串珠镰孢

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  • GPC柱串联

    我用waters的两根凝胶柱子串联,一根分子量线性范围在5万到500,一根在1万到500,能用它来测分子量在1万6左右的聚丙二醇吗?两根柱子串联后的分子量线性范围是看小范围的那根还是大范围的那根的呀?

  • 串联柱塞杆和并联柱塞杆的区别?

    一直搞不明白,一个泵头中两种柱塞杆的链接方式有什么不一样。 waters 的老的型号(1525)采用的是并联,而Alliance采用的又是串联,而在UHPLC中又回归了并联,这两种链接方式对流速精度和准度会有什么不一样的影响吗?请知道的高手指点一下。

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  • 食品安全标准与监测评估司关于假肠膜明串珠菌等28种“三新食品”的公告
    根据《中华人民共和国食品安全法》规定,审评机构组织专家对假肠膜明串珠菌申请新食品原料、聚天冬氨酸钾等16种物质申请食品添加剂新品种、环己胺封端的1,1'-亚甲基二(4-异氰酸基环己烷)均聚物等11种物质申请食品相关产品新品种的安全性评估材料进行审查并通过。特此公告。附件: 假肠膜明串珠菌等28种“三新食品”的公告文本.pdf国家卫生健康委2023年2月7日附件 1新食品原料假肠膜明串珠菌 假肠膜明串珠菌中文名称假肠膜明串珠菌拉丁名称Leuconostoc pseudomesenteroides其他需要说 明的情况1. 批准列入《可用于食品的菌种名单》,使用 范围包括发酵乳、风味发酵乳、干酪、发酵 型含乳饮料和乳酸菌饮料 ( 非固体饮料),不包括婴幼儿食品。2. 食品安全指标须符合以下规定:铅(Pb,干基计),mg/kg ≤1总砷(As,干基计),mg/kg ≤1.5沙门氏菌,/25 g ( mL)0金黄色葡萄球菌,/25 g ( mL)0单核细胞增生李斯特氏菌,/25 g ( mL)0附件 2 聚天冬氨酸钾等 16 种食品添加剂新品种一、食品添加剂新品种序号名称功能食品分类号食品名称最大使用量 (g/L )备注1聚天冬氨酸钾PotassiumPolyaspartate稳定剂和凝固剂15.03.01葡萄酒0.3—二、食品工业用酶制剂新品种序号酶来源供体1氨基肽酶Aminopeptidase米曲霉 Aspergillus oryzae米曲霉 Aspergillus oryzae2蛋白酶 Protease李氏木霉 Trichoderma reesei樟绒枝霉 Malbranchea sulfurea3磷脂酶 A2Phospholipase A2李氏木霉 Trichoderma reesei烟曲霉Aspergillusfumigatus4麦芽糖淀粉酶 Maltogenic amylase酿酒酵母Saccharomycescerevisiae嗜热脂解地芽孢杆菌Geobacillusstearothermophilus5木聚糖酶 Xylanase地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis6乳糖酶 (β-半乳糖苷 酶 ) Lactase(beta-galactosidase )Papiliotrematerrestris—7羧肽酶Carboxypeptidase米曲霉 Aspergillus oryzae米曲霉 Aspergillus oryzae8脱氨酶 Deaminase米曲霉 Aspergillus oryzae—三、食品用香料新品种序 号名称功能食品分类号食品名称最大使用量备 注12- 己基吡啶 2-Hexylpyridine食品用香料—配制成食品用香精应用于各类食品中( GB 2760-2014 表 B. 1食品类别除外)按生产需要适量使用—
  • 解读《关于假肠膜明串珠菌等28种“三新食品”的公告》
    一、新食品原料假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)属于明串珠菌属,从传统发酵乳制品中分离得到。该菌种已被列入欧洲食品安全局资格认定(QPS)名单的推荐生物制剂列表以及国际乳品联合会公报(BulletinoftheIDF514/2022)的“在发酵食品中证明安全的微生物品种目录”,并在丹麦、加拿大、韩国等国家已被批准使用。根据《中华人民共和国食品安全法》和《新食品原料安全性审查管理办法》规定,国家卫生健康委员会委托审评机构依照法定程序,组织专家对假肠膜明串珠菌的安全性评估材料进行审查并通过。新食品原料生产和使用应当符合公告内容以及食品安全相关法规要求。该菌种的使用范围包括发酵乳、风味发酵乳、干酪、发酵型含乳饮料和乳酸菌饮料(非固体饮料),不包括婴幼儿食品。该原料的食品安全指标须符合以下规定:铅(以Pb计,干基计)≤1.0 mg/kg,总砷(以As计,干基计)≤1.5 mg/kg,微生物限量为沙门氏菌0/25 g(mL),金黄色葡萄球菌0/25 g(mL),单核细胞增生李斯特氏菌0/25 g(mL)。待食品加工用菌种制剂的食品安全国家标准发布后,按照食品加工用菌种制剂的标准执行。二、食品添加剂新品种(一)聚天冬氨酸钾1.背景资料。聚天冬氨酸钾申请作为食品添加剂新品种。本次申请用于葡萄酒(食品类别15.03.01)。美国食品药品管理局、欧盟委员会、澳大利亚和新西兰食品标准局允许其作为食品添加剂用于葡萄酒。根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会评估结果,该物质的每日允许摄入量“不作具体规定”。2.工艺必要性。该物质作为稳定剂和凝固剂用于葡萄酒(食品类别15.03.01),改善产品稳定性。其质量规格按照公告的相关要求执行。(二)氨基肽酶1.背景资料。米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的氨基肽酶申请作为食品工业用酶制剂新品种。法国食品安全局、丹麦兽医和食品局等允许其作为食品工业用酶制剂使用。2.工艺必要性。该物质作为食品工业用酶制剂,主要用于催化蛋白质氨基端氨基酸的水解。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》(GB 1886.174)。(三)蛋白酶1.背景资料。李氏木霉(Trichoderma reesei)来源的蛋白酶申请作为食品工业用酶制剂新品种。丹麦兽医和食品局、法国食品安全局等允许其作为食品工业用酶制剂使用。2.工艺必要性。该物质作为食品工业用酶制剂,主要用于催化蛋白水解。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》(GB 1886.174)。(四)磷脂酶A21.背景资料。李氏木霉(Trichoderma reesei)来源的磷脂酶A2申请作为食品工业用酶制剂新品种。美国食品药品管理局允许其用于食品。2.工艺必要性。该物质作为食品工业用酶制剂,主要用于催化磷脂的水解。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》(GB 1886.174)。(五)麦芽糖淀粉酶1.背景资料。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的麦芽糖淀粉酶申请作为食品工业用酶制剂新品种。澳大利亚和新西兰食品标准局允许其作为食品工业用酶制剂使用。2.工艺必要性。该物质作为食品工业用酶制剂,主要用于催化淀粉的水解。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》(GB 1886.174)。(六)木聚糖酶1.背景资料。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源的木聚糖酶申请作为食品工业用酶制剂新品种。美国食品药品管理局、法国食品安全局、丹麦兽医和食品局等允许其作为食品工业用酶制剂使用。2.工艺必要性。该物质作为食品工业用酶制剂,主要用于催化木聚糖水解。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》(GB 1886.174)。(七)乳糖酶(β-半乳糖苷酶)1.背景资料。Papiliotrema terrestris来源的乳糖酶(β-半乳糖苷酶)申请作为食品工业用酶制剂新品种。丹麦兽医和食品局、澳大利亚和新西兰食品标准局等允许其作为食品工业用酶制剂使用。2.工艺必要性。该物质作为食品工业用酶制剂,主要用于催化乳糖水解和转糖基反应。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》(GB 1886.174)。(八)羧肽酶1.背景资料。米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的羧肽酶申请作为食品工业用酶制剂新品种。法国食品安全局、丹麦兽医和食品局等允许其作为食品工业用酶制剂使用。2.工艺必要性。该物质作为食品工业用酶制剂,主要用于催化蛋白质羧基端氨基酸的水解。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》(GB 1886.174)。(九)脱氨酶1.背景资料。米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的脱氨酶申请作为食品工业用酶制剂新品种。美国食品药品管理局、日本厚生劳动省允许其作为食品工业用酶制剂使用。2.工艺必要性。该物质作为食品工业用酶制剂,主要用于催化5’-腺嘌呤核苷酸(5’-AMP)的水解。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 食品工业用酶制剂》(GB 1886.174)。(十)2-己基吡啶1.背景资料。2-己基吡啶申请作为食品用香料新品种。美国食用香料和提取物制造者协会、国际食品用香料香精工业组织、欧盟委员会等允许其作为食品用香料在各类食品中按生产需要适量使用。2.工艺必要性。该物质配制成食品用香精后用于各类食品(《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》表B.1食品类别除外),改善食品的味道。该物质的质量规格按照公告的相关内容执行。(十一)富马酸1.背景资料。富马酸作为酸度调节剂已列入《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760),允许用于胶基糖果、面包、糕点、果蔬汁(浆)类饮料等食品类别,本次申请扩大使用范围用于腌腊肉制品类(如咸肉、腊肉、板鸭、中式火腿、腊肠)(食品类别08.02.02),熏、烧、烤肉类(食品类别08.03.02),油炸肉类(食品类别08.03.03),肉灌肠类(食品类别08.03.05),冷冻挂浆制品(食品类别09.02.02),经烹调或油炸的水产品(食品类别09.04.02),熏、烤水产品(食品类别09.04.03)。美国食品药品管理局、日本厚生劳动省、加拿大卫生部等允许其作为酸度调节剂用于食品。根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会评估结果,该物质的每日允许摄入量“不作具体规定”。2.工艺必要性。该物质作为酸度调节剂用于上述食品类别,调节食品的酸碱度。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 富马酸》(GB 25546)。(十二)乙酸钠(又名醋酸钠)1.背景资料。乙酸钠作为酸度调节剂已列入《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760),允许用于复合调味料和膨化食品的食品类别,本次申请扩大使用范围用于腌腊肉制品类(如咸肉、腊肉、板鸭、中式火腿、腊肠)(食品类别08.02.02),熏、烧、烤肉类(食品类别08.03.02),油炸肉类(食品类别08.03.03),肉灌肠类(食品类别08.03.05),冷冻挂浆制品(食品类别09.02.02),经烹调或油炸的水产品(食品类别09.04.02),熏、烤水产品(食品类别09.04.03)。美国食品药品管理局、日本厚生劳动省、加拿大卫生部等允许其作为酸度调节剂用于食品。根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会评估结果,该物质的每日允许摄入量“不作具体规定”。2.工艺必要性。该物质作为酸度调节剂用于上述食品类别,调节食品的酸碱度。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 乙酸钠》(GB 30603)。(十三)环己基氨基磺酸钠(又名甜蜜素)1.背景资料。环己基氨基磺酸钠(又名甜蜜素)作为甜味剂已列入《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760),允许用于冷冻饮品、果酱、面包、糕点、饮料类、果冻等食品类别。本次申请扩大使用范围用于焙烤食品馅料及表面用挂浆(仅限焙烤食品馅料)(食品类别07.04)和膨化食品(食品类别16.06)。国际食品法典委员会允许其作为甜味剂用于焙烤制品。根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会评估结果,该物质的每日允许摄入量为0-11 mg/kg bw。2.工艺必要性。该物质作为甜味剂用于焙烤食品馅料及表面用挂浆(仅限焙烤食品馅料)(食品类别07.04)和膨化食品(食品类别16.06),赋予食品甜味。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 环己基氨基磺酸钠(又名甜蜜素)》(GB 1886.37)。(十四)维生素E1.背景资料。维生素E作为抗氧化剂已列入《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760),允许用于油炸面制品、方便米面制品、复合调味料、膨化食品等食品类别。本次申请扩大使用范围用于面糊(如用于鱼和禽肉的拖面糊)、裹粉、煎炸粉(食品类别06.03.02.04)。美国食品药品管理局、日本厚生劳动省等允许其作为抗氧化剂用于食品。根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会评估结果,该物质的每日允许摄入量为0.15-2 mg/kg bw。2.工艺必要性。该物质作为抗氧化剂用于面糊(如用于鱼和禽肉的拖面糊)、裹粉、煎炸粉(食品类别06.03.02.04),减缓食品氧化褪色。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 维生素E》(GB 1886.233)。(十五)聚二甲基硅氧烷及其乳液1.背景资料。聚二甲基硅氧烷及其乳液作为食品工业用加工助剂已列入《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760),允许用于肉制品、啤酒、焙烤食品、饮料、薯片等加工工艺。本次申请扩大使用范围用于胶原蛋白肠衣加工工艺。澳大利亚和新西兰食品标准局等允许其作为食品工业用加工助剂用于食品。根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会评估结果,该物质的每日允许摄入量为0-1.5 mg/kg bw。2.工艺必要性。该物质作为食品工业用加工助剂用于胶原蛋白肠衣加工工艺,消除胶原蛋白肠衣加工过程中产生的泡沫。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 聚二甲基硅氧烷及其乳液》(GB 30612)。(十六)硬脂酸镁1.背景资料。硬脂酸镁作为乳化剂、抗结剂已列入《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760),允许用于蜜饯凉果类、可可制品、巧克力和巧克力制品以及糖果的食品类别。本次申请作为食品工业用加工助剂用于泡腾片压片工艺。美国食品药品管理局、澳大利亚和新西兰食品标准局等允许其作为食品工业用加工助剂用于食品。根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会评估结果,该物质的每日允许摄入量“不作具体规定”。2.工艺必要性。该物质作为食品工业用加工助剂用于泡腾片压片工艺,可减少压制泡腾片过程中物料与模具表面的摩擦力,使片面光滑,避免出现裂片。其质量规格执行《食品安全国家标准 食品添加剂 硬脂酸镁》(GB 1886.91)。三、食品相关产品新品种(一)环己胺封端的1,1'-亚甲基二(4-异氰酸基环己烷)均聚物1.背景资料。该物质常温下为淡黄绿色粉末,不溶于水、乙醇和丙酮,可溶于氯仿。欧盟委员会和日本厚生劳动省均允许该物质用于食品接触用PCN塑料材料及制品。2.工艺必要性。该物质用作PCN材料的添加剂,可以提高其抗冲击性。(二)2-[2-(2,4-二氨基-6-羟基-5-嘧啶)二氮烯基]-5-甲基苯磺酸1.背景资料。该物质在常温下为黄色粉末,微溶于水。美国食品药品管理局和日本化学研究检验所均允许该物质用于食品接触用塑料材料及制品。2.工艺必要性。该物质是一种黄色着色剂,在各类塑料中具有较高的着色力。(三)丙烯酰胺与甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、衣康酸和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物1.背景资料。该物质常温下为浅黄色液体,可溶于水。美国食品药品管理局和德国联邦风险评估研究所均允许该物质用于食品接触用纸和纸板材料及制品。2.工艺必要性。该物质作为干强剂用于食品接触用纸和纸板材料及制品,可增强纸张的拉伸强度、内结合强度和耐破强度。(四)β-(3,5-二叔丁基-4-羟基苯基)丙酸十八醇酯1.背景资料。该物质常温下为白色结晶性粉末,不溶于水。《食品安全国家标准 食品接触材料及制品用添加剂使用标准》(GB 9685-2016)已批准该物质作为添加剂用于食品接触用橡胶、油墨、黏合剂以及聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)和聚苯乙烯(PS)等多种塑料材料及制品。本次申请将其使用范围扩大至涂料及涂层。欧洲委员会、日本厚生劳动省和南方共同市场均允许其用于食品接触用涂料及涂层。2.工艺必要性。该物质是一种抗氧化剂,用于涂料时,可避免环境中的氧气和其他化学物质导致的降解;也可用于涂布过程,避免涂膜收缩起皱。(五)萘磺酸与甲醛聚合物的钠盐1.背景资料。该物质常温下为淡黄棕色粉末,可溶于水。GB 9685-2016已批准该物质作为添加剂用于食品接触用涂料及涂层、黏合剂以及纸和纸板。本次申请将其使用范围扩大至丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)塑料材料及制品。美国食品药品管理局和德国联邦风险评估研究所均允许该物质用于食品接触用ABS塑料材料及制品。2.工艺必要性。该物质作为乳化剂用于ABS塑料材料及制品,可减少凝结物的形成。(六)C1~C18单、多元脂肪醇的脂肪酸酯1.背景资料。该物质在常温下为白色固体。GB 9685-2016已批准该物质作为添加剂用于食品接触用纸和纸板材料及制品。本次申请将其使用范围扩大至食品接触用塑料材料及制品。美国食品药品管理局、欧盟委员会、日本厚生劳动省和南方共同市场均允许该物质用于食品接触用塑料材料及制品。2.工艺必要性。该物质能够改善加工过程中塑料材料的流动性,提高整体加工速度或改善表面性能。(七)二氯二甲基硅烷与二氧化硅的反应产物1.背景资料。该物质为白色粉末,不溶于水。GB 9685-2016、原国家卫生计生委2017年第9号公告和国家卫生健康委2018年第11号公告中已批准该物质作为添加剂用于食品接触用聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、PP和聚偏氟乙烯(PVDF)等多种塑料材料及制品和涂料及涂层。本次申请将其使用范围扩大至食品接触材料及制品用黏合剂和油墨。欧盟委员会和日本厚生劳动省允许该物质用于食品接触材料及制品用黏合剂;瑞士联邦食品安全和兽医办公室和欧洲油墨协会均允许该物质用于食品接触材料及制品用油墨。2.工艺必要性。该物质用作黏合剂的消泡剂,利于黏合剂的生产及使用;用作油墨的分散剂,达到提高粘度的效果。(八)一氧化碳-乙烯-丙烯三元聚合物1.背景资料。该物质在常温下为白色固态颗粒,不溶于水。美国食品药品管理局和欧盟委员会均允许该物质用于食品接触用塑料材料及制品。2.工艺必要性。该物质主要用于复合包装,具有较高的阻隔性能,可有效阻隔氧气渗透,防止内容物氧化。(九)4-乙基苯酚与间甲酚、对甲酚、对叔丁基苯酚和甲醛的聚合物1.背景资料。该物质常温下为深琥珀色固体,不溶于水,溶解于醇类、酮类溶剂。欧洲委员会和美国食品药品管理局均允许该物质用于食品接触用涂料及涂层。2.工艺必要性。该物质为涂料的主要成膜物质,可增加涂层的柔韧性和延展性。(十)乙二醇与2,2-二甲基-1,3-丙二醇、对苯二甲酸、间苯二甲酸、己二酸和衣康酸的聚合物1.背景资料。该物质常温下为透明固体,不溶于水,可溶于酯类溶剂。欧洲委员会和日本厚生劳动省均允许该物质用于食品接触用涂料及涂层;南方共同市场和日本黏合剂行业协会均允许该物质用于食品接触材料及制品用黏合剂。2.工艺必要性。以该物质为原料生产的涂料具有较高的表面张力,可提升涂层的防污性能;以该物质为原料生产的黏合剂则具有较高密封强度和易揭等性能。(十一)间苯二甲酸与间苯二甲胺和己二酸的聚合物1.背景资料。该物质常温下为无色透明颗粒,不溶于水。国家卫生健康委2022年第2号公告已批准该物质用于食品接触用塑料材料及制品,使用温度不得超过100℃,本次申请将其使用温度限值提高至121℃。欧盟委员会和日本厚生劳动省均允许该物质在使用温度不超过121℃时用于食品接触用塑料材料及制品。2.工艺必要性。以该物质为原料生产的塑料薄膜,具有良好的氧气阻隔性能、热稳定性能和热成型性能。
  • 干细胞分化成肝类器官并且进行串联培养
    干细胞分化成肝类器官并且进行串联培养方案1 实验目的 该 SOP 描述了由肝癌细胞系(HepaRG)和原代人肝星状细胞 (SteCs) 组成的肝球体的培养,形成肝脏类器官。此外,还描述了将肝脏类器官整合到 MOC 中,可以与其他类器官串联起来共培养。肝球体的生长大约需要 3 小时。从 384 孔微孔板中去除肝球体大约需要 2~5 小时,具体取决于所需的肝球体数量。将肝球体整合到 MOC 中至少需要 1 小时,这也取决于所需 MOC 的数量及所需的肝球体数量。应计算准备细胞培养的额外时间(约 1 周)以及 MOC 的交付时间。 本 SOP 深入描述了 Corning Spheroid Microplate 384 孔板(参考号 3830)的装载、这些肝球体的后续收集和计数以及它们与 MOC 的集成以进行进一步的动态培养。 所有描述的工作步骤都应在无菌操作条件下执行。应特别遵循正确洗手以及始终使用手套。 2 负责人 主要负责人:Alexandra Lorenz SOP 作者:Naomia Sisoli-Sambo、Juliane Hübner 与本 SOP 中描述的工作步骤的偏差必须立即报告给 Alexandra Lorenz 女士。如果更改获得批准,则必须相应地修改 SOP。 3 多器官芯片(MOC) 的无菌处理 为避免污染,必须遵守无菌实验室工作的通用准则。在将 MOC 放入生物安全柜之前,应先喷洒经批准的杀菌剂(例如 80% 乙醇)对其进行消毒,然后用无菌纸巾擦拭(建议使用浸泡在消毒剂中的市售纸巾)。必须特别注意引入的任何部件(注射器适配器、组织培养小室支架和泵连接端口)它们的连接和盖子。掉在地上的部件必须用无菌、高压灭菌的备件更换。因此,在运行 MOC 时,必须始终提供适当数量的无菌备件。 除离心、细胞计数和培养(37°C,5% CO2)外,所有工作步骤均应在超净工作台中进行。 4 所需材料 名称备注分化的HepaRG细胞8 mio cells/vial HPR116NS, Biopredic星状细胞 (SteCs)SC-5300 (Provitro)ScienCellSteCs培养基SC-5301 (Provitro)ScienCell80%乙醇消毒组织例如 Bode Chemie GmbH(德国)的 Bacillol AF 纸巾HepaRG 培养基Williams E基础培养基(500 ml) 不含酚红,含 2.24 g/L NaHCO3),例如PAN-Biotech P04-29510 或 HIMEDIA AL240-500ML 10% FCS (50 ml);5 x 10-5mol/L 氢化可的松半琥珀酸盐(500 µ l 来自 25 mg/ml 原液);5 µ g/ml 胰岛素(250 µ l 来自 10 mg/ml 储备液),例如PAN P07- 04300 2mM 谷氨酰胺(5 ml 来自 200 mM 原液);5 µ g/ml 硫酸庆大霉素(50 µ l 来自 50 mg/ml 原液);0.25 µ g/ml 两性霉素 B(500 µ l 来自 250 µ g/ml 原液);分化培养基含 2% DMSO 的 HepaRG 培养基Trypsin/EDTA 5x用于收集 HepaRGs0.25% 胰蛋白酶/2.21mM EDTA,例如康宁 25-053-CITrypsin/EDTA 1x用于收集 SteCs0.05% 胰蛋白酶/0.53mM EDTA,例如康宁 25-052-CIPBSw/o Ca 和 Mg,例如康宁 21-031-CVR Gilson Platemaster 96 道移液器用于 384 孔板的 Gilson Platemaster 适配器移液器吸头试剂容器灭菌Axygen RES-SW96-HP-SI 或 RES-SW12-HP-SI用于 15/50ml 管的离心机二氧化碳培养箱显微镜细胞计数装置泵控制单元TissUse 有限公司泵管2 毫米 x 1.6 毫米聚氨酯泵管,SMC(美国)扳手 1扳手尺寸 7 毫米 (ISO 272)扳手 2扳手尺寸 10 毫米 (ISO 3318)内六角扳手扳手尺寸 1.5 毫米 (ISO 4762)泵连接端口来自 SMC(美国)的 KJS02-M3 型,内六角,端口尺寸 M3微孔板384 孔黑色透明圆底超低吸附肝球体微孔板康宁 3830大口径提示康宁 TF-205-WB-R-S24孔超低吸附板康宁 3473细胞培养处理的培养瓶和培养皿例如康宁定轨振荡器PS-M3D Grant Instruments灰色和斜体字部分由 TissUse GmbH 提供 5 实验操作5.1 样品准备在肝球体形成前 5 天,根据实验需要解冻尽可能多的分化 HepaRG 细胞。一个循环需要 40 个肝球体(每个由 24,000 个 HepaRG 细胞和 1,000 个星状细胞组成)。每个接种满的 384 孔微孔板将提供大约 300 个肝球体。要完全接种满一个 384 孔微孔板,需要 921.6 万个分化的 HepaRG 细胞。由于一瓶分化的 HepaRG 细胞含有大约 800 万个活细胞,因此应计算每个接种满的 384 孔板需要两瓶。请注意:细胞是在完全融合时接种的,以避免去分化。因此,在接种过程可以丢掉一些细胞,因为准备有富余。 每个小瓶 500 µ l 分化的 HepaRG 细胞(订单号 116NS)应在 9.5 ml HepaRG 培养基中稀释,以将 DMSO 降低至0.5%的终浓度。以0.2 x 106/cm2的密度将活细胞计数后种到适当的细胞培养皿中(例如,800 万个细胞种到60 mm 2培养皿上,2个培养皿;或1600 万个细胞种到一个 T75 培养瓶上)。5-12 小时后必须在无菌条件下将培养基更换为 10 ml 分化培养基(2% DMSO)。随后,每两到三天将培养基更换为 10 ml 新鲜分化培养基。 SteCs 应在肝球体形成前约 2 天解冻并放入培养物中。一个装有 SteCs 的 T175 培养瓶将提供至少五个 384微孔板。首先需要预热SteCs 的培养基,一个小瓶约 1-2 x 106 SteCs 需用 9 ml 培养基,离心,重悬于 1 ml 新鲜培养基中,然后接种到含有 24 ml 温热的星状细胞培养基的 T175 细胞培养瓶中。第二天更换培养基以去除死细胞。 对于扩大培养,SteCs 可以生长到 70% 的融合,然后细胞开始增殖。无菌条件下的培养基更换必须每两到三天进行一次。不应使用通道数高于 P8 的 SteCs。 图 1 单层分化的 HepaRG 细胞和 HHSteC 的相差显微镜。 (A) HHSteC 在第 9 代的相差图像和(B) 在接种后 4 天分化的 HepaRG 细胞。比例尺 100 µ m。 5.2 细胞的收集准备 HepaRG 细胞进行收集,用 10 到 20 ml PBS 冲洗两次。洗涤后,使用胰蛋白酶/EDTA(5x;0.25% 胰蛋白酶/2.21mM EDTA;室温)从细胞培养瓶底部分离细胞。为此,将培养皿中的适量胰蛋白酶/EDTA 涂抹在细胞上,并在 37°C 下孵育 5 至 10 分钟。开始 HepaRGs 的胰蛋白酶消化后,使用胰蛋白酶/EDTA(1x;0.05% 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA)收集星状细胞,并在 37°C 下孵育 5 至 10 分钟。通过这种方式,几乎可以同时收集细胞。用显微镜检查细胞的溶解情况并轻轻敲击细胞培养瓶的侧面以加速该过程并脱壁仍贴壁的细胞。一旦所有细胞从培养容器底部脱离,通过添加相同量的胰蛋白酶抑制剂或两倍量的培养基来抑制反应。将细胞溶液转移到 50 ml 离心管中, 然后用 10 ml PBS 冲洗培养容器两次,并将 PBS 添加到离心管中。细胞团块可以通过溶液的重复再悬浮来分散。此时可以合并来自多个培养容器的相同类型的细胞。 一旦进入溶液,将细胞以 300 x g 离心 5 分钟,然后吸出上清液并将细胞沉淀重悬于 1 至 2.5 ml 细胞培养基中。对 SteCs 和 HepaRG 细胞都使用 HepaRG 培养基(不含 DMSO)。用细胞计数跟踪细胞的再悬浮。请彻底混合细胞溶液(HepaRG 和 SteCs)。用 40 µ l HepaRG 培养基(1:5 稀释)稀释 10 µ l HepaRG 细胞溶液。彻底混合新溶液并用 10 µ l 台盼蓝工作溶液(1:2 稀释,总共 1:10 稀释)稀释 10 µ l HepaRG 溶液。彻底混匀 StesCs 细胞悬液,并用 10 µ l 台盼蓝工作溶液(1:2 稀释)稀释成 10 µ l 细胞悬液。在室温下孵育计数溶液 2 至 3 分钟。计数前充分混合。 将计数溶液加载到先前准备好的血细胞计数板中,并在计数室的四个大方格内对每种细胞类型的活细胞和死细胞进行计数。计算每个细胞类型的每个大方块的活细胞的算术平均值。 每毫升的细胞计数计算如下: 或者根据操作说明使用 SOL Counter (半导体式全自动细胞计数仪) 自动确定每毫升的细胞计数。 5.3 在384 孔微孔板中培养肝球体5.3.1 细胞悬液的制备每个肝球体需要 50 µ l 细胞悬液。这相当于每个微孔板 19.2 ml (50 µ l x 384)。由于移液过程中的波动,每板应制备至少 22 ml(最好是 23 ml)的细胞悬液。要在 50 µ l 的体积中生成具有 1,000个 SteCs 和 24,000 个HepaRGs(1:25 比例)的肝球体,细胞悬浮液的浓度应为 20,000个 SteCs/ml 和 480,000 HepaRGs/ml。 使用 (1) 中计算的每毫升细胞计数生成肝球体细胞悬液所需的收集 HepaRG 细胞和 SteCs 的确切体积,具体取决于所需的肝球体细胞悬液体积: HepaRG 和 SteCs 悬浮液的计算体积用于球状细胞悬浮液,添加培养基以达到所需的体积(例如,一个 384 孔球状板为 23 ml)。 5.3.2 将细胞种到 384 孔微孔板中移液器和所有其他设备需要用乙醇 (80%) 擦拭,并在使用前放置在无菌细胞培养工作台下。先前制备的肝球体细胞悬浮液应彻底混合,并将加载一个微孔板所需的大致量填充到试剂储液罐中(推荐储液罐:RES-SW12-HP-SI,Rillenreservoir)。使用 Gilson Platemaster 96 通道移液器和 384 孔板适配器将 50 µ l 细胞悬液种到 384 孔微孔板的每个孔中。 注意:- 将 50 µ l 细胞悬液直接放在每个孔的底部- 确保所有移液器吸头都牢固地推到 96 通道移液器上。- 对于没有气泡的精确移液,推荐使用反向移液技术。- 为确保细胞在悬浮液中均匀分布,在每次移液步骤前轻轻摇动悬液管。 应将接种满的微孔板短暂离心(250 g,1-2 分钟),以确保孔壁上没有细胞悬浮液,并将细胞收集在孔底。肝球体在 37 °C 和 5% CO2 条件下连续 3 天。图 2 肝球体形成的光学显微镜。 HepaRG 细胞和 SteCs 在肝球体形成的第 1 天和(B)第 3 天的 384 孔超低吸附板(A)的孔中。比例尺 100 µ m。5.4 从 384 孔微孔板中取出肝球体为了收集肝球体,将 384 孔微孔板放在层流罩下。使用 200 µ l 移液器和大口径移液器吸头,小心地将肝球体从 384 孔微孔板中取出。可以在一个移液器吸头中收集多个肝球体。在平底 24 孔低吸附板的每个孔中收集 40 个肝球体。计数肝球体,并将 40 个肝球体放入每个孔中。可用深色背景(例如黑色铝箔纸)更容易看到 24 孔低吸附板中的肝球体。将 40 个肝球体转移到一个孔中后,小心取出旧培养基并加入约 1.5 ml 新鲜 HepaRG 培养基。之后,在显微镜下对每个孔中的肝球体进行计数。丢弃任何看起来太小或聚合不良的肝球体,类似于薄层而不是肝球体。 注意:用移液器吸头收集肝球体时不要吸入任何空气。肝球体应始终悬浮在培养基中。空气的吸入会导致肝球体卡在移液器尖端。应该习惯于在拿起肝球体之前用培养基润湿移液器尖端。此外,使用移液器的时候使用超过所需的程量。这两点都可以降低肝球体粘附在内移液器吸头表面或肝球体漂浮在培养基表面上的风险。 为避免融合并进一步提高肝球体的圆度,将 24 孔低吸附板置于振荡器上,直到 MOC 实验开始(12 至 48 小时)。为此,用乙醇彻底消毒振荡器,并将其放入培养箱(37 °C;5 % CO2)中。将超低吸附板放在振荡器上,使用以下设置并确保培养基不会因摇晃而溢出: 轨道式往复式Vibrio循环式模式4030°5°00时间25OFF5ON 5.5 将肝球体转移到多器官芯片平台(MOC)在将肝球体转移到 MOC 之前,请确保 MOC 已做好充分准备(充满培养基、正确拧入、清洁、蠕动泵的功能已验证;有关详细信息,请参阅 SOP 1 或 6)。拧下所需培养小室的盖子,并通过将板保持在倾斜位置来收集超低吸附板孔底部边缘的肝球体。可用深色背景(例如黑色铝箔纸)更容易看到 24 孔低吸附板中的肝球体。 使用大口径移液器吸头吸取肝球体。握住移液器,尖端朝下,使肝球体沉淀在尖端。然后通过将移液器尖端放入培养基中,让肝球体沉入所需培养小室的底部。尝试在培养小室加入尽可能少的培养基。转移所有肝球体后,将盖子拧回培养小室上。 40 个肝球体用于 MOC 的一个循环(仅加载一个培养小室)。 图 3 2-OC(二联芯片) 培养小室中的 40 个肝球体。 (A) 融合1天的肝球体。 (B)融合14天后的肝球体。 5.6 MOC中的培养基更换要更换装有肝球体的培养小室中的培养基,请拧下相应培养小室的盖子。使用标准移液器吸头吸出所需量的旧培养基,并添加所需量的新鲜培养基(100% 培养基更换是可以的)。将盖子拧回培养小室上。 请注意以下事项:- 尽管肝球体应生长到培养小室的底部,但在去除旧培养基时,请确保不要绘制任何肝球体。如有必要,检查移液器吸头。- 去除旧培养基时,请勿将任何培养基从 MOC 的微流道中吸出,以免在流路内形成气泡。- 通过移液将其移到插入壁上,缓慢而小心地添加新鲜培养基,以避免插入可能干扰肝球体的湍流。- 用新鲜培养基填充培养小室时,不要超过培养小室内盖的螺纹。

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  • 类器官串联培养系统(细胞反应器)--- HUMIMIC 类器官技术平台是一种微流控微生理系统平台,能够维持和培养微缩的等效器官,模拟其各自的全尺寸对应器官的生物学功能和生物的主要特征,如生物流体流动,机械和电耦合,生理组织与流体、组织与组织的比率。 类器官串联芯片培养系统包括控制单元和芯片,控制单元能够模拟人体内生理环境,包括温度、压力、真空度、微流道循环频率、时间等参数,芯片有不通的微流道设计,针对不同的器官可以单独设置提供相应的培养条件,提供精准的培养和分化环境。类器官串联芯片培养系统可提供不同类器官的串联共培养方案,避免单一类器官无法模拟人体复杂生理学条件下器官相互通讯交流的不足。通过类器官模拟人类器官组织的生理发育过程,应用于疾病模型、肿瘤发生、以及药物安全性、有效性、毒性、ADME等方面的评估,旨在减少和取代实验室动物测试,简化人体临床试验。 类器官是指在结构和功能上都类似来源器官或组织的模拟物,通过取特定器官的干细胞(iPS/ES),或者利用人的多能干细胞定向诱导分化,能获得微型的器官样的三维培养物,在体外模拟人体器官发育过程。 类器官,具有某一器官多种功能性细胞和组织形态结构的三维(3D)培养物,主要来源于人具有多项分化潜能的多能干细胞(包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞iPSCs)或成体干细胞。人多能干细胞能分化为个体所有类型的细胞,在体外,经过诱导分化,模拟人体器官发育过程,能使人多能干细胞直接分化形成各种类器官;不同组织器官都存在内源组织干细胞,在维持各器官的功能形态发挥着重要作用。这些干细胞在体外一定的诱导条件下,可以自组织形成一个直径仅为几毫米的具有组织结构和多种功能细胞的三维培养物。器官芯片是获取两个或两个以上不同的类器官,并且放置在特定的培养芯片上进行共培养,能模拟人体的多个器官参与的生理学过程。 基于这一定义,可以发现类器官具备这样几个特征: 必须包含一种以上与来源器官相同的细胞类型; 应该表现出来源器官所特有的一些功能; 细胞的组织方式应当与来源器官相似。 类器官作为一个新兴的技术,在科学研究领域潜力巨大,包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验。与传统2D细胞培养模式相比,3D培养的类器官包含多种细胞类型,能够形成具有功能的“微器官”,能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态,因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。 类器官培养使研究人体发育提供了不受伦理限制的平台,为药物筛选提供了新的平台,也是对现有2D培养方法和动物模型系统的高信息量的互补 。 此外,类器官为获取更接近自然人体发育细胞用于细胞治疗成为可能。通过类器官繁殖的干细胞群取代受损或者患病的组织,类器官提供自体和同种异体细胞疗法的可行性,未来这一技术在再生医学领域也拥有巨大的潜力 。使用这项技术,采用CRISPR/Cas9能够纠正体外遗传异常并能够将健康的转基因细胞再次回输入患者体内,并在后期整合入组织内。在精准医学应用中,患者衍生的类器官也被证明为有价值的诊断工具。在进行治疗之前,采用从患者样本来源的类器官筛查患者体外药物反应,旨在为癌症和囊胞性纤维症患者的护理提供指导并预测治疗结果。随着类器官培养系统以及其实验开发技术的不断发展,类器官应用到了各大研究领域。 类器官可以模拟人体的内外环境和人体器官,帮助研究人员观测用药会对人体器官功能产生什么样的影响。在提倡精准医学和个体化治疗的时代,类器官研究比传统的二维细胞培养更具有针对性,并且可以区别不同癌症对于相同药物的反应。不仅如此,研究者还希望通过诱导多功能干细胞强大的再生潜能,体外生成新的器官或组织,然后移植入体内以替代损坏的组织器官。 类器官培养系统--- HUMIMIC的应用案例 类器官的应用举例---疾病模型 类器官的研究还可用于于疾病模型,如发育相关问题,遗传疾病,肿瘤癌症等。通过使用患者的iPSCs可建立有价值的疾病模型,并能在体外模拟重现病人疾病模型;同时,类器官的建立可以实现对药物药效和毒性进行更有效、更真实的检测。由于类器官可以直接由人类iPSCs直接培养生成,相比于动物模型很大程度上避免了因动物和人类细胞间的差异而导致的检测结果不一致。 类器官的应用举例---药效和毒理测试 可以从患者来源的健康和肿瘤组织样品中建立类器官。与此同时类器官培养物可用于药物筛选,这可将肿瘤的遗传背景与药物反应相关联。来自同一患者健康组织的类器官的建立提供了通过筛选选择性杀死肿瘤细胞而又不损害健康细胞的化合物来开发毒性较小的药物的机会。自我更新的肝细胞类器官培养物可用于测试潜在新药的肝毒性(临床试验中药物失败的原因之一)。在该实施例中,药物B似乎最适合于治疗患者,因为它特异性杀死肿瘤类器官并且不引起肝毒性。 类器官的应用举例---类器官“生物Bank”根据目前的研究进展,建立了活体类器官“生物bank”。其中,肿瘤来源的类器官在表型和基因上都与肿瘤相似。另外,肿瘤类类器官生物库使生理学相关的药物筛选成为可能。活体类器官生物库可用于确定类器官是否对个体患者的药物反应,具有预测价值。从结直肠癌患者的健康组织和肿瘤组织中提取的三维有机组织培养物被用于高通量药物筛选,以确定可能促进个性化治疗的基因药物相关性 类器官的应用举例---重演肿瘤形成 类器官的培养和建立,可用于研究肿瘤生成过程中的突变过程,比如说,通过从同一肿瘤的不同区域培养无性繁殖的类细胞器,可以用来研究肿瘤内部的异质性。来自不同健康器官的类器官的生长,然后对培养物进行全基因组测序,可以分析器官特异性突变谱。通过生长来自同一肿瘤不同区域的类器官,可以用于研究肿瘤内异质性。区域特异性突变谱可以通过类器官的全基因组测序来揭示。使用与上述相似的方法,可以利用类器官来研究特定化合物对健康细胞和肿瘤细胞突变谱的影响。 类器官培养系统--- HUMIMIC的成功培养的器官举例 肠类器官: HansClever 课题组证实单一的Lgr5 +干细胞能够在体外持续增殖并自组装形成隐窝-绒毛样的小肠上皮结构。进一步的研究结果显示,单个成人Lgr5 + 干细胞也能在体外成功扩增成结肠类器官,将这种功能性的结肠上皮移植到硫酸葡聚糖诱导的急性结肠炎小鼠模型中可以修复其受损的结肠上皮。这提示利用单一成人结肠干细胞体外扩增进行结肠干细胞治疗是可行的。有学者还应用人诱导型多能干细胞( induced pluripotent stem cells,iPSCs) 直接定向分化为小肠组织的方法明确了Wnt3a 蛋白和成纤维细胞生长因子4 是后肠特定分化所必需的物质,而且,这种iPSCs体外构建的人体肠道组织中存在的小肠干细胞,也具有小肠特有的吸收和分泌功能。这有助于未来人肠道疾病药物的设计研究,可大大提高了药物利用率。目前,已有学者构建了小鼠小肠3D 类器官来进行P-糖蛋白抑制剂的筛选,为P-糖蛋白介导的药物转运研究提供了强有力的工具。 肝类器官: 2013 年,Takebe 等将人多能干细胞来源的肝细胞、人间充质干细胞和人内皮细胞混合后在基质胶中培养,发现3 种细胞自组装成3D 化肝芽,将该肝芽移植到丙氧鸟苷诱导肝脏衰亡的TKNOG 小鼠体内后发现这种肝芽可以连接小鼠肠系膜血管,小鼠也出现了人类特有的药物代谢过程。这为肝脏器官发生的研究提供了有益尝试。大型哺乳动物的类器官再造工程也许能加速人类器官移植治疗和疾病致病机制研究的进展。2015 年,Nantasanti 等利用狗的肝脏干细胞构建了可分化为功能性肝细胞的肝类器官模型,能用于铜潴留症的治疗。猫被认为是非常适用于研究人类代谢性疾病的模型,所以利用猫的胆道组织构建肝类器官,可能是原发性肝胆疾病研究及药物筛选的有益工具,但至今也未见利用猫建立长期保持基因稳定的肝脏干/祖细胞培养体系的报道。 胰腺类器官: 有学者发现,当控制骨形态发生蛋白碱性成纤维细胞生长因子、激活素A 和Wnt3a 的表达水平或使用一些小分子化合物进行干预时,可以控制内胚层细胞向特定的方向分化,最终形成胰腺。目前,构建胰岛类器官的主要方法包括利用各种干祖细胞产生胰岛样细胞群和利用各种来源的胰腺细胞悬液或胰腺组织块自组装成拟胰岛体。2011 年,Saito 等将人iPSCs 和胚胎小鼠胰岛细胞体外共培养,最后形成能够产生胰岛素的不成熟细胞群,该细胞群由胰岛α 细胞包绕中央的β 细胞构成,这种结构和成年鼠胰岛相似,将其移植到链脲菌素诱导的高血糖小鼠模型中后发现小鼠血糖水平得到极大改善。而进一步的体内实验研究还需要关注如何规避免疫反应、促进再血管化、促进类器官分化发育等问题,在这方面,Sabek 等提出制备纳米腺体来促进胰岛发挥作用,这种纳米腺体是运用3D 打印技术制作可吸收聚合物胶囊包裹胰岛样细胞团形成的,这可能是未来胰岛类器官应用的一种思路。 脑类器官: 近来,谱系重编程技术为获取特异性种子细胞提供了新的途径。Lancaster 等通过加入不同生长因子的方法将人类胚胎干细胞( embryonic stem cell,ESC) 和iPSC 在神经培养基3D 培养出了与9 ~ 10周胚胎大脑类似的“类大脑”,此类迷你大脑具备人类大脑发育初期的一些主要区域,也出现了背侧皮层、腹侧前脑等可辨认的特征,但由于缺乏一些特定的特征,如小脑、海马状突起等,这些区域无法应用于干细胞模型。之后,该研究者利用小颅畸形患者的皮肤成纤维细胞诱导形成了患者特异性iPSC 细胞系,并应用后者构建了小颅畸形脑类器官模型,通过对照实验发现,正常ESC和该iPSCs 在类器官形成上并没有明显差异,但是后者形成的类器官中有大量未成熟的神经元分化,这为大脑发育紊乱类疾病的研究提供了一定的思路。2015年Kirwan 等应用人iPSC 体外构建了人大脑皮层神经网络,能够模拟人体内皮层网络的发育和功能,这表明可以在体外通过构建大脑类器官来进行人类前脑神经网络生理学机制的研究。 前列腺类器官: 2014 年,研究人员首次在实验室利用来自转移性前列腺癌患者的活检标本和去势抵抗性前列腺癌( castration-resistant prostate cancer,CRPC) 患者的循环肿瘤细胞成功培育出7 个前列腺癌类器官,这些前列腺癌类器官以及从中获得的肿瘤移植物的组织结构及基因突变谱与患者转移灶样本高度相似。Nicholson 等[21]也应用类器官培养技术成功在体外构建患者来源的异种移植物模型,相比于人源性肿瘤组织异种移植及基因工程鼠模型,这种新型的患者来源的类器官能更好地代表CRPC 等高级别前列腺癌,还能代表前列腺癌的庞大临床疾病谱,而这种疾病谱是目前仅有的前列腺癌细胞系无法代表的,因而在前列腺癌药物筛选和个体化治疗中展现出巨大的应用前景。 类器官串联培养系统--- HUMIMIC的技术方案:多器官串联培养,在没有病人的情况下测试病人类器官串联芯片培养系统包括控制单元和芯片,控制单元能够模拟人体内生理环境,包括温度、压力、真空度、微流道循环频率、时间等参数,芯片有不同的微流道设计,针对不同的器官可以单独设置提供相应的培养条件,提供精准的培养和分化环境。类器官串联芯片培养系统可提供不同类器官的串联共培养方案,避免单一类器官无法模拟人体复杂生理学条件下器官相互通讯交流的不足。通过类器官模拟人类器官组织的生理发育过程,应用于疾病模型、肿瘤发生、以及药物安全性、有效性、毒性、ADME等方面的评估,旨在减少和取代实验室动物测试,简化人体临床试验。 为获取更高相关与准确的测试结果,我们开发了人体器官模型的自动芯片测试:配备具有指示相关性的器官模型的芯片,以能够在接触生物体之前检测其安全性和有效性;最终为芯片配备患者自身相关病变器官的亚基,以评估整个个性化治疗的效果; 人体生理反应往往涉及更多介质循环和不同组织间相互作用,多器官芯片才能全面反映出机体器官功能的复杂性、完整性以及功能变化,一个相互作用的系统才能更好的模拟整个系统中器官和组织的不同功能。可提供不同类器官的串联培养解决方案,避免单一类器官无法模拟人体复杂生理学条件下器官相互通讯交流的不足。把多种不同器官和组织培养在芯片上,然后通过微通道连接起来,集成一个相互作用的系统,从而模拟人体中的不同功能器官的交流通讯和互相作用。TissUse专有的商用MOC技术支持的器官培养物的数量范围从单个器官培养到支持复杂器官相互作用研究的器官数量,包括单器官、二器官、三器官和四器官培养的商业化的平台。成功的案例包括:肝脏、肠、皮肤、血管系统、神经组织、心脏组织、软骨、胰腺、肾脏、毛囊、肺组织、脂肪组织、肿瘤模型和骨髓以及各自的多器官串联组合方案。德国TissUse公司专注于类器官培养系统研究22年,推出的HUMIMIC类器官串联芯片培养系统,得到FDA的推荐,可提供不同类器官的串联培养解决方案,避免单一类器官培养无法模拟人体器官相互通讯关联的缺陷,同时也提供相关的技术方案和后续方法试剂支持,属于国际上少有的“Multi-Organ-Chip” 和“Human-on-a-chip”的方案提供者。相关方案已被广泛应用于药物开发、化妆品、食品与营养和消费产品等多个领域. 类器官串联培养系统---HUMIMIC系统 一、专业化的硬件(控制单元) 主机(控制单元)是一个紧凑的台式设备,能够模拟人体内生理环境,包括温度、压力、真空度、微流道循环频率、时间等参数。7寸触摸显示器,控制面板可以在整个过程中对每个多器官芯片分别进行调节,无需外接电脑,软件操控友好;可以自主设置每个器官芯片的培养条件,包括温度、压力、真空度、微流道循环频率、时间等参数;可串联培养2个不同(或相同)、3个不同的、4个不同的类器官;3个连接拓展口,用于连接其他设备;同时操控高达8个Chip3 / Chip3 plus,4个Chip2 /Chip4或这些的组合; 二、类器官芯片芯片有不同的微流道设计,针对不同的器官可以单独设置提供相应的培养条件,提供精准的培养和分化环境;芯片的泵腔内的柔性膜通过连接的管道,受到压力或真空的作用,在微流道之中产生脉动体流;二联类器官芯片可以在一个芯片上串联培养2个不同(或相同)的类器官;三联类器官芯片可以在一个芯片上串联培养3个不同的类器官;四联类器官芯片可以在一个芯片上串联培养4个不同的类器官; 三、服务方案(细胞、试剂,诱导方案) 四、器官模型和串联培养技术 类器官串联培养系统---HUMIMIC的应用案例1、神经球和肝脏的串联共培养(柏林工业大学)-二联器官共培养的药物敏感性2015, Journal of Biotechnology, A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing目前用于药物开发的体外实验平台无法模拟人体器官的复杂性,而人类和实验室动物的系统差异巨大,因此现有的方案都不能准确预测药物的安全性和有效性。德国、葡萄牙和俄罗斯的研究团队通过TissUse GmbH公司的微流控多器官芯片(MOC)平台,测试毒物对多器官的作用,揭示了基于微流控的多器官串联共培养能够更好的模拟人体的生理学环境。在体外培养条件下,由于氧气和营养供应有限,类器官培养往往会随着时间的推移而去分化。然而微流控系统中通过持续灌注培养基,更好地控制环境条件,如清除分泌物和刺激因子,并且培养基以可控流速通过,以模拟血流产生的生物剪切应力,因此类器官培养物可以保持良好的生长状态。 双器官串联芯片(2-OC)能够串联共培养人的神经球(NT2细胞系)和肝脏类器官(肝HepaRG细胞和肝HHSteC细胞)。在持续两周的实验中,反复加入神经毒剂2,5-己二酮,引起神经球和肝脏的细胞凋亡。跟单器官培养相比,串联共培养对毒剂更敏感。因此,多器官串联共培养在临床研究中可以更准确地预测药物的安全性和有效性。推测这是因为一个类器官的凋亡信号导致了第二个类器官对药物反应的增强,这一推测得到了实验结果的支持,即串联共培养的敏感性增加主要发生在较低浓度药物中。 2、心脏肝脏骨骼皮肤的串联共培养(哥伦比亚大学)-四联器官共培养的复杂通讯模型哥伦比亚大学的科学家也开发了一种多器官串联芯片,建立了串联共培养心脏、肝脏、骨骼、皮肤的技术,发表于2022年的Nature Biomedical Engineering,中通过血液循环串联培养4个类器官,保持了各个类器官的表型,还研究了常见的抗癌药阿霉素对串联芯片中的类器官以及血管的影响。结果显示药物对串联共培养类器官的影响与临床研究结果非常相似,证明了多器官串联共培养能够成功的模拟人体中的药代动力学和药效学特征。“最值得注意的是,多器官串联芯片能够准确的预测出阿霉素的心脏毒性和心肌病,这意味着,临床医生可以减少阿霉素的治疗剂量,甚至让患者停止该治疗方案。“Gordana Vunjak-Novakovic, Department of Biomedical Engineering, Columbia University 3、胰岛和肝脏在芯片上的串联共培养(阿斯利康)-二联器官共培养的反馈通讯2017, Nature Scientific Reports, Functional coupling of human pancreatic islets and liver spheroids on-a-chip: Towards a novel human ex vivo type 2 diabetes model人类系统性疾病的发生过程都是通过破坏两个或多个器官的自我平衡和相互交流。研究疾病和药疗就需要复杂的多器官平台作为体外生理模型的工具,以确定新的药物靶点和治疗方法。2型糖尿病(T2DM)的发病率正在不断上升,并与多器官并发症相关联。由于胰岛素抵抗,胰岛通过增加分泌和增大胰岛体积来满足胰岛素不断增加的需求量。当胰岛无法适应机体要求时,血糖水平就会升高,并出现明显的2型糖尿病。由于胰岛素是肝脏代谢的关键调节因子,可以将生产葡萄糖的平衡转变为有利于葡萄糖的储存,因此胰岛素抵抗会导致糖稳态受损,从而导致2型糖尿病。过去已经报道了多种表征T2DM特征的动物模型,但是,从动物实验进行的研究往临床上转化的效果不佳。更重要的是,目前使用的药物,虽然能缓解糖尿病症状,但对疾病进一步发展的治疗效果有限。胰腺和肝脏是参与维持葡萄糖稳态的两个关键器官,为了模拟T2DM,阿斯利康(AstraZeneca)的科学家利用TissUse GmbH公司的微流控多器官芯片(MOC)平台,通过微流控通道相互连接,建立一个双器官串联芯片(2-OC)模型,实现芯片上胰腺和肝脏类器官的串联共培养,在体外模拟了胰腺和肝脏之间的交流通讯。 建立串联共培养类器官(胰岛+肝脏)和单独培养类器官(仅胰岛或肝脏),在培养基中连续培养15天,串联共培养显示出稳定、重复、循环的胰岛素水平。而胰岛单独培养的胰岛素水平不稳定,从第3天到第15天,降低了49%。胰岛与肝球体串联共培养中,胰岛可长期维持葡萄糖水平,刺激胰岛素分泌,而单独培养的胰岛,胰岛素分泌显著减少。胰岛分泌的胰岛素促进了肝球体对葡萄糖的利用,显示了串联共培养中类器官之间的功能性交流。在单独培养中的肝球体中,15天内循环葡萄糖浓度稳定维持在~11 mM。而与胰岛共培养时,肝球体的循环葡萄糖在48小时内降低到相当于人正常餐后的水平度,表明胰岛类器官分泌的胰岛素刺激了肝球体摄取葡萄糖。 4、肺肿瘤和皮肤在芯片上的串联共培养(拜耳)-抗体药物对肿瘤和正常器官的影响 针对EGFR抗体的药物在癌症治疗中被广泛应用。然而,抗癌药物的使用量与皮肤不良反应成正比相关,皮肤毒性是上皮生长因子受体(EGFR) 靶向治疗中最常见的副作用。但是对于后者的预测目前的方法均无法实现。双器官串联芯片(2-OC)模型,实现芯片上皮肤和肿瘤的共培养,用于模拟重复给药的剂量实验,同时还生成安全性和有效性的数据,可以在非常早的阶段检测到西妥昔单抗cetuximab对皮肤的几个关键副作用。这种体外分析能够在临床表现之前预评估毒性副作用,可以替代动物试验,有望成为评价EGFR抗体和其他肿瘤药物治疗指数的理想工具。 5、皮肤-肝脏在芯片上的串联共培养(拜尔斯道夫公司)—评估化妆品不同的给药途径d Science, Metal‐Specific Biomaterial Accumulation in Human Peri‐Implant Bone and Bone MarrowSchoon J, Hesse B, Rakow A, Ort MJ, Lagrange A, Jacobi D, Winter A, Huesker K, Reinke S, Cotte M,Tucoulou R, Marx U, Perka C, Duda GN, Geissler S
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