羧基荧光素琥珀酰亚胺醚

聚酰亚胺是一种高性能塑料，通常是热塑性的，有时也可以发生固化。聚酰亚胺具有非常高的力学性能、化学稳定性和热稳定性，常用在复杂的应用场合，比如替代金属和玻璃，作为耐高温材料、耐润滑油、汽油、耐化学腐蚀材料等。有些应用场合需要对聚酰亚胺树脂的固化温度和时间有着充分的了解。测试条件：温度范围：30...300°C传感器：IDEX，梳妆结构，电极间距115μm升降温速率：2、10、20K/min测试气氛：空气频率：10KHz结果讨论：图1 固化过程的离子粘度变化图2 固化动力学模型拟合在测试起始阶段，由于温度升高样品软化造成离子粘度略微降低，随后样品开始固化离子粘度开始升高。中途离子粘度有短暂的下降，之后又继续升高，这表明样品存在二步固化反应，最终固化后的离子粘度相比于初始阶段增加了4个数量级（图1）。使用Thermokinetics软件对三次不同升温速率下的测试数据计算得到动力学模型。此处树脂固化模型为三步连续反应：A→B→C→D，且每步反应都是自催化反应，模型拟合与测量数据之间的相关系数高达0.999（图2）。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal. Chem.上的文章，Alkynyl -Enrichable Carboxyl-Selective Crosslinkers to Increase the Crosslinking Coverage for Deciphering Protein Structures，该文章的通讯作者是中国科学院大连化学物理研究所的赵群和张丽华研究员。化学交联结合质谱技术 (CXMS) 的交联覆盖范围对于决定其破译蛋白质的结构的能力具有重要意义。目前，交联质谱技术中最常用的交联剂的类型为针对赖氨酸侧链的N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯基交联剂。然而，此种交联剂存在一定的局限性，尤其是对于含有赖氨酸数目较少的蛋白质；其他类型的氨基酸残基，如羧基等，也可以进行交联反应，以补充赖氨酸残基的局限性并提高 CXMS 的交联覆盖率，然而，羧基的低固有化学反应活性损害了羧基选择性交联剂在复杂样品中的应用。鉴于此，本文开发了三种具有不同反应基团（如酰肼、氨基和氨氧基）的富含炔基的羧基选择性交联剂，以此提高针对酸性残基的交联效率并实现复杂样品的深入交联分析。文章要点：（1）本工作系统地评估了三种交联剂的交联效率，给出了氨基功能化交联剂 BAP 的最佳反应性。此外，结合BAP交联剂于高效的交联富集策略对大肠杆菌裂解物进行交联分析。在 ≤1% 的错误发现率 (FDR) 下，共鉴定出 392 种蛋白质中涉及到的 1291 个 D/E-D/E 交联。（2） 研究结果显示，BAP 与赖氨酸靶向交联剂具有明显的结构互补性，这提高了CXMS 进行蛋白质结构解析的能力。本工作是羧基选择性交联剂首次实现全细胞裂解物的全蛋白质组交联分析。总的来说，这项工作不仅扩展了一个针对酸性残基的十分具有前途的 CXMS 工具包，同时还为提高羧基选择性交联剂的性能提供了有价值的指导。图1 三种交联剂BHP、BAP和BOP的化学性质。(A) 三功能交联剂的化学结构：两个反应性基团用红色表示，一个可修饰的手柄用橙色表示。三种交联剂的Cα原子之间的最大距离约束利用软件Chem3D 19.0计算得出。(B) 利用软件pLink 2.0分析三种交联剂与蛋白质进行交联质谱实验的MS/MS谱。(C) 三种交联剂的反应效率直方图。(D) 酰胺化反应的机理。图2 三种交联剂BHP、BAP和BOP在BSA蛋白质、六蛋白混合物和E. coli 70S ribosome结构分析中的性能。(A) 三种交联剂与BSA的反应中鉴定出的交联的维恩图。(B) 交联的Cα−Cα 距离分布的直方图，通过映射到BSA的晶体结构来验证。(C) BSA中交联残基分布的二维 (2D) 热图。颜色插入表示交联的距离分布。(D) 六蛋白混合物的环形二维交联图。黑线表示蛋白质内的交联，红线表示蛋白质间的交联。(E) 将交联映射到TXN2 (UniProtID：Q99757，PDB：1W4V)、CA2 (UniProtID：P00921，PDB：6SKS)和E. coli 70S ribosome (PDB：5KCS)的X射线晶体结构上，由BAP（红线）和BSP（黄线）鉴定。图3 基于BAP的交联平台，用于大肠杆菌裂解液的全蛋白质组分析，包括蛋白质复合物交联、点击化学、链霉亲和素富集、分馏和LC-MS/MS分析。图4 通过BAP对大肠杆菌裂解液的全蛋白质组分析。(A)富集前后鉴定的谱图数目的比较。黑色和红色分别对应于常规肽和交联肽的谱图。(B)将由BAP（红线）和BSP（黄线）鉴定的交联映射到蛋白质的X射线晶体结构上。(C)将交联映射到由BAP专门鉴定的蛋白质的X射线晶体结构上。 (D)使用Xplor-NIH软件包对hns (UniProtID：P0ACFID) 和grcA (UniProtID：P68066) 的AF2预测结构进行细化。用BAP和BSP鉴定出的交联分别用红色和黄色标记。在本工作中，作者开发并表征了三种新的可富集的羧基选择性交联剂，它们具有不同的反应基团酰肼、氨基和氨基氧基。其中，氨基功能化交联剂 BAP 对于所有不同复杂度的蛋白质样品均表现出最佳的交联反应活性和鉴定覆盖率。此外，BAP扩展到大肠杆菌裂解液的交联分析与高效的交联富集相结合。本工作首次使用羧基选择性交联剂，以实现全细胞裂解液的全蛋白质组范围内的交联分析。因此，以上所有结果表明，本工作开发的 BAP 是一个很有前途的工具包，可以提高蛋白质结构分析的交联覆盖率。此外，本项工作还可以为提高羧基选择性交联剂的性能提供有价值的指导。参考文献：Gao H, Zhao Q, Gong Z, et al. Alkynyl-Enrichable Carboxyl-Selective Crosslinkers to Increase the Crosslinking Coverage for Deciphering Protein Structures [published online ahead of print, 2022 Aug 29]. Anal Chem.2022 10.1021/acs.analchem.2c02205. doi:10.1021/acs.analchem.2c02205

脂质体及聚合物作为纳米药物的常用载体，在药物合成方面已取得了巨大的成功，但在靶向递送方面，仍存在着诸多挑战，纳米药物该如何实现靶向递送呢？在谈论靶向之前，先要了解一个关键的药理学概念，以器官靶向为例：器官靶向药物输送不是将所有给药剂量都输送到目标器官，而是提供足够的剂量以达到所需的生物效果，同时限制脱靶积累的毒性；即使大部分注射剂量没有到达目标器官，也应该足以引起生理效应并为患者提供益处。靶向方式分类纳米药物靶向的方式多种多样，总的来讲，可以分为三大类（如图1）。图1. 靶向方式归类图被动靶向被动靶向依赖于调整纳米颗粒的物理性质，如大小、形状、硬度和表面电荷，使其与解剖学及生理学相结合。例如，调节纳米颗粒的大小可以确定纳米颗粒从不连续的血管（如肝脏和脾脏中的血管）外渗的趋势。主动靶向主动靶向包括用化学或生物的方法修饰纳米颗粒的表面，使其特异性地与靶器官高度表达的受体或其他细胞因子相结合。例如，用单克隆抗体修饰纳米颗粒，以使核酸传递到难以转染的免疫细胞中。内源性靶向内源性靶向包括设计纳米颗粒的组成，使其在注射时与血浆蛋白的一个不同的亚群结合，从而将其引导到目标器官并促进特定细胞的摄取。例如，参与体内胆固醇运输的蛋白质已被证明是脂质纳米颗粒有效的肝细胞传递所必需的。对比而言，被动靶向和内源性靶向的设计度与可控性相对较低，主动靶向自然成为了靶向递送的研究焦点。在肝外靶向的研究中，就涉及了较多的主动性靶向，表1也列出了多种肝外给药的纳米颗粒组合物。表1. 用于肝外给药的纳米颗粒组合物靶向修饰方法药物靶向本质上为官能团之间的相互作用，即纳米药物表面的核心基团与受体部位的基团进行化学结合。以脂质纳米颗粒为例，载体组分中的PEG脂质多位于颗粒表面且本身易于修饰，因此，可以在PEG脂质上加载受体部位的结合基团以实现靶向目的。以下列举了几种常见的PEG脂质修饰方法。马来酰亚胺修饰使用DSPE-PEG2000-马来酰亚胺作为功能化PEG脂质，替换LNP中一定摩尔量的聚乙二醇脂质，通过其取代的羧基端半胱氨酸直接与肽偶联，可以形成肽靶向的纳米粒子。再如SS-31，一种线粒体靶向的四肽，具有巯基，只需与马来酰亚胺标记的脂质纳米颗粒孵育，即可进行硫酰马来酰亚胺偶联。NHS修饰NHS酯通常用于标记胺基生物分子。NHS酯与胺基的反应具有pH依赖性，结合的较佳pH值与生理环境的pH值相同。使用DMG-PEG-COOH-NHS作为功能化PEG脂质，替换LNP中一定摩尔量的聚乙二醇脂质，通过在C端添加赖氨酸修饰MH42，并通过其侧链的伯胺偶联，可以形成肽靶向的纳米粒子。同样，许多具有胺基的抗体和靶向肽也可通过该反应偶联到脂质纳米颗粒上：乳铁蛋白可特异性结合活化的结肠巨噬细胞上的LRP-1，实现细胞靶向抗炎治疗；还有较为熟知的程序性死亡配体1单克隆抗体的应用。氨基修饰氨基有利于醛酮分子的化学选择性附着。甘露聚糖还原端醛基与氨基羧基修饰的脂质之间肟偶联反应的正交特性保证了脂质纳米颗粒表面多糖分子的取向。甘露聚糖受体靶向脂质体既可以作为抗菌药物递送的载体，也可以作为用于免疫治疗的重组疫苗的载体。DBCO修饰DBCO标记可促进巯基-炔反应，并可选择性偶联荧光探针、亲和标记和细胞毒性药物分子。例如，抗体scFv-N3可被有效地偶联到DBCO修饰的脂质纳米颗粒上。研究发现，抗体修饰的脂质纳米颗粒可穿越血脑屏障，并诱导脑特异性积累，以治疗中枢神经系统疾病。结论：人体复杂的生化环境给纳米药物的靶向递送制造了诸多阻力。在实际探索中，被动靶向，主动靶向和内源性靶向，可作为靶向设计的联合工具，在寻找绝对的靶向位点、真实的靶向机理与达到实际的靶向效果之间寻求平衡。在此当中，主动性靶向的尝试值得支持，正如文中所讲PEG脂质的各种修饰方式，大量的设计性尝试定能排除越来越多的靶向干扰因素，朝靶向机理的挖掘处更深一步。参考文献：1. Menon, Ipshita et al. “Fabrication of active targeting lipid nanoparticles: Challenges and perspectives.” Materials Today Advances (2022): n. pag.2. Dilliard, S.A., Siegwart, D.J. Passive, active and endogenous organ-targeted lipid and polymer nanoparticles for delivery of genetic drugs. Nat Rev Mater (2023).3. Herrera-Barrera, Marco et al. “Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates.” Science Advances 9 (2023): n. pag.应用范围:纳米药物制备系统: