藻类培养反应器

中科院海洋研究所科研人员日前成功研制出适宜藻类细胞工程培养的大型封闭式管道光生物反应器，解决了限制微藻资源开发利用产业化的瓶颈。　　该项目完成了2个可用于中试和生产的5吨级平行管道光生物反应器的研制，基本解决了光生物反应器体积增大比表面积大幅度下降的技术难题，同时可自动清洗管道内贴壁细胞，减少培养死角。科研人员利用该设备进行了雨生红球藻的规模化培养，结果表明培养细胞密度大幅度提高，培养周期缩短1/4。　　光生物反应器是微藻细胞工程培养的重要设备，在微藻资源规模化开发利用过程中发挥至关重要的作用。受到技术和材料的双重制约，目前国内外光生物反应器体积普遍较小，只适用于实验室基础研究，缺乏开展中试论证与规模化生产的大型光生物反应器装置。该套设备的研制成功，将为我国培育新型微藻生物技术产业，促进微藻生物资源开发利用发挥重要作用。

生物反应器的应用生物反应器在生物技术，工艺开发和研究中发挥着至关重要的作用，其主要应用包括：1. 细胞株开发：台式生物反应器可用于评估各个细胞株的性能，包括生长和表达效率，这有助于确定最适合进行进一步工艺开发和放大的候选细胞株。2. 工艺开发：台式生物反应器广泛应用于工艺开发的早期阶段，包括了参数优化和工艺放大两方面，首先在较小规模上优化温度，pH，DO等工艺控制参数，然后再进行工艺放大研究，降低放大至较大体积的生物反应器中可能存在的成本和风险。更复杂的工艺开发包括了增强型工艺，例如灌流培养和连续培养。3. 培养基优化：台式生物反应器可以用于优化培养基和补料策略，以改善细胞生长、活力和蛋白质表达，有助于实现高效，稳定且成本可控的大规模细胞培养。4. 工艺表征：台式生物反应器可进行工艺缩小研究，在较小规模上模拟较大生物反应器的条件，有助于了解和解决工艺放大过程中可能出现的限制性因素，如氧气传质、混合效率、CO2分压和剪切力。5. 质量源于设计（QbD）：可以在台式生物反应器规模实施QbD开发原则，系统地研究和优化关键工艺参数，以确保产品质量的一致性。6. 临床样品制备：符合GMP要求的台式生物反应器系统，可用于临床前研究或早期临床试验中的小规模生产，以快速、经济地生产小批量的治疗性产品。Reference:cell culture bioprocess engineering, second edition细胞生长所处的生理压力生物制药中，CHO细胞作为常用的重组蛋白的表达体系，优化其生长和产物表达效率至关重要，然而生物反应器中CHO细胞却面临着多方面的生理压力，包括培养条件、营养供应和环境参数有关的各种因素，因此需要反应器提供良好的工艺参数控制，以维持合适的细胞生长微环境。 营养限制：CHO细胞的能量和生物合成严重依赖葡萄糖，葡萄糖浓度过低会导致细胞新陈代谢压力和活力降低；氨基酸是蛋白质合成所必需的，特定氨基酸含量不足会影响细胞生长和蛋白表达；细胞培养基中的生长因子、维生素和微量元素的不足也会影响 CHO 细胞的生理机能。 温度：温度波动会影响细胞的新陈代谢，对于细胞生长和蛋白表达通常所需最适温度不同，需要制定针对性控制策略。 pH值波动：pH 值的变化会导致培养基的酸化，影响分子的电离状态，并影响细胞的新陈代谢，维持pH值在最佳范围内对细胞活力和表达至关重要。 溶解氧浓度：溶解氧浓度过低会导致供氧不足，造成细胞应激，影响细胞生长和蛋白质表达。 二氧化碳分压：二氧化碳分压影响了pH控制，细胞代谢和生理功能，需要加以及时的检测和有效的控制策略。 渗透压：代谢物积累或营养浓度过高导致的高渗透压会对细胞造成压力，这会影响细胞体积大小调节和整体细胞功能。 剪切力：生物反应器中的搅拌和通气产生的能量耗散会对细胞造成剪切应力，过大的剪切应力会损伤细胞结构并影响其生产率。 代谢副产物：细胞新陈代谢产生的有毒副产物（如乳酸、氨）的积累会对细胞活力和蛋白表达产生不利影响。 细胞密度：高细胞密度和细胞聚集会导致营养和氧气的限制，造成压力，有效的混合和充分的氧气供应对防止这些问题至关重要。理解细胞所处的生理压力环境对于工艺条件优化，增强细胞活率，获得高表达产物和目标质量属性非常关键。工艺过程参数的控制在了解了细胞所处的生理压力之后，遵循质量源于设计（QbD）的指导原则，通过风险评估的方式确定关键工艺过程参数（CPP）, 重要工艺过程参数（KPP）及非重要过程控制参数（Non-KPP），制定参数各自的设定空间（DS），并在操作范围内进行控制，这整体上需要工艺过程分析技术（PAT）及生物反应器所配置过程控制策略，以提供一致的工艺性能和产品质量（CQA）。图片来源于网络生物反应器常用控制策略 开环控制：开环控制系统应用一组预定义的控制输入或设定点，而不连续测量实际输出，系统假定输入将实现所需的输出，而无需实时反馈。该控制策略的准确度依赖于高精度及快速响应的硬件配置。 闭环（反馈）控制：闭环控制使用传感器持续监测系统输出，将其与所需设定点进行比较，并实时调整控制输入以保持所需的条件。这种方法能更好地适应过程中的变化和干扰。该控制策略的准确度依赖于控制器模式，参数的预设和调节。 前馈控制：前馈控制可预测系统中的干扰，并在干扰影响输出之前调整控制输入。它是对反馈控制策略的补充。生物反应器控制器策略的应用 PID控制：PID 控制是一种闭环控制策略的实现形式，通过比较设定值和实际值（误差），使用比例、积分和微分项来计算控制输出。比例部分使用增益（Gain）乘以误差进行输出；积分部分累积 CV（控制输出）随时间变化的程度，以纠正误差；微分部分分析参数过去的变化率，并将其推断到未来，其动作单位为秒（你想推断多远），可以让回路在发生突发事件时迅速做出反应，但很容易受到测量噪音的影响。 PID同时可以结合死区（DB, Dead Band）来使用，例如pH的PID控制，细胞对于pH有一个适应范围，设定合适的DB值，避免酸，碱的反复添加和渗透压的升高。 级联控制：级联控制涉及主控制器与子控制器，主控制器的输出作为子控制器的设定值，从而更好地抑制干扰；子控制器可以为一个或多个，通过顺序级联或同时级联，以满足不同复杂程度工艺的需求。例如DO控制中，主控制器为DO PID控制器，子控制器为Air，O2，搅拌等控制器。 Profile控制：为控制器的设定值设定随时间变化的程序，控制器接受该设定值进行开环或闭环控制。例如补料泵的控制中，根据预测的细胞密度增加情况调整补料速度供给率，从而实现对营养物质浓度的前瞻性控制。复杂工艺应用需求常见的细胞培养方式为补料分批工艺（Fed Batch），需要多级的种子扩增步骤，主反应器中也需生长至稳定期进行蛋白表达，因此所需设备成本高，占地空间大，生产效率较低且产品质量一致性存在差异。随着灌流培养基，细胞截留设备及PAT技术等方面的发展，增强型工艺（Process Intensification）在生物制药中逐渐得以应用。根据对细胞和蛋白的截留，增强型工艺分为Concentrate Fed Batch, Dynamic perfusion及Continuous Perfusion等不同形式。Reference：Perfusion Cell Culture Processes for Biopharmaceuticals灌流工艺的开发通常在台式反应器中进行，相比Fed Batch系统具有如下组成及特点： 反应器从结构设计到工艺验证上应能支持系统长时间无菌培养的要求。 反应器的通气及搅拌系统配置应当满足高细胞密度培养对于传质和混合的要求，并进行充分的表征，以评估放大过程中的限制性因素。 细胞截留装置：支持切向流或声学细胞截留装置的无菌连接，截留装置控制器可选择接受生物反应器控制，细胞在截留装置中所受的生理压力（剪切力，温度变化，溶解氧浓度等）应当加以控制。 PAT整合：系统应当支持额外的电极整合，实时监控细胞密度、活力、二氧化碳分压等关键参数。 外置设备的拓展：可拓展外置天平等设备。 自动化控制系统：系统应配置自动化灌流程序或配方，实现高精度自动化的灌流速率，反应器液位及细胞密度控制，减少灌流工艺长时间培养过程中复杂的人为操作所带来的风险。英赛斯NestoBR台式生物反应器NestoBR是一款基于生物工艺进行设计和研发的先进型台式生物反应器系统，应用于生物制药及生物技术等方向的工艺研究和开发，系统设计满足生物行业对于反应器的高性能及法规方面的要求，可降低用户实验的批次失败风险，提高工艺开发能力，加速生命科学的研究发现，实现稳健化的技术转移。NestoBR产品特点紧凑化的结构设计：集成式工业控制器，直观的用户界面与交互；减少设备空间需求，易于使用。严格的材料选择及处理：高硼硅玻璃，耐高温，耐腐蚀；316L不锈钢，表面抛光及钝化处理，，易清洗，易清洁；垫圈采用EPDM材质，符合cGMP要求。基于工艺理解的产品设计：从细胞生所处的生长微环境出发，进行功能设计，拓展工艺可操作空间，保障批次稳定。丰富的高性能硬件配置：灵活的硬件配置方案，满足不同细胞或工艺在培养体积、温度控制、搅拌控制、通气控制等工艺方面的差异化要求。高级自动化软件架构：ISA88批处理控制高级自动化软件架构，将物理硬件、操作程序和个性化工艺的紧密的结合，为控制系统提供安全性，稳定性保障。符合cGMP法规要求： 根据用户需求，提供从设计、测试、验证、文件等一系列技术服务；系统设计与验证遵循ISPE GAMP5。快速稳定的自动化参数控制：控制系统配置不同的控制策略，实现快速，稳定，灵活的工艺过程参数自动化控制完善的批次过程监控与管理：系统配置趋势图，批次报告，用户管理，审计追踪功能满足复杂工艺应用需求：NestoBR提供长时间运行的无菌保障，完善的设备表征数据，可集成PAT，外置设备与灌流装置，可新增控制回路实现自动化灌流工艺操作。全面的安全性保障：提供生物反应器在使用，批次，软件，数据，工艺等方面全方位的安全保障。

2015年11月28-30日，由中国海洋湖沼学会藻类学分会主办，厦门大学承办的中国海洋湖沼学会藻类分会第九届会员大会暨第十八次学术研讨会在福建省厦门市举行。来自全国的七百余位进行藻类相关研究的科学家齐聚一堂，围绕藻类研究的前沿课题进行了深入热烈的探讨。北京易科泰生态技术有限公司作为国内知名的生态研究仪器及技术公司，应邀参加了本次大会。易科泰在会议上展示了一系列国际上最前沿的藻类生理生态研究技术和仪器，因而也成为本次展会上最为亮眼的参展厂家。不但有大批老师来展台参观了解仪器技术，更有以前购买过相关仪器的老师来与易科泰工程师交流仪器使用心得。易科泰为本次会议携带的各种技术宣传资料更是一抢而空。易科泰在会议期间又举办了藻类学前沿热点专题研讨会，邀请中科院水生所王强研究员做了题为《能源微藻用于工业烟气减排的筛选、应用和生理机制》的报告。在报告中，王强研究员系统介绍了他使用AquaPen手持式藻类叶绿素荧光仪、FL3500多功能叶绿素荧光仪和TL300/400植物光合热释光系统进行微藻减排的研究成果。之后，易科泰Ecolab实验室技术总监李川则系统介绍了国际最前沿的藻类培养与研究技术，为参加研讨会的老师展示了这些技术在国际上的应用和最新的文献。研讨会获得了参会老师的极大认可，会后不断有老师来和王强研究员、李川进行更深入的学术交流。 本次会议中，易科泰主要展示的仪器技术有MC1000 8通道藻类培养与在线监测系统、FMT150藻类培养与在线监测技术、AquaPen 手持式藻类荧光测量技术、RF-O2 荧光光纤氧气测量技术和FL3500多功能叶绿素荧光技术等。MC1000 8通道藻类培养与在线监测系统是本次会议当之无愧的明星仪器。它可以进行8通道藻类的同步裴炎培养；配备LEDs光源，可对每个培养试管独立调节控制和设置光强度和时间；OD680和OD720光密度在线监测；设置不同的程序模式控制温度、光照；还可选配溶解氧、藻类荧光测量，通入气体组分与含量控制。本次会议是MC1000 8通道藻类培养与在线监测系统在国内的第一次公开展示，立即获得了参会专家学者的极大关注，在会场上即有多家单位表达了购买意向。FMT150藻类培养与在线监测技术则可以说是MC1000的功能加强版。FMT150可以通过控制单元中用户自定义程序动态自动改变培养条件（光照、温度、pH值等）并实时在线监测培养条件与测量参数如温度、光照强度、pH、DO（溶解氧）、OD（光密度）、CO2、O2及反映藻类生理生态状况的叶绿素荧光参数。光强、光质、温度和通入气体的组分与流速都可以精确调控，配置恒浊和恒化模块后还可以调控培养基的pH值和浊度。FMT150可连接多达7个蠕动泵进行不同恒化与pH条件培养。培养条件可以根据用户自定义方案动态变化，既可以进行恒定条件下的培养，也可以一定的周期自动变化（如模拟昼夜节律变化）培养。OD680、OD720及叶绿素荧光参数Ft可以反映藻类浓度，而Fv/Fm等可反映藻类光合生理状态。控制单元可同时控制多台FMT150进行同步实验，保证不同处理实验间的一致性。作为世界上首款将光养生物反应器技术与叶绿素荧光技术等有机结合的高端藻类培养与在线监测仪器，FMT150从2009年推出后就获得了国际科学界的极大关注，广泛应用于藻类新能源研发、藻类环境工程及食品工程、气候变化响应对策研究等；系统有400ml、1000ml、3000ml等不同规格，还可定制25L、120L等大型系统。参考文献可点击：文献列表下载。蓝藻的次昼夜代谢节律（Cerveny，PNAS，2013）FL3500多功能叶绿素荧光系统是目前国际上公认的时间分辨率最高（可达1μ s）、功能最为全面的叶绿素荧光系统，采用双调制技术，可进行STF（单周转光闪）、TTF（双周转光闪）和MTF（多周转光闪）及定制FRR技术（Fast Repetition Rate）测量。内置叶绿素荧光诱导测量、PAM（脉冲调制）测量、OJIP快速荧光动力学测量、QA–再氧化动力学、S状态转换、叶绿素荧光淬灭等测量程序。其中QA–再氧化动力学和S状态转换更是FL3500独有的测量程序，可以进行光反应中心快慢组分和有活性部分的比例等测量分析，深入揭示光合机理。 AquaPen 手持式藻类荧光测量技术则是最新电子、光学技术与叶绿素荧光技术的高度结晶产品。它将叶绿素瞬时荧光（Ft）、量子产额（QY）、光密度 OD680/OD720、OJIP快速荧光动力学曲线及26个叶绿素荧光参数、叶绿素荧光淬灭分析、光响应曲线等几乎所有国际主流的荧光测量功能集成到手机大小的主机中，堪称藻类叶绿素荧光测量仪器中的“瑞士军刀”。正因为其超高的性价比，本次会议中有近十位老师在现场就签订了购买意向。RF-O2荧光光纤氧气测量技术是基于 REDFLASH 光极传感器技术的最先进的氧气测量技术，具有高精确度、高稳定性、高时空解析度、低能耗、无耗氧、无交叉敏感性等特点。 传感器类型灵活多样，有探头式、探针式、非接触式（sensor spot）及纳米微粒式等，适应于液体、气体乃至土壤、植物、动物、食品等不同条件和样品的 O2测量。同时，它也可以与MC1000、FMT150、FL3500等仪器联合使用，在培养或者测量荧光时同步测量藻类的光合作用。 易科泰生态技术Ecolab实验室致力于引进、消化、吸收和创新国际先进生物生态科研技术，提供土壤呼吸、动物呼吸代谢、植物表型分析、作物胁迫敏感性与抗性检测、光养生物反应器／藻类培养与在线监测、生态毒理学检测技术方案和实验服务与合作。目前实验室配备有FluorCam封闭式荧光成像系统、FluorCam便携式荧光成像仪、FL3500叶绿素荧光仪、AquaPen藻类荧光仪、PlantPen手持式荧光仪、FMT150光养生物反应器、MicroMac1000全自动营养盐分析监测系统、FMS动物/土壤呼吸测量分析系统、ACE土壤呼吸自动监测系统、SoilBox-343便携式土壤呼吸测量仪等，欢迎联系实验合作等。（邮箱：info@eco-lab.cn 电话：010 62615899）