甲基环戊二烯二聚体

Part 1研究背景在生物化学中，蛋白质二聚体是由两个蛋白质单体或单个蛋白质形成的大分子复合物，它们通常是非共价结合的。蛋白质二聚体是一种蛋白质四级结构。有些蛋白需形成同源或者异源二聚体才能发挥其特定的功能，且不同聚集体的亚型与不同靶蛋白特异性结合，如14-3-3蛋白。对聚集体的状态维持和解离研究能更加清楚的了解生物学过程，并且开发特异性的靶标药物，用于疾病的治疗。由于聚集体是蛋白的四级结构组成部分，因此，一般来检测聚集体的亲和力需要先形成蛋白单体，也就是极低的蛋白浓度，对于很多互作方法来说无法实现检测。下方这篇Cell文献介绍了MST成功检测蛋白的二聚体亲和力以及小分子对聚集过程的影响。Part 2研究内容美国斯坦福大学Paul A. Khavari小组使用葡萄糖解聚DDX21二聚体来调节mRNA剪接和组织分化。2023年1月出版的《Cell》杂志发表了这项成果。https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.004IF: 64.5 Q1葡萄糖是一种普遍的生物能量来源，此外，研究发现，葡萄糖可能重塑分化所需蛋白质的功能，使分化过程得以实现。DDX21是一种DEAD-box RNA解旋酶，为同源二聚体状态，DDX21调节黑素细胞干细胞的分化。然而，DDX21在表皮分化中的功能尚未不清晰。在该研究中，作者发现，葡萄糖结合DDX21的ATP结合域，改变其构象，进而造成DDX21解离。在分化过程中，DDX21以葡萄糖依赖的方式定位于mRNA内含子中特定的模体，并促进关键的促分化基因的剪接。为了更清楚地了解葡萄糖对DDX21二聚化的影响，作者需检测（不）结合葡萄糖时DDX21二聚体亲和力。MST技术上机检测的浓度可以低至pM-nM，保证DDX21为单体状态，进而获得准确的二聚体亲和力结果。此外，MST对缓冲成分没有要求，并且是检测达到平衡状态时的亲和力。因此，可以将葡萄糖作为缓冲成分加入到体系中，并且使葡萄糖和DDX21达到平衡后再进行检测。MST亲和力结果表明，葡萄糖显著抑制DDX21二聚化（降低了近7倍）。图1：微量热泳动（MST）检测DDX21的二聚化（黑色）以及存在350uM葡萄糖（红色）或者半乳糖（蓝色）时亲和力。Part 3技术优势在这篇工作中，通过MST技术确定了DDX21形成二聚体的亲和力，以及葡萄糖与DDX21的作用。对于分子互作亲和力的检测，MST上机浓度极低，保证蛋白的单一状态，同时节省样本。当检测多个分子互作时，可以孵育达到平衡，获得准确的多元的亲和力。

近日，中国科学院大连化学物理研究所生物分离分析新材料与新技术研究组研究员叶明亮团队和上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心研究员刘聪团队合作，将硼酸化学引入到甲基化蛋白质组分析方法中，并巧妙利用精氨酸残基上不同修饰基团的位阻差异，实现高效的精氨酸二甲基化肽段富集，显著提高了蛋白质甲基化的分析能力；利用此新方法，系统分析了蛋白质分相过程中精氨酸二甲基化的变化，揭示了此类修饰的发生会降低蛋白质的分相能力。　　蛋白质精氨酸甲基化是一种调控蛋白质功能的重要翻译后修饰，与较多疾病的发生发展相关。研究表明，精氨酸二甲基化会影响一些神经退行性疾病相关蛋白的液-液相分离，以及相分离所驱动的无膜细胞器的产生。然而，受限于目前精氨酸二甲基化蛋白质组分析技术覆盖率不足，这类研究仅聚焦于少数几个蛋白，尚未系统性探究精氨酸甲基化对蛋白质相分离的影响。　　本研究发现，不同甲基化修饰的精氨酸残基在与邻二酮类化合物反应时，由于位阻不同，反应活性差异巨大。合作团队据此设计了一种精氨酸二甲基化肽段的富集方法：先利用环己二酮选择性的封闭无修饰精氨酸残基，随后利用丙酮醛选择性的在二甲基化精氨酸残基上修饰顺式邻二羟基，从而使得硼酸材料可以选择性的富集精氨酸二甲基化肽段。相比传统的免疫亲和富集方法，该方法拥有较强的精氨酸二甲基化肽段富集能力，特别是在鉴定RG/RGG序列上的精氨酸二甲基化位点方面有更高的灵敏度。合作团队将该方法应用于分析蛋白质相分离过程中精氨酸甲基化的变化，发现包括G3BP1，FUS，hnRNPA1、KHDRBS1在内的一些与无膜细胞器或神经退行性疾病相关的蛋白质上的精氨酸二甲基化程度发生了显著变化；系列实验验证发现，精氨酸甲基化会显著降低这些蛋白质的分相能力，且上述蛋白质组分析中鉴定到变化的甲基化位点是调控蛋白质相分离的关键因素。本工作开发了基于化学反应的精氨酸二甲基化蛋白质组分析方法，并利用这一方法揭示了精氨酸二甲基化对蛋白质液-液相分离具有重要的调控作用。　　叶明亮团队致力于蛋白质磷酸化、糖基化、甲基化等翻译后修饰分析新方法的研究，发展了基于可逆酶促化学标记的O-GlcNAc糖肽无痕富集方法，克服了标记基团对糖肽质谱检测的干扰，实现了O-GlcNAc糖基化的高灵敏分析（Angew. Chem. Int. Edit.）；利用不同糖肽的同一肽段骨架具有相似碎裂规律的特点，发展出基于“模式识别”的肽段序列鉴定新方法，实现了谱图拓展，显著提高了N-链接位点特异性糖型的鉴定灵敏度，并可发现未知的糖链及糖链修饰（Nat. Commun.）。　　相关研究成果以Global profiling of arginine dimethylation in regulating protein phase separation by a steric effect-based chemical-enrichment method为题，发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、大连化物所创新基金等的支持。

测定N-二甲基亚硝胺的新标准！本次标准更新，新增了QuEChERS法测定，Detelogy带你一起解读！亚硝酸盐广泛存在于食品之中，很容易与胺化合，生成亚硝胺。亚硝胺与苯并(α)芘、黄曲霉素是世界公认的三大强致癌物质。N-二甲基亚硝胺是N-亚硝胺类化合物的一种，食品中天然存在的N-亚硝胺类化合物含量极微，但其前体物质亚硝酸盐和胺类广泛存在于自然界中，在适宜的条件下可以形成N-亚硝胺类化合物。N-二甲基亚硝胺是国际公认的毒性较大的污染物，具有肝毒性和致癌性。N-二甲基亚硝胺在啤酒、肉制品及鱼类腌制品等食品和环境中广泛存在。肉制品加工过程中会使用亚硝酸盐添加剂，使其产生理想的粉红色，增加风味，且还具有抗氧化的效果。但是，亚硝酸盐在腌肉中可以转化为亚硝酸，极易反应生成致癌性物质：N-亚硝胺类化合物；水产品腌制过程中使用的粗盐通常含有硝酸盐、亚硝酸盐，加上微生物能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，从而蓄积亚硝酸盐。在适宜的条件下，亚硝酸盐与胺类发生亚硝基化作用，最终生成N-二甲基亚硝胺。2023年9月25日，国家卫生健康委员会发布了85项食品安全国家标准和3项修改单（卫健委2023年第6号公告），其中就有GB 5009.26-2023《食品中N-亚硝胺类化合物的测定》。此次更新，大家的目光都聚焦在新增的第二法：QuEChERS-气相色谱-质谱/质谱法上，相比起其他实验方法，不仅精简了实验设备，在一定程度上也加快了实验的效率。下面一起来看看！实 验 步 骤 提 取 干制品称取5g于50mL离心管，加入5mL水，振荡混匀（鲜样品称取10g置于50 mL离心管中），加入N-二甲基亚硝胺内标中间液(1μg/mL)50μL，向其准确加入10mL乙腈，MultiVortex多样品涡旋混合器调节3000rpm，涡旋振荡2min后置于-20℃冰箱冷冻20min，取出后加入陶瓷研磨珠1粒以及4g硫酸镁和1g氯化钠，放入MGS-24高通量智能动植物研磨均质仪振荡2min，置于冷冻离心机中，转速9000r/min,10℃离心5min，上清液待净化。 净 化 称取150mgPLS-A粉末(或1g增强型脂质去除EMR-Lipid萃取粉剂或同级品)于15mL离心管中，加入5mL水于MultiVortex多样品涡旋混合器涡旋振荡，立即加入5mL待净化上清液涡旋振荡1min，置于冷冻离心机，9000r/min，10℃离心5min，待除水。 除 水 称取1.6g硫酸镁和0.4g氯化钠于另一15mL离心管，加入上述待除水净化液于MultiVortex多样品涡旋混合器涡旋振荡2min，置于冷冻离心机中，转速9000r/min，10℃离心5min。取上层有机相经0.22μm微孔滤膜过滤后。上机测定。“PreferenceDetelogy优选仪器