疏水层析介质

请教：疏水层析和反相层析相比对蛋白质吸附能力较弱？？原文大意如下——疏水等系和反相层析的原理都是利用疏水作用分离蛋白质、多肽的但是二者使用的介质和流动相有一定的差别其中疏水层析介质的极性反相层析介质的极性所以疏水层析的介质对于蛋白质的吸附能力较弱 可以使用温和的盐水就可以洗脱但是反相层级的介质极性较弱 需要更强的有机溶剂洗脱之【问题是——蛋白质应该是水溶性的啊？ 应该是和极性更强的疏水层析介质接近 继而疏水层析介质对蛋白质的吸附能力更强？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？】 [em0808]

请教凝胶层析介质biogel P系列和superdex 30 的区别我想请教一下各位高手，我想分离分子量在一万以内的几个寡糖，想用凝胶层析分离，用bio gel P 系列还是用superdex 30 效果更好呢？这两种凝胶层析介质各有什么特点吗。还请大家多多指教。

[font=宋体]层析法无疑是下游处理中主要和常用的操作，因为层析法相比其他单元操作具有某些优势。例如层析法支持高分辨率的效率，可以分离分子性质非常相似的复杂粗制混合物。此外，层析法是生物工艺中遇到的稀释溶液中捕获分子的理想选择。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]柱色谱法[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]层析法[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]的原理是将一个大的蛋白池分离成许多小的蛋白池，其中一些富集了目标蛋白。虽然柱色谱法有昂贵的专业设备，但只需要基本的设备就可以了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在所有色谱技术中，亲和层析法占主要地位。事实上，亲和层析是最特异、最有效的蛋白纯化技术，为靶蛋白纯化提供了合理的依据。它利用了生物分子识别的原理，即生物活性大分子与亲和配体形成特定的可逆复合物的能力。随着高价值蛋白的传统纯化方案被基于亲和色谱等先进的方法所取代，人们的关注重点转向了设计和选择具有高亲和力和特异性的配体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]从用于生化表征的浓缩蛋白提取物的制备到治疗性重组蛋白的大规模生产，任何纯化过程都需要经济且足量地获得纯化蛋白。因此，下游处理面临的挑战是高产能、高分辨率和高成本效率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法适用于基于高特异性相互作用的生化混合物的分离。在纯化过程中可以利用具有明确特性的靶蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析法[/b][/url]是一种常见的蛋白纯化方法，该方法基于与离子交换器的亲和力分离离子和极性分子。可溶性分子在通过色谱柱时与带相反电荷的不溶性固定相结合。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]尺寸排阻色谱法，根据分子的大小和分子量分离分子。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]疏水作用层析分离表面有疏水氨基酸侧链的靶蛋白，与疏水基团相互作用并结合在一起。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白纯化的原理为：不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异，即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]等分开，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，[b]常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]凝胶过滤层析[/b][/font][font=宋体]凝胶过滤（也叫排阻层析或分子筛）是一种根据分子大小从混合物中分离蛋白质的方法。不同蛋白的形状及分子大小存在差异，在混合物通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于各种蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异，大的蛋白分子会被先洗脱出来，分子越小，越晚洗脱，从而达到分离蛋白的目的。一般来说，凝胶过滤层析柱越细、越长纯化的效果越好。凝胶过滤层析详细介绍[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析所能纯化的蛋白分子量范围很宽，纯化过程中也不需要能引起蛋白变性的有机溶剂。缺点是所用树脂有轻度的亲水性，电荷密度较高的蛋白容易吸附在上面，不适宜纯化电荷密度较高的蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析[/b][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析是一种依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离纯化的技术。蛋白表面通常会带有一定的电荷，电荷的氨基酸残基均匀地分布在蛋白质的表面，在一定条件下可以与阳离子交换柱或阴离子交换柱结合。这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而达到分离的效果。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析[/b][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化[/b][/url]是利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性进行蛋白纯化的技术。该方法适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合中提纯目标物，具有分离效果好、分离条件温和、结合效率高、分离速度快的优点。亲和层析技术可以利用配基与生物分子间的特异性吸附来分离蛋白，也可以在蛋白上加入标签，利用标签与配基之间的特异性结合来纯化蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]疏水作用层析[/b][/font][font=宋体][font=宋体]疏水作用层析是利用盐[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]水体系中样品分子的疏水基团和层析介质的疏水配基之间疏水力的不同而进行分离的一种层析方法。该法利用了蛋白的疏水性，蛋白经变性处理或处于高盐环境下疏水残基会暴露于蛋白表面，不同蛋白疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱不同，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水用作由弱至强的组分分离。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]

简介：生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。内容：1.测定------分子量、PI 当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。 2.选择------层析方法 若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：一 使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。二 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。三 体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。3.纯化------大量粗品 处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。 4.纯化------硫酸氨样品 硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。5.纯水-----糖类分子 固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。6.纯化------膜蛋白 膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。7.纯化------单抗、抗原 *单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。*疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。*纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。*HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY。8.纯化------重组蛋白 重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。一 GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 6 FF纯化。二 含组氨酸标记（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金属，在一般或变性条件（8M尿素）下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。9.纯化------包涵体蛋白 包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学稳定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收率明显提高。

生物分子下游纯化的对象一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等。纯化前首先需要测定生物分子的各物理和化学特性，然后通过实验选择出最有效的纯化流程。 1.测定------分子量、PI 当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。 2.选择------层析方法 若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法： 一] 使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。 二] 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。 三] 体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。 3.纯化------大量粗品 处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。 4.纯化------硫酸氨样品 硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，需先用Sephadex G-25脱盐。疏水层析是较新技术，随着介质种类不断增多，渐被融入各生产工艺中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其它吸附性层析。 5.纯水-----糖类分子 固化外源凝订素如刀豆球蛋白、花生、大麦等凝集素，可结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组份、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。两种附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，专为俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。 6.纯化------膜蛋白 膜蛋白分离常使用去污剂以保持其活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白相反电荷者，避免在作离子交换时和目标蛋白竞争交换介质，籍此除去去污剂。非离子性去污剂可以疏水层析除去。 7.纯化------单抗、抗原 *单抗多为IgG。来源主要是腹水和融合瘤培养上清液。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Mabselect、Protein G和Protein A对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步纯化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质Mabselect和rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的载量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。 *疏水层析Phenyl Sepharose HP亦很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。 *纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。 *HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY。 8.纯化------重组蛋白 重组蛋白在设计、构建时应已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合做粗分离。Amersham biosciences提供三个快速表达、一步纯化的融合系统。 一] GST融合载体使要表达的蛋白和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和层析纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。 2． 蛋白A融合载体使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 6 FF纯化。 二] 含组氨酸标记（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金属，在一般或变性条件（8M尿素）下透过组氨酸螯合融合蛋白。HisTrap试剂盒提供整套His-Tag蛋白的纯化方法。 9.纯化------包涵体蛋白 包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或8M尿素中。高化学稳定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白需要复性至蛋白的天然构象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高，复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收率明显提高。 10.包涵体蛋白固相复性 *近年许多文献报导将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用各种Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白质聚体的形成，所以复性得率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。 *固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用，比一般试剂盒更方便、耐用。 11.纯化------中草药有效成分 中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用，有效成份多较为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛功能，例：如用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。 *生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。 *一般多糖纯化大多使用分子筛如Sephadex，Sephacryl。若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可选择新一代的Superdex。一般植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组份纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需反复数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。SOURCE5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SOURCE反相层析可用范围为PH1-14 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。

[font=宋体][b]离子交换层析基本原理：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法是蛋白纯化的一种方式，通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换，从而达到分离纯化的目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法主要依据电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法的应用很广泛。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析的介质：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]有许多离子交换介质都已经商品化，但不存在一种神奇的介质其最适合各种蛋白质的纯化。选择离子交换介质的标准包括应用的特异性需要、样品成分的等电点和分子大小（即目的蛋白和污染物），以及可得到的装备（如泵和柱子）。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]首先需要选择阴离子或阳离子介质，如果目的蛋白的等电点已知，选择阴离子介质且操作的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]高于目的蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]，或选择阳离子介质且操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]低于目的蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]。如果靶蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]未知，开始之前最好先测定它。最佳操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]可根据经验确定。因为大多数蛋白质的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]低于[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体]，选择阴离子交换和操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]为[/font][font=Calibri]8.5[/font][font=宋体]开始是合理的，然后根据估计结果和优化条件。知道蛋白质溶液中污染物[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]和结合特征也是有用的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析应用：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析法是生物纯化中应用最广泛的色谱模式，应用于大多数下游处理平台。在[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]中结合目标蛋白、洗脱柱子和洗脱目标蛋白的典型方案被称为“结合[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]洗脱模式”，经常应用于中间纯化步骤如抗体的下游处理。阴离子交换层析是大多数血浆蛋白纯化平台的组成部分如凝血因子[/font][font=Calibri]VIII[/font][font=宋体]的纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]离子交换层析（[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]）具体操作步骤：[/font][/b][/font][font=宋体]平衡[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]第一步是固定相的平衡。当达到平衡时，所有的固定相带电基团都与可交换的平衡离子结合，如氯或钠。选择起始缓冲液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]和离子强度，以确保目标蛋白与介质的结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]上样和清洗[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第二步的目标是结合目标分子，并清洗出所有未结合的物质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]洗脱[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]随着离子强度的增加，在选定的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下净电荷最低的蛋白将最先从柱子上洗脱。同样地，在一定[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下电荷最高的蛋白被保留得最牢固，并且在最后被洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]再生[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]最后用高离子强度的缓冲液进行最后一次清洗，使色谱柱再生，并去除任何仍结合的分子。然后在开始下一次运行之前，色谱柱需要在起始缓冲液中重新平衡。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font]

上世纪60、70年代是色谱/层析技术快速发展的时代，首先是层析介质有了飞速的发展，各种人工合成的介质出现，如硅胶、聚苯乙烯二乙烯基树脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等树脂或凝胶的出现，极大地拓展了层析技术的应用领域和范围，基于不同介质的层析方法也如雨后春笋般不断涌现。如Bio-Rad公司于上世纪50年初推出的分析级离子交换树脂AG系列，广泛用于各种分子物质的分离纯化，包括无机离子、有机酸、核酸以及糖类等。值得一提的是，上世纪4、50年代正是DNA、RNA研究如火如 荼的时期，而Bio-Rad推出的AG系列树脂在核酸纯化方面具有极其出色表现，受到众多研究人员的欢迎与好评。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734846.JPG_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734847.JPG_small.jpg Bio-Rad AG系列树脂 此外，因为马丁（Martin）和辛格（Synge）的钻研与畅想，他们的预言分别在1952年及20世纪60年代被人们所应证。而马丁（Martin）和辛格（Synge）两人也于1952年被授予诺贝尔化学奖。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734849.JPG_small.jpg Bio-Rad专家介绍：其中设想1“流动相可用气体代替液体，因为与液体相比，分离时候，物质间作用力更小，对分离也就更有好处”也就是气相色谱仪(GC)，即以气体作为流动相的色谱法，1952年诞生，目前，该法已被广泛应用于分离和分析复杂的多组分混合物。特别是挥发性物质，我们都知道挥发性物质在实验或分离时会受到干扰，而气相色谱仪的产生给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变单。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734850.JPG_small.jpg 设想2“若能够使用非常细的颗粒填料，并在色谱柱两端施加较大的压差，从而增加了理论培板数，这将会大大提高分离效率。”也就是高效液相色谱HPLC，20世纪60年代末诞生，现在高效液相色谱HPLC已成为化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可少的工具。高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：不能很好地兼容生物缓冲系统，因为HPLC系统通常采用不锈钢材质，因此具有良好的有机溶剂耐受性以及高压力承受。但是生物缓冲系统往往涉及到各种不同浓度的盐溶液，比如最常用的磷酸盐缓冲液等，而不锈钢系统不能耐受盐腐蚀，因此为了满足生物研究中样品的快速分析、分离，蛋白质快速层析技术应运而生。蛋白质快速液相层析（Fast Protein Liquid Chromatography），基于HPLC技术，但又有别于HPLC，它的主要液体接触部件均采用生物盐溶液耐受的塑料或者橡胶，这样能够极大地降低缓冲盐对系统的腐蚀，如Bio-Rad最早一代层析系统Biological LP，正是为了满足70-80年代间快速发展的生命科学领域内对未知组分、物质的分离、纯化的需求应运而生。在其诞生之初，风靡北美。下期，伯乐生命bio-rad专家将为大家带来21世纪层析法特点及先进层析系统，敬请关注！如今的色层分析法经常用于分析、分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义，但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734851.JPG_small.jpg 现在我们简称为色谱法、层析法或色谱技术、层析技术。

[font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、捕获阶段[/font][/font][font=宋体]在样品捕获阶段，通过将速度和容量进行优化组合，使样品中的目标产物被有效的分离、浓缩和稳定化处理。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]捕获阶段一般选择亲和层析，离子交换层析或者疏水层析，通过吸附作用使样品和杂质实现分离。如果样品带有标签，第一步可以选择标签蛋白亲和层析；如果样品不带有标签，可以考虑使用离子交换[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]疏水层析。由于捕获阶段一般样品量较大，杂质较多，所以捕获阶段分辨率不是特别主要考虑的因素，可以主要考虑增加上样量和速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、中度纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在中度纯化阶段，应将注意力集中于将目标样品和大多数大体积的杂质分开。在中度纯化阶段，速度不是最重要的因素，因为经过捕获阶段样品体积会缩减。中度纯化阶段一般建议使用离子交换层析或者疏水层析进一步提高样品的纯度。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、精细纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在精细纯化阶段，关注的重点就是如何达到高分辨率，从而完成最终的纯化。在此前的步骤中已经去除了大部分的污染物和杂质。如果需要达到较高的分辨率，可能会在此步骤造成一些回收率的损失。精细纯化阶段一般建议使用高分辨率的分子筛或者高分辨率的离子交换层析柱。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化优缺点：[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加 稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]

实验七 葡聚糖凝胶层析脱盐一. 目的学习凝胶层析的工作原理和操作方法掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术二. 原理凝胶层析又称凝胶过滤或排阻层析。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。1. 层析介质的特点（1）遇水为不溶解的固相；（2）是化学惰性物质；（3）离子基团含量少；（4）颗粒大小和网眼均匀；（5）机械强度较强；（6）具有可选择的多种孔径。目前使用较多的是葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶及其衍生物。尤其葡聚糖凝胶（商品名称Sephadex）是最常用的层析介质。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂1-氯-2,3-环氧丙烷（ ）交联成的具有三维结构不溶于水的高分子化合物。调节葡聚糖和交联剂配比，可以获得网眼大小不同，型号各异的凝胶。当葡聚糖分子量越小，交联剂用量越大，则交联度越大，凝胶网眼越小，吸水量越小，G值也越小。G值表示每克干胶吸水量（mL）的十倍。例如Sephadex G-25其吸水量应为2.5mL/g干胶。常用的葡聚糖凝胶有多种规格，如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。实验中选用何种型号应根据被分离的混合物分子的大小及工作目的来确定（参见附录五）。2. 分离原理当混合样液加到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱（此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）；而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。在层析柱的出口处，我们用多个试管分步收集洗脱液，就可将混合物中各组分彼此分离。当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需要进行蛋白质的脱盐工作，我们可采用层析介质为葡聚糖凝胶G-25（或G-15、G-50），用适当的洗脱剂进行洗脱，经凝胶层析，就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。三. 实验材料及设备1. 材料含硫酸铵盐的蛋白质溶液（参见附注３）2. 器材层 析 柱：内径×柱高=1.0cm×25cm滴定台架、螺丝夹：各1刻度试管：10mL×14移 液 管：1mL×1烧 杯：250mL×1 50mL×1滴 管：2洗 耳 球：2洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制1. 葡聚糖凝胶Ｇ-25(或G-15、G-50)溶胀凝胶方法：按每个层析柱约4g的量称取葡聚糖凝胶G-25于烧杯中，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或在室温下溶胀6小时以上。用倾泻法除去上层漂浮的细碎凝胶，重复3～4次。操作中避免剧烈搅拌，防止破坏其交联结构。2. BaCl2溶液（1%）3. 考马斯亮蓝G-250称取0.1g考马斯亮蓝G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。暗处存放。4. 脲（6mol/L）5. 洗脱剂应依据被纯化的蛋白质的不同特性而选用不同的缓冲液。五. 操作步骤1. 层析柱的准备(1) 清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。（若玻璃柱较脏，应卸去塑料装置，先入洗液中浸泡2小时。）(2) 安装与检查：检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱剂，打开出口螺旋夹，检查有无渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。(3) 排气泡：保持柱内一定的水位，用手指弹击柱壁，部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内，要想法排尽，否则会影响分离结果，排气完毕，保留柱内1～2cm高水位，关紧螺旋夹。(4) 标记高度：在距顶端8～10cm处做一标记，作为衡量灌装层析介质床体高度（15～17cm）的依据。2. 装柱每组用50mL烧杯取溶胀的凝胶悬浆25～30mL，静置片刻，观察凝胶沉淀与水的体积之比，约为1:1即可，否则应作调整。轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不断地向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度位于标记上方约2cm为止，凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干水和歪斜，都将影响分离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。3. 平衡取15mL洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开出水口，经洗脱液的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方保留约4cm高水位，关闭出水口。此时，胶床高度≥15cm为宜。4. 准备收集取6只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），1～6编号，并在试管2mL处作一标记，插入试管架上，为收集洗脱样品作好准备。5. 上样与收集打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，关闭出口，用滴管将0.2mL混合样液沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完毕，打开出水口，开始收集一号管。每管收集洗脱液2mL。当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位，然后排液，至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入3～5cm高的洗脱剂。6. 洗脱不断向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位3～5cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6号管达2mL时，关闭出口。7. 鉴定另取6只干净试管，按收集顺序将洗脱液一分为二，即每管1mL，依次在试管架上排成二排。第一排每管加2滴BaCl2，根据白色沉淀多少，判断SO42-在各管中的浓度。第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂，根据蓝色情况，判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。若鉴定的第6号管中，仍有样品，表明洗脱和收集不够，需增加7号、8号……试管继续洗脱与收集，同上法鉴定其蛋白质和盐浓度情况。管 号项 目1234567891011白色沉淀量蓝色深浅8. 再生鉴定完毕，打开出水口，继续用２～３倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。六. 结果处理1. 根据实验结果，在同一坐标系中，以收集的管号为横坐标，颜色深浅程度为纵坐标，绘制二条（蛋白质及(NH4)2SO4）洗脱曲线。2. 分析混合样品分离效果。七. 思考题1. 利用凝胶层析分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？2. 还有哪些方法可进行蛋白质脱盐？附注1. 凝胶的再生通常层析柱经洗脱剂再生、平衡后，就可反复使用。但使用过多次后凝胶床体积变小，流速降低，凝胶污染杂质过多，甚至变色，需经再生后才可使用。再生方法有多种：如（1）用水进行逆向冲洗，再用洗脱剂平衡，便可重新使用。又如（2）把凝胶倒出，用6mol/L脲浸泡凝胶半小时，抽滤，再用水漂洗数次，除净脲，必要时重复上述操作即可重新使用。2. 凝胶的保存(1) 湿法保存，可保存几个月至一年，有多种方法： 加入防腐剂硫柳汞，使其浓度为0.005%，下次使用前，水洗除去硫柳汞。 加入几滴氯仿，摇匀存放。下次使用前用热水浴除去氯仿。（沸点60℃）。 凝胶保存在60～70%乙醇溶液中，即凝胶以部分收缩状态保存。(2) 干法保存此法操作不及湿法简便，但处理得好，凝胶存放时间长。先抽取过量水分，再向凝胶逐步加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使凝胶逐步脱水，最后加入95%乙醇，凝胶脱手收缩。抽干，铺与搪瓷盆中，60～80℃经常翻动烘烤。若有结块，在下次膨胀时会散开的，不可用力敲碎，否则会破坏颗粒结构。3. 用盐析法分离提取麦清蛋白取10g小麦种子，粉碎。转入250mL具塞磨口锥形瓶中。加100mL蒸馏水，在康氏震荡器上震荡1小时。静置半小时，上清液以3000转/分钟离心15分钟。将上清液在布氏漏斗上（铺3～4层滤纸）抽滤。滤液应透明。用醋酸酸化滤液至pH4.7。加等体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅动，即有白色絮状沉淀生成。置冰箱过夜，使麦清蛋白全部盐析沉淀出来，以3000转/分钟离心20分钟，弃去上清夜，加10mL无离子水使沉淀溶解，即得麦清蛋白和硫酸铵的混合液。

[color=#dc143c]最近版里原创热风呼呼的刮~~于是我也特来跟风积极参与！近来一直在做包涵体的复性与纯化，就特来与大家分享，希望大家多多支持、指点[em09511][/color][b]1.包涵体的分离纯化[/b] 蛋白质的纯化是基因工程下游的关键内容，以包涵体形式表达的重组蛋白质的纯化研究一直是重组基因工程药物研究中的热点和难点。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表达体系，都可形成包涵体。蛋白表达后的分离纯化对蛋白的规模化生产也是至关重要的，所以本实验通过采用稀释复性、透析复性、离子交换层析、凝胶过滤层析等实验方法，研究探讨对分离纯化以及蛋白复性的最佳方法和条件。[b]1.2.1包涵体的复性[/b] 重组蛋白质在分离纯化的过程中, 必须维持一定的浓度和生物活性形式, 以及防止被降解。从包涵体中获得有生物活性的蛋白，需要寻找一种简单而有效的复性方法。在小规模的蛋白复性研究及其进一步的纯化中，稀释复性是最常用的方法。但是稀释复性在商业规模生产中具有一定的缺陷，如需要较大体积的复性液，以及需要附加的浓缩步骤。许多其他方法也已发展起来，例如：透析、渗透、低分子量辅助物添加复性、离子和无离子表面活性剂辅助复性、聚乙烯乙二醇辅助复性等方法。 在折叠反应中，从伸展态到中间体的速度是非常快的，只需要几毫秒，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是一个限速过程。聚集过程与复性过程相互竞争，故而应尽量避免聚集体的产生。一般认为，蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，一是分子内的疏水相互作用，可促进蛋白质正确折叠 一是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用，在复性过程中，部分折叠的中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸的顺序决定，然而伸展肤链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。[b]1.2.2包涵体离子交换层析纯化[/b] 为了获得高纯度的活性蛋白, 需要对复性的蛋白质进行进一步纯化。根据分离目标蛋白的特点(如P I、疏水性、氨基酸组成, 分子量大小、表面电荷的分布状况) , 然后确定分离方法, 从而正确选择最有效的分离介质,本实验采用SP Sepharose F.F 阳离子交换层析分离纯化重组蛋白 离子交换层析是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础的。具体说就是利用蛋白质带电性的差异,在离子吸附剂上静电吸附能力不同,用不同的pH 离子强度洗脱液洗脱,从而使蛋白质分离的柱层析方法。离子交换又分为阴离子交换和阳离子交换。离子交换剂又有强弱之分,强的离子交换剂在整个pH 范围内都是离子化的,而弱的离子交换剂通常仅在pH6～9 之间是离子化状态,因而后者对所适用的pH 范围又有了进一步的限制。 在洗脱方式上,阳离子交换主要是改变pH ,它主要应用于等电点大于5 的蛋白质。20 种氨基酸中,大部分带正电或负电,这是IEC 应用范围广的原因。离子交换层析处理量大,附载系数高,一步缩小样品体积很多。离子交换层析去除杂质能力强,如对热原质,核酸、及电荷性有差别的蛋白均可去除。它还有一个特点,利用蛋白质在不同pH 和盐浓度下带电性的不同,通过不同条件下应用同种类型或不同类型介质,分步使目标蛋白质达到提纯目的,这是除亲和柱层析外,别的柱层析达不到的分离能力。离子交换层析原则上可放在纯化工艺的任何一步,它属吸附型层析,单步损失也较大。

体积大的样品，往往使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。　　3.纯化－－－－－－大量粗品　　处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE介质，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一。提高回收率，缩短纯化周期。

目的要求（1）了解克隆基因表达的方法和意义。（2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。试剂和器材一、试剂 LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. 氨苄青霉素：100mg/mL 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 IPTG二、器材摇床，离心机，层析柱（1′10 cm）操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化1. NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60min, 4℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。3. 上清样品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。4. 洗脱杂蛋白：用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01.分步收集洗脱液，约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。5. 洗脱目标蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 级分，分别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。

[font=宋体]离子交换层析是一种在生物化学和生物技术领域中广泛使用的分离和纯化技术。它基于离子间的相互作用，特别是离子与固定在层析介质上的带电基团之间的相互作用，从而实现对混合物中不同离子的分离。以下将详细介绍离子交换层析的步骤及其作用。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、步骤[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、预处理：在开始离子交换层析之前，通常需要对样品进行预处理，以去除大颗粒杂质和不需要的成分。这通常包括离心、过滤和可能的浓缩步骤。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、选择合适的离子交换剂：离子交换剂是层析过程的核心。根据待分离离子的性质（如电荷、大小和与交换剂的亲和力）选择合适的离子交换剂。常见的离子交换剂包括阳离子交换剂和阴离子交换剂。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、平衡离子交换剂：在将样品加载到离子交换柱之前，需要用适当的平衡溶液（通常是水或盐溶液）冲洗离子交换剂，以去除可能存在的杂质并确保离子交换剂处于最佳状态。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、加载样品：将预处理过的样品加载到离子交换柱上。样品中的离子会与离子交换剂上的带电基团发生相互作用。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、洗脱：用洗脱液（通常是盐溶液，其浓度逐渐增加）将结合的离子从离子交换剂上洗脱下来。这一步骤是离子交换层析中最为关键的一步，因为它决定了不同离子之间的分离效果。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、收集和分析：收集洗脱下来的各个组分，并进行分析，以确定每个组分中包含的离子种类和浓度。常见的分析方法包括电导率测量、紫外[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]可见光谱和质谱等。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、后处理：根据需要对收集到的组分进行进一步的处理，如浓缩、脱盐或重新配制等。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]二、作用[/font][/b][font=宋体]离子交换层析在生物化学和生物技术领域有着广泛的应用，主要作用包括：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、分离和纯化蛋白质：离子交换层析可用于从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质，这对于后续的生物化学研究和药物开发至关重要。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、去除杂质：离子交换层析能够有效地去除样品中的离子杂质，提高样品的纯度。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、样品制备：在进行其他分析或实验之前，离子交换层析可用于样品的制备和预处理。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、研究蛋白质与离子的相互作用：通过离子交换层析，可以研究蛋白质与不同离子之间的相互作用和亲和力，这对于理解蛋白质的生物学功能和调控机制具有重要意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]三[/font] [font=宋体]、应用领域[/font][/font][/b][font=宋体]离子交换层析法在许多领域得到广泛应用：[/font][font=宋体]●生物制药：用于药物蛋白质的纯化，确保生物制剂的质量和稳定性。[/font][font=宋体]●生物学研究：在分离和纯化特定电荷性质的蛋白质时被广泛使用，尤其在基因表达和蛋白质互作研究中。[/font][font=宋体]●食品工业：用于提取和纯化食品中的蛋白质，改善食品的质地和口感。[/font][font=宋体]●环境监测：可用于从环境样品中分离和检测特定蛋白质，例如水体中的生物标志物。离子交换层析法凭借其良好的选择性和高效性，是生物分离和纯化领域不可或缺的重要工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体]蛋白纯化介质在研究目的蛋白的结构、功能以及相互作用过程中起着至关重要的作用。亲和层析法因其出色的选择性、结合力和分辨率，成为一种常用的蛋白和抗体纯化方法。义翘神州提供的多种亲和纯化介质，不仅简单易用，而且适用于批量操作或重力驱动的纯化过程。这些介质能够高效、便捷、可靠地分离蛋白和抗体，为下游应用提供了强有力的支持，确保实验结果的可靠性和重复性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析法的原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法是利用生物大分子与特定分子间特异性、可逆结合的特性，实现生物大分子的分离。作为蛋白质分离的有效手段，通常仅需一步操作，即可获得高纯度的蛋白质。在亲和层析中，蛋白质的分离基于其与特定配体的特异性相互作用，而非共价结合的能力。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析，又称分子筛层析法，是一种独特的蛋白质分离和纯化技术。当样本流经葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶等介质时，这些介质根据蛋白质的大小和形状进行筛选。经过这一过程，目的蛋白得以纯化，为后续的下游应用提供了高质量的原料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析操作步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在进行亲和层析时，需将蛋白在适宜的条件下加载至柱子上，确保蛋白（或标签）与其配体之间能够发生特异性结合。随后，通过洗涤步骤，清除与固定相发生非特异性结合的污染蛋白，同时保持蛋白与配体之间的特异性相互作用不受干扰。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来，采用含有竞争性分子的缓冲液进行洗脱，竞争性分子能够与配体结合，从而将目标蛋白从柱子上取代下来。这一步中，竞争分子通常会在后续的色谱流程或透析处理中予以去除。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过以上步骤，亲和层析成功实现了目标蛋白的纯化和分离，为后续的实验和应用提供了高质量的原料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情请关注：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font][font=Calibri] [/font]

层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatogram）。如图3－1 所示： 当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。前者预见了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]的产生，并在1952年诞生了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱仪[/url]，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。 层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。层析的基本理论 层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。 对于一个层析柱来说，可作如下基本假设： 1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据，一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积相等，称为板体积，以Vm表示。 2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。 3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数，与溶质在塔板的量无关。 4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程（即不连续过程）。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V时，则流动相在每个塔板上跳越的次数为n:n = 5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定，将连续的层析过程分解成了间歇的动作，这与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。层析的基本概念1. 固定相： 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。 2. 流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。3. 分配系数及迁移率（或比移值）： 分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。 K=Cs/Cm 其中Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。 迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。（Rf大于或等于1）可以看出：K增加，Rf减少；反之，会减少，Rf增加。 实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。 分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式： lnK = －(DG0/RT) 式中： K为分配系数（或平衡常数） DG0为标准自由能变化 R为气体常数 T为绝对温度 这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析时组分的DG0为负值，则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20°C, K值下降一半，它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K值相近的不同物质，可通过改变温度的方法，增大K值之间的差异，达到分离的目的。 4. 分辨率（或分离度） 分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。图3－2 是计算分辨率的示意图。 分辨率： 由上式可见，Rs值越大，两种组分分离的越好。当Rs = 1时，两组分具有教好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。 为了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法： ⑴ 使理论塔板数N增大，则Rs上升。 ① 增加柱长，N可增大，可提高分离度，但它造成分离的时间加长，洗脱液体积增大，并使洗脱峰加宽，因此不是一种特别好的办法。 ② 减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸，并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100mm；而HPLC柱子的固定相颗粒为10mm以下，且压力可达150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分离的效率大大提高了。 ③ 采用适当的流速，也可使理论塔板的高度降低，增大理论塔板数。太高或太低的流速都是不可取的。对于一个层析柱，它有一个最佳的流速。特别是对于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]，流速影响相当大。 ⑵ 改变容量因子D（固定相与流动相中溶质量的分布比）。一般是加大D，但D的数值通常不超过10，再大对提高Rs不明显，反而使洗脱的时间延长，谱带加宽。一般D限制在1 ￡ D ￡ 10，最佳范围在1.5-5之间。我们可以通过改变柱温（一般降低温度），改变流动相的性质及组成（如改变pH值，离子强度，盐浓度，有机溶剂比例等），或改变固定相体积与流动相体积之比（如用细颗粒固定相，填充的紧密与均匀些），提高D值，使分离度增大。 ⑶ 增大a（分离因子，也称选择性因子，是两组分容量因子D之比），使Rs变大。实际上，使 a 增大，就是使两种组分的分配系数差值增大。同样，我们可以通过改变固定相的性质、组成，改变流动相的性质、组成，或者改变层析的温度，使 a 发生改变。应当指出的是，温度对分辨率的影响，是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高，理论塔板高度有时会降低，有时会升高，这要根据实际情况去选择。通常，a 的变化对Rs影响最明显。 总之，影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，我们还必须考虑它的稳定性，活性等问题。如pH值、温度等都会产生较大的影响，这是生化分离绝不能忽视的。否则，我们将不能得到预期的效果。5. 正相色谱与反相色谱 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。

中文名称：层析 英文名称：chromatography 定义1：基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义2：利用某种类型的固定介质，根据混合物分子的电荷大小和分子量不同等性质，在流动相和固定相之间进行分离的一种生物化学技术。

有没有高手用过大孔树脂吸附层析法来净化样品的，我想尝试，却不知道具体的层析方法，请指点一二。非常感谢各位！

层析实验冷柜专为生化层析实验而研制的特殊用途冷柜，也可用于其他需要低温环境的实验，或用于物品冷藏。主要特点：进口制冷压缩机，工作可靠，噪音低;风冷散热方式，不需水冷却;可选多功能型配置，三层可调开放式钢架;不作层析实验亦可用于样品冷藏保存，一柜多用; 柜内空间高大，便于层析操作; 全透视双层玻璃门，具防露功能，双门锁扣可独立开启;全不锈钢内壁，清洁卫生,美观耐腐蚀; 2根层析固定立柱，2层（YC-2为3层）开放式载重托板；自带照明灯，消毒灯，上下内电源插座; 内胆全部采用优质不锈钢材料；全新改进型智能温控仪表，温度设定、测量均为数显，且设定值可加密码锁定保护;自带超温、差温报警功能 ;下设脚轮，移动方便;

http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191656_647384_2507958_3.gif层析技术的基本原理及其应用主讲人：吴云涛 默克密理博公司 工程师 活动时间：2013年8月21日 下午 14:30http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191656_647384_2507958_3.gif【简介】 层析（chromatography）技术在制药领域中是一种广泛应用的技术。作为一种非常重要的分离纯化手段，其他分离技术相比，层析技术提供了较高的分辨率和选择性，可以把一些非常接近的杂质分离开来，从而获得高纯度的制剂。尤其是在生物制药领域，如单抗、重组蛋白、疫苗和血液制品等，其纯化工艺更是和层析技术息息相关。本次讲座主要讲述了层析技术的分类和基本原理，层析的基本参数及优化，以及层析技术在单抗中的应用，用以帮助大家了解层析技术的基础及其应用。-------------------------------------------------------------------------------1、报名条件：只要您是仪器网注册用户均可报名参加。2、参加及审核人数限制：限制报名人数为120人，审核人数100人。3、报名截止时间：2013年8月21日4、报名参会：http://simg.instrument.com.cn/meeting/images/20100414/baoming.jpg5、参与互动： *参会期间您还可以将有疑问的数据通过上传的形式给老师予以展示，并寻求解答*6、环境配置：只要您有电脑、外加一个耳麦就能参加。建议使用IE浏览器进入会场。7、提问时间：现在就可以在此帖提问啦，截至2013年8月20日8、会议进入：2013年8月21日14:00点就可以进入会议室9、特别说明：报名并通过审核将会收到1 封电子邮件通知函(您已注册培训课程)，请注意查收，并按提示进入会议室!为了使您的报名申请顺利通过，请填写完整而正确的信息哦~http://simg.instrument.com.cn/webinar/20110223/images/zb_11.gif注意：由于参会名额有限，如您通过审核，请您珍惜宝贵的学习交流机会，按时参加会议。如您临时有事无法参会，请您进入报名页面请假。无故不参会将会影响您下一次的参会报名。快来参加吧：我要报名》》》

大家好！我想了解一下硅胶柱层析160-200目，还有200-300目有什么区别，哪个分离的效果好一点。如果能讲透硅胶目数与分离度之间的关系就更好了。谢谢大家！！！

层析技术层析技术的应用与发展，对于植物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素，分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究，发现除丹参酮Ⅰ为纯品外，Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通过各种层析方法，迄今已发现15种单体（其中有4种为我国首次发现）。目前新的层析技术不断发展，随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用，层析技术已日趋完善。　　一．层析法的基本原理：层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差（分配层析），组分对吸附剂吸附能力不同（吸附层析），和寓子交换，分子的大小（排阻层析）而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析，流动相为液体的称为液相层析。　　一、 吸附层析法（AdsorptionChromatography）　　（一）吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系：液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品（分子量小于1，000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。 　　1． 吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。　　（1） 硅胶：层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17％，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化，当硅胶加热至100～110℃时，硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时，硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键，从而丧失了因氢键吸附水分的活往，就不再有吸附剂的性质，虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度进行（一般在170cC以上即有少量结合水失去）。　　硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱注化台物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。　　（2）氧化铝：氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性，称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴，本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质，并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子，从而具有离于交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝，用于拄层析的，其粒度要求在100～160目之间。粒度大子100目，分离效果差：小于160目，溶浓流速大慢，易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比，一般在1：20～50之间层析柱的内径与柱长比例在1：10-20之向。　　在用溶剂冲洗柱时，流速不宜过快，洗脱液的流速一般以每半～1小时内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量（克）相等为合适。　　（3）活性炭：是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最好选用颗粒活注炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的有为吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。　　2．溶剂：层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂（单一剂或混合溶剂）习惯上称洗脱剂，用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择，须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时，当被分离物质为弱极性物质，一般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂（如以硅藻土或滑石粉代替硅胶），则洗脱剂的极性亦须相应降低。　　在柱层操作时，被分离样品在加样时可采用于法，亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的，以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程，称为“梯度洗脱”，使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀（梯度太大），就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力，有时可以用溶剂的介电常数（ε）来表示。介电常数高，洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂，如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反，在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用，较在脂溶性溶剂中为强。　　3．被分离物质的性质：被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附住强。 　　当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的住能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时，使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱，油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。 　　又如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明，同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。

有没有人知道哪有圆柱形的层析缸卖啊？采购的人说厂家都不做了。我做纸层析，展开距离要很长。不知道你们都用什么展开缸的。或者有没有好的方法推荐。拜托各位了。[em06]

各位大神，蛋白纯化时层析柱尺寸如何影响反相层析的规模和柱效的？请各位大神给详细介绍一下。

[font=宋体]蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分，是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学地掌握生命现象和活动规律，更完善地揭示生命的本质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]由此许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质，使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的是将目标蛋白质从细胞裂解液的全部组分中分离出来，同时仍保留蛋白的生物学活性及化学完整性。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，需根据蛋白的特性选择合适的纯化方法来提高获得的蛋白制品的纯度。[/font] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的原理[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异，即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font] [font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA [/font][font=宋体]等分开，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/font] [/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体]①[/font][font=宋体]凝胶过滤层析[/font][/b][font=宋体]凝胶过滤层析（又叫做分子筛）是根据样品的分子大小对样品进行分离的一种简单温和的层析技术。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。不同于离子交换层析和亲和层析，凝胶过滤的层析样品不与层析柱料结合，因此，缓冲液成分不直接影响分辨率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理：层析柱中的填料是球状颗粒的惰性的多孔网状结构的柱料，多是交联的聚糖[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如葡聚糖或琼脂糖[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]类物质。在加入样品之后，样品中的小分子物质能进入球状填料内部，在柱子中停留时间较长；而大分子物质不能进入球状填料内部，停留时间较短。所以当样品经过凝胶过滤层析柱分离后，样品中的不同分子大小的物质就可以被分离开了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和形状进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]是一种非吸附的分离方式[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缓冲液成分不直接影响分辨率，只需要一种缓冲液[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]操作便捷[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]②[/font][font=宋体]离子交换层析[/font][/b][font=宋体]离子交换层析是目前蛋白质分离纯化中应用最广泛的方法之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原理：不同蛋白等电点差异，分子大小差异，在同一个流动相中电荷密度分布不同，电荷量不等，与具有相反电荷的离子交换介质结合强度不同，在流动相洗脱时保留时间不同，从而得以分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和等电点差异进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]灵敏度高，重复性，选择性好，分析速度快[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]③[/font][font=宋体]疏水层析[/font][/b][font=宋体]原理：疏水层析是依据蛋白质疏水性差异分离的。即根据蛋白质和疏水介质表面的疏水基团的可逆相互作用进行分离。蛋白的疏水性在高离子强度下被增强，因此在高离子强度环境中结合，通常采用降低离子强度的方式进行洗脱。独特的吸附分离模式使得疏水层析成为硫酸铵盐析后或离子交换高盐洗脱后理想的纯化方式。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]采用了盐的水溶液作为流动相，色谱条件温和，生物大分子的活性回收率很高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白质在[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]操作过程中是高盐上样，低盐洗脱（高盐浓度的样品不必作处理就可直接上样）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在一次色谱中可同时实现出去盐酸胍、蛋白质复性和分离三个目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]温度升高，蛋白质天然折叠伸展，暴露出更多内部疏水集团，使蛋白质的[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]保留发生变化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]色谱填料稳定性好，盐水体系作流动相无环境污染。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]④[/font][font=宋体]亲和层析[/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析[/b][/url]是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看蛋白纯化技术[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]方法：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]

◆[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析 属于分配层析或吸附层析，仅适用于分析分离挥发性和低挥发性物质。固定相是在惰性支持物（如磨细的耐火砖）上覆盖一层高沸点液体，如硅油、高沸点石蜡和油脂、环氧类聚合物。外涂层约为支持物重量的20％。分析时操作温度范围，一般从室温到200℃。特殊的层析柱能达到500℃。流动相常用氦、氩或氮为展层气体。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析分离的区带十分清晰，是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡，所需分析时间大为缩短，一般为数分钟至10余分钟。检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果，因而测定样品量可到微克和毫微克水平。具有快速、灵敏和微量的优点。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析也能用于分离制备样品，但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的装置。

请教凝胶层析介质biogel P系列和superdex 30 的区别我想请教一下各位高手，我想分离分子量在一万以内的几个寡糖，想用凝胶层析分离，用bio gel P 系列还是用superdex 30 效果更好呢？这两种凝胶层析介质各有什么特点吗。还请大家多多指教。