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北京临床基因扩增检验实验室筹建策划方案项目名称:2012年临床基因扩增检验实验室1 概述 临床基因扩增实验是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法,测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。由于该检测方法可以测出普通检验难以检测出的病毒并具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点,因此被临床医生广为认可,已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的禽疫病诊断。但是,这种实验需要有能保证绝对安全、配置合理的实验室和非常规范的操作为前提。近年来对临床基因扩增检验实验室的建设越来越得到重视,因为它对检测结果的可靠性、准确性和安全性起到至关重要的作用。本文主要从临床基因扩增检验实验室的平面布局,空调通风系统设计、气流控制和污染的防制几个方面对实验室设计中的主要特点进行了阐述。 临床基因扩增检验实验室设计的核心问题是如何避免污染。因此,实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制等都是围绕这个核心问题进行的。下面就对这几个方面分别进说明。2 临床基因扩增实验室平面布局 临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域:试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。为避免交叉污染,进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行,即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。 各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。临床基因扩增实验室平面布置示意图如图1所示。 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/11/201111250944_332855_2394712_3.jpg图1临床基因扩增实验室平面布置示意图3 实验室空调通风系统设计及压力控制 临床基因扩增实验室并没有严格的净化要求,但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性,宜采用全送全排的气流组织形式。同时,要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。3.1 试剂贮存和准备区 该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区,不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。 对与气流压力的控制,本区并没有严格的要求。3.2 标本制备区 该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外,由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染,所以应避免在本区内不必要的走动。3.3 扩增反应混合物配制和扩增区 该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外,已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中,通常在第一轮扩增后必须打开反应管,因此巢式扩增有较高的污染危险性,第二次加样必须在本区内进行。 本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。3.4 扩增产物分析区 该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测,此区域可不设。 本区是最主要的扩增产物污染来源,因此对本区的压力梯度的要求为:相对于邻近区域为负压,以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。4 污染的预防与控制 临床基因扩增实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中,常见的有以下几种污染类型:扩增产物的污染;天然基因组DNA的污染;试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染,实验就必须停止,直到找到污染源为止,而且实验结果必须作废,需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐,浪费人力物力。因此要避免污染,首先应是预防,而不是排除。4.1 工作区域的严格划分(1)各个实验区域设置合理;(2)各个实验区域要有明显的标记(如醒目的门牌或不同的地面颜色等),以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。4.2 合理的系统设置(1)合理的空调通风系统设置,尽量采用全送全排的空调系统;(2)严格的气流压力控制,保证不同的实验区内不同的压力要求。[/fon
临床化学试剂 clinical chemical reagent 又称临床诊断试剂,指用于临床诊断检查用的一类化学试剂。它与电子工业用试剂并列为化学试剂工业中两大新型系列。这类试剂以人或动物的活体材料作为被检体,而利用其在生物体外所实施的生物学反应进行检验,以作为医生临床诊断病因、观察病情、判断病程、分析疗效的主要手段之一。根据检验项目,临床化学试剂分为9类。①一般检验试剂;②血液检验试剂 ③生化试剂;④免疫血清学检验试剂;⑤细菌学检验试剂;⑥病理组织学检验试剂;⑦机能试剂;⑧自动分析用检验试剂;⑨同位素标记试剂。根据具体用途,又可分为简易检测、常规分析、细菌培养及自动分析仪器用的配套试剂。随着临床医学和科研的发展,临床化学试剂中下列门类发展的速度较快: 酶试剂 这是临床化学试剂的发展方向,适用于生化自动分析。其突出的优点是灵敏度高、特异性强,在成分异常复杂的液体标本中,可以避免或减少成分的相互干扰,从而提高测定结果的精确性和线性范围。而且测定时间短、对环境污染少、方法简便可靠。如血清或尿用淀粉酶的测定作为胰腺炎的早期诊断指标,就比用淀粉和碘产生蓝色反应的化学法要准确、简捷得多。又如测定血糖用的己糖激酶法和测定尿素氮用的脲酶法,比测定血糖用的邻甲苯胺和测定尿素氮用的二乙酰一肟的化学方法(旧方法),不但专一性强、灵敏度高、线性范围宽,而且避免使用对人体有毒害作用的化学品,减少了环境污染。因之在生物化学-血液诊断领域中的胆甾醇测定和中性脂肪测定中,酶法已占70%~80%,在葡萄糖测定中酶法也达到了50%。据不完全统计,在国际市场上供应的酶试剂(不包括辅酶和基质)已有 186种。 试纸 简易快速诊断用的定性和半定量临床诊断试纸。目前已有八联尿试纸,可同时测定pH、蛋白、葡萄糖、胆红素、酮体、亚硝酸盐、隐血和尿胆原;有测定血清用 9种化学成分的试纸,即胆红素、胆固醇、尿素氮、葡萄糖、尿酸、三酸甘油酯、血红蛋白、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶。试纸法的优点是:①取材方便(尿、耳血、指血),用量少,适合于婴儿、老年人、病危而又需连续观察病情的病人 ②既适合于大医院使用,也适合于农村、工矿、边疆、部队等基层使用;③医务人员可以使用,病人也很易学会使用 ④可作常规、急诊使用,也适合于大规模健康普查、流行病学研究或个人保健使用。 最近,国际上又开发出一种准确定量测定血液中化学成分的新型临床检验胶片。这种多层分析胶片操作快而准,检验时只需将血样滴在胶片上,即能测得所需结果。 试剂盒 测定某项目所供应的全部配套试剂,对用户极为方便。这类试剂盒多以三种形式提供:①冰冻干燥的试剂混合物。②分开的单独溶液和固体,使用前按比例混合。③已预先测好体积的备用试剂溶液。试剂盒都附有详细的说明书。 随着临床检验技术的发展,已出现多种临床诊断试剂盒,如放射免疫试剂盒、酶免疫试剂盒、生化检验试剂盒、毒物和药物检验试剂盒。 ①放射免疫试剂盒 是利用放射性同位素技术与免疫化学技术相结合的体外测定超微量(一般 1ml血可测10-9 ~10-12 g)物质的一种新型药盒。它具有同位素技术的高灵敏度、精确性和抗体免疫反应的专一性,现已应用于很多医学领域,可测定蛋白质、多肽激素和非肽类激素、酶、血液中非激素蛋白质、病原体、抗体药物等。放射免疫试剂盒必须具备:标记抗原(高纯、高比度);特异性抗体;抗原的标准;有效的分离剂。其操作基本步骤为加试剂、培育、分离、计数、整理数据。 ②酶免疫试剂盒 是利用酶来标记抗原或抗体,不用放射性示踪,不用分离,没有辐射危害,酶标试剂制备容易、稳定,试剂盒保存期长。测定时用一般分光光度计即可,方法简便,用途较广,可用于流行病毒的抗体(乙型大脑炎等)、病毒(流感、麻疹病毒等)、病原性细胞检定,免疫病理学的检测(如用抗核酸抗体、甲胎蛋白、肿瘤抗原等试剂盒),寄生虫病的论断(吸血虫病、疟疾病等),内分泌疾病及血液病的诊断。80年代,酶免疫试剂盒有取代放射免疫试剂盒的趋势。 ③生化检验试剂盒 将化学试剂经过配方处理而配制的一种很方便的试剂盒,可作一般临床生化检验使用。 ④毒物和药物检验试剂盒 是用以检验人血中某一特定药物或毒物含量的配套试剂。
ELISA试剂的评价(evaluation)分两个方面:一是试剂本身的质量评价,符合一定要求后才能生产供应;一是在临床应用中效果的评价。以肝炎ELISA诊断试剂为例,首先必须通过中国药品生物制品检定,以得到生产的许可。检定内容除包装、标签、说明书等外,对试剂的性能,如特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项检定,通过对一系列参比品的检测,结果符合要求者才为合格。ELISA试剂的临床质量评价是用该试剂对临床样本进行检测,以观察其实际应用价值。部临检中心对乙肝ELISA诊断试剂在这方面进行了工作,通过质量评价,促进了试剂质量的提高。一、诊断试剂临床质量评价要点 从临床应用角度考核检验试剂的可靠性,是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的。目前还很难找到100%可靠的试验,任何试验都会出现假阳性或假阴性。判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为考核标准。临床应用的灵敏度用疾病患者试验阳性的百分率表示,特异性以无病者试验阴性的百分率表示。进行这种评价,首先需要收集有关的病人血清,然后用公认的检测该项标志物最可靠的试剂进行测定,以确定其为阳性或阴性。这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"(panel)。被评价的试剂测定此血清所得结果与血清盘标明的结果的关系如下表:血清盘结果合计+-受检试剂结果+aba+b-cdc+d合计a+cb+dA+b+c+d表中a为真阳性,b为假阳性,c为假阴性,d为真阴性。被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算:灵敏度(%)=a/(a+c)×100%特异性(%)=b/(b+d)×100%[/