEDEX C18-120-5， 4.6*250mm， 5um流动相： 甲醇 流速： 1mL/min检测波长：326nm；7.5min后264nm，10.5min后285nm进样量： 10uL柱温： 28℃ http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/06/201506110949_549816_1635904_3.png 按照出峰顺序依次为 VA, VD3， VE注意事项：维生素A乙酸酯需保存在棕色瓶中，溶液配好后尽快检测 VA，1微克/毫升；VD3，5微克/毫升；VE，0.1微克/毫升

高效液相色谱法检测维生素A维生素A是人体所必须的营养物质，具有调节表皮及角质层新陈代谢的功效，保持组织或器官表层的健康，维持正常视觉功能促进骨骼正常生长发育，抑制肿瘤生长。海能仪器股份有限公司应用中心实验室依据国标GB/T 17817-2010中高效液相测定维生素A的方法，对维生素A软胶囊中组分进行分析确认，方法如下：使用仪器：海能LC7000二元高压色谱系统（色谱泵，紫外检测器，手动进样器）Hanon-Clarity 色谱工作站试剂：超纯水、甲醇、维生素A 软胶囊色谱条件:色谱柱:Thermo C18 4.6*150mm 5um流速：1ml/min检测波长：326nm柱温：40℃流动相A:超纯水流动相B:甲醇进样量：20ul 时间 流动相A（%） 流动相B（%） 0 5 95 10 5 95 标准品制备：取一粒维生素A 软胶囊1.5mg溶于25ml甲醇中，超声半小时使之溶解，0.45um有机滤膜过滤后得标准样品，浓度为0.06 mg/ml。所得谱图如下：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/01/201301101241_419544_1444635_3.jpg本实验采用反相高效液相色谱法进行测定，出峰时间4.64min，与文献参考值一致。

[b][font=宋体]解答：[/font][/b][font=宋体]维生素主要分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类，基本都可以用液相色谱法检测，下面分别进行介绍。[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）水溶性维生素的检测[/font][font=宋体]由于水溶性维生素（主要是[/font]B[font=宋体]族维生素和维生素[/font]C[font=宋体]）易溶于水，极性较强，很难直接在如[/font]C[sub]18[/sub][font=宋体]等反相柱上保留。因此该类物质分析一般有两种方式：一是用含[/font]NH[sub]2[/sub][font=宋体]等极性键合相的正相色谱柱，如图[/font]6-24[font=宋体]的[/font]HILLIC[font=宋体]模式；二是在反相色谱（如[/font]C[sub]18[/sub][font=宋体]、[/font]C[sub]8[/sub][font=宋体]等）流动相中添加离子对缓冲试剂（如[/font]Na[sub]3[/sub]PO[sub]4[/sub][font=宋体]、[/font]KH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub][font=宋体]、己烷磺酸盐等）增加其保留时间，见图[/font]6-25[font=宋体]。[/font][align=center][img=,465,269]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/03/202103231425192145_3285_3389662_3.jpg!w465x269.jpg[/img][/align][align=center][i][font=宋体]图[/font]6-24 HILIC[font=宋体]模式色谱柱分离水溶性维生素的色谱图[/font][/i][/align][align=center][i]1—[font=宋体]烟酰胺；[/font]2—[font=宋体]维生素[/font]B[sub]7[/sub][font=宋体]；[/font]3—[font=宋体]维生素[/font]B[sub]6[/sub][font=宋体]；[/font]4—[font=宋体]维生素[/font]C[font=宋体]；[/font]5—[font=宋体]维生素[/font]B[sub]12[/sub][font=宋体]；[/font]6—[font=宋体]维生素[/font]B[sub]1[/sub][/i][/align][align=center][img=,428,242]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/03/202103231425367458_9741_3389662_3.jpg!w428x242.jpg[/img][/align][align=center][i][font=宋体]图[/font]6-25 C18[font=宋体]柱分离水溶性维生素色谱图[/font][/i][/align][align=center][i]1—[font=宋体]维生素[/font]B[sub]1[/sub][font=宋体]；[/font]2—[font=宋体]维生素[/font]C[font=宋体]；[/font]3—[font=宋体]烟酸；[/font]4—[font=宋体]维生素[/font]B[sub]6[/sub][font=宋体]；[/font]5—[font=宋体]泛酸；[/font]6—[font=宋体]叶酸；[/font]7—[font=宋体]维生素[/font]B[sub]12[/sub][font=宋体]；[/font]8—[font=宋体]维生素[/font]B[sub]2[/sub][/i][/align][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）脂溶性维生素的[/font]HPLC[font=宋体]检测[/font][font=宋体]脂溶性维生素（维生素[/font]A[font=宋体]、[/font]D[font=宋体]、[/font]E[font=宋体]等）极性较弱，可以直接用[/font]C[sub]18[/sub][font=宋体]、[/font]C[sub]8[/sub][font=宋体]等反相色谱柱分离。需要注意的是，维生素[/font]E[font=宋体]（生育酚）共有[/font]α[font=宋体]、[/font]β[font=宋体]、[/font]γ[font=宋体]、[/font]δ[font=宋体]四种结构类型，[/font]C[sub]18[/sub][font=宋体]等反相柱很难将这四种完全分开，而硅胶、二醇基（[/font]Diol[font=宋体]）等正相柱能很好地分离这四种结构，见图[/font]6-26[font=宋体]。[/font][align=center][img=,403,187]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/03/202103231425477785_8072_3389662_3.jpg!w403x187.jpg[/img][/align][align=center][i][font=宋体]图[/font]6-26[font=宋体]维生素[/font]E[font=宋体]在二醇基色谱柱上的色谱图[/font][/i][/align][align=center][i]1—α-[font=宋体]维生素[/font]E[font=宋体]；[/font]2—β-[font=宋体]维生素[/font]E[font=宋体]；[/font]3—γ-[font=宋体]维生素[/font]E[font=宋体]；[/font]4—δ-[font=宋体]维生素[/font]E[/i][/align][font='微软雅黑','sans-serif'][color=black][back=white]领取更多《实战宝典》请进：[url]http://instrument-vip.mikecrm.com/2bbmrpI[/url][/back][/color][/font][font='微软雅黑','sans-serif'][color=black][back=white] [/back][/color][/font]

大佬们有用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相[/color][/url]检测维生素c的吗，有啥好的的方法呀，本人用安捷伦Agilent TC-C18（2）[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]柱250mm*4.6mm，流动相为磷酸二氢钾（A）和甲醇(B)作为流动相，流速为1，图一条件为25°，A:B=90:10,图2为[color=#333333]30°，A:B=90:10,[color=#333333]图3为[size=20px]20°，A:B=90:10，图4为25°，A:B=80:20，试了温度和流动相比例，感觉效果不好，一直有前沿峰，不知道是不是流动相ph的关系呀，初始A的ph为4.45左右，我看有些文章里维生素c的盐溶液ph都蛮低的，在2左右，这个前沿峰是因为ph的原因吗，还有我想让出峰时间晚一点，减低了A的比例，却出现了图4的峰，原因可能是啥？[img=图1,690,920]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/03/202303211909551625_6673_5627976_3.jpg!w690x920.jpg[/img][img=图2,690,920]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/03/202303211910180600_1814_5627976_3.jpg!w690x920.jpg[/img][img=图3,690,920]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/03/202303211910365461_6908_5627976_3.jpg!w690x920.jpg[/img][img=图4,690,920]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/03/202303211910526759_7988_5627976_3.jpg!w690x920.jpg[/img][/size][/color][/color]