乙酰短杆菌

使用超高效合相色谱(UPC2)分析短杆菌肽 Sean M. McCarthy, Andrew J. Aubin, 和 Michael D. Jones 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用效益 ■ 快速分离短杆菌肽 ■ 载量线性响应 ■ 准确、高精度分析短杆菌肽的方法 ■ 有可能用于其它疏水性肽和蛋白质 沃特世解决方案 ACQUITY UPC2系统 ACQUITY® SQD ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱 Empower&trade 3软件 关键词 超高效合相色谱、UPC2、疏水性肽、短杆菌肽 简介 用反相液相色谱(RPLC)分析疏水性肽和蛋白质难度很大，因为溶液中经常需要使用洗涤剂保持疏水性物质的稳定性，而这些洗涤剂容易发生聚集和/或沉淀，严重影响它们的回收，这些因素以及其它原因使得难以用RPLC分离疏水性肽和蛋白质。 在本应用纪要中，我们为您介绍一种在ACQUITY UPC2TM系统上使用沃特世(Waters® )超高效合相色谱技术分离典型跨膜肽-短杆菌肽的方法。 短杆菌肽是由芽孢杆菌产生的一种常见和已被良好表征的跨膜肽物质，它被用作对抗革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌的局部用抗生素，短杆菌肽包括通用组成为甲酰-L-缬氨酸-甘氨酸-L-丙氨酸-D-亮氨酸-L-丙氨酸-D-缬氨酸-L-缬氨酸-D-缬氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-X-D-亮氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-色氨酸-氨基乙醇的一族化合物，其中X取决于短杆菌肽分子，即分别占总短杆菌肽量约87.5%、7.1%和5.1%的革兰氏A(X=色氨酸)、革兰氏B(X=苯丙氨酸)和革兰氏C(X=酪氨酸)，1需要交替的D和L氨基酸单元构成_-螺旋状。 我们研究了色谱柱化学品、流动相改性剂和梯度斜率对分离短杆菌肽的影响。采用优化方法分离市场上销售的非处方药物(OTC)，将测定的短杆菌肽浓度与标示量进行对比。采用质谱仪测定短杆菌肽的浓度，采用选择离子谱表征每种物质。在ACQUITY UPC2系统上使用我们的方法，可得到线性和可重复的结果&mdash &mdash 测定的OTC制剂浓度为标示量的98.4%。 试验 测试条件 除非另有说明，以下是用于所有色谱最终方法的最佳条件。 UPC2测试条件 UPC2系统: ACQUITY UPC2 检测器： PDA、ACQUITY SQD PDA @ 280nm,分辨率为6 nm(补偿400至500 nm) 色谱柱： ACQUITY UPC2 CSH 氟苯基,3.0 x 100 mm, 1.7 &mu m 柱温： 50 ° C 样品温度： 15 ° C UPC2 ABPR: 1885 psi 进样量： 1 &mu L 流速： 2.0 mL/min 流动相A： CO2 流动相B： 含0.1%TFA的甲醇(除非另有标示) 梯度： 20%至30% B，1.5min SQD条件 离子源： ES+ 锥孔电压： 20 V 毛细管电压：3.7kV 源温度： 150 ° C 脱溶剂气温度： 500 ° C 脱溶剂气体流速： 400 L/hr 锥孔气体流速： 25 L/hr SIR: 922.6,930.3,941.9 数据管理 Empower 3软件 样品描述 用解硫胺素芽孢杆菌(短芽孢杆菌)制备的短杆菌肽从Sigma Aldrich公司购买，将样品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL浓度的溶液，如需要，可用甲醇稀释。含有短杆菌肽的非处方软膏是从当地药店购买的。将0.2g软膏溶解在10mL正己烷中，然后用5mL甲醇萃取短杆菌肽，去除甲醇层，用0.2-&mu m的烧结玻璃盘过滤，然后直接进样ACQUITY UPC2系统。 结果与讨论 我们系统性地筛选了四种色谱柱，测定哪种分离效果最佳，结果如图1所示，色谱柱筛选过程可在1小时内非常快速地完成。在我们设定的筛选条件下，BEH 2-EP和BEH色谱柱未检测到谱峰，由于其它色谱柱表现出合适的色谱性能，因而未对这两者的非洗脱原因深入研究，其中ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱检测的色谱峰形最佳，因此采用该色谱柱继续研究。 图1.通过短杆菌肽标准物的色谱峰形和保留时间筛选各种化学特性色谱柱。所有色谱柱规格为3.0x100mm，填装亚-2-微米填料；所有分离条件都采用流动相 A：CO2、流动相 B、含0.1% FA的MeOH、2 mL/min, 3%B至25% B，5min。 为了分离短杆菌肽物质，对酸性改性剂的影响进行了研究，结果表明：使用三氟乙酸(TFA)可得到稍好的峰形，提高了短杆菌肽A和短杆菌肽C之间的分离度，结果如图2所示。已知TFA会抑制质谱电离，但每种物质的信号都足以定量检测治疗制剂，后续将对此进行讨论。对于要求更高灵敏度的应用，可能需要降低TFA浓度或使用甲酸，以达到希望的检测限值。 图2.酸性改性剂对分离短杆菌肽的影响。 当设置好合适色谱条件后，通过减少梯度时间优化分离过程，结果如图3所示，我们能够在1.5分钟时间内使每种短杆菌肽组分的分离度达到1.4或更高，在相同流速下通过减少运行时间增加梯度斜率，不但实现有效分离，同时还将短杆菌肽A的信噪比从336提高至605。 图3.UV 280-nm痕量检测优化分离短杆菌肽A、B和C。 我们测试了最佳分离条件，能够使用单四极杆质谱(SQD)检测每种物质，图4显示：每种物质都被质谱良好分离和检测到，另外每种短杆菌肽物质都显示含有绝大多数的M+2H离子，后续的研究将使用这些参数进行选择离子监测。 图4：每种短杆菌肽物质的总离子图谱-A和加合离子图谱-B-D。选择强度最高的离子评估市场上销售的抗菌制剂中的短杆菌肽含量，对于多肽序列，红色残基是L型同分异构体，黑色残基是D型同分异构体。 为了评估我们的方法是否适用于定量分析市场上销售的非处方药中的短杆菌肽，我们在ACQUITY SQD上使用选择离子监测，结果如图5A所示。我们绘制浓度-峰面积曲线，得到每种物质的校正曲线。结果发现：如图5B-D所示，每种成分在测试范围内都呈线性响应。另外还使用校正曲线测定了非处方药物中的每种短杆菌肽物质浓度。 图5，图A-25.0、12.5、1.25和0.625mg/mL浓度的标准溶液中含有短杆菌肽物质的叠加选择离子谱。图B、C和D-每种短杆菌肽A、B和C各自的MS峰面积线性拟合图。 使用开发的方法评估非处方药物中的短杆菌肽物质的浓度和相对丰度。如图6所示，重复分析结果表明：每种短杆菌肽%RSD值小，计算浓度与标签上的标称值相吻合；我们还发现短杆菌肽物质的相对丰度与文献报道的丰度非常吻合1。 图6. 从抗菌软膏中萃取的短杆菌肽A、B和C的叠加选择离子谱重复进样分析的计算RSD值(N=3)在可接受限值以内，计算丰度与文献报道数值非常吻合1。 结论 正如本应用纪要所展示的，ACQUITY UPC2系统与ACQUITYUPC2色谱柱化学结合使用，可为短杆菌肽提供简单、准确和可重现的分析方法。该工作表明ACQUITY UPC2系统可用于分析疏水性肽，还可能用于分析疏水性蛋白质，例如膜蛋白。 参考文献 1. The Merck Index and Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals.13th ed. Whitehouse Station, NJ : Merck Research Laboratories 2001. 关于沃特世公司 (www.waters.com) 50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。 作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。 2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。 联系人： 叶晓晨 沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部 xiao_chen_ye@waters.com 周瑞琳(GraceChow) 泰信策略(PMC) 020-83569288 13602845427 grace.chow@pmc.com.cn

结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mtb）引起的一类重大传染性疾病。据世卫组织发布的最新报告，在2020年，全球有近990万结核病患者，并有约151万人因结核感染导致死亡。中国科学院微生物研究所刘翠华课题组长期致力于研究Mtb等重要病原菌与宿主相互作用的分子机制，近年来发表系列研究工作，在病原菌与宿主相互作用机制方面取得重要成果，为抗结核治疗及药物研发提供了多种新思路和潜在新靶点。　　以往认为，健康个体受到Mtb感染时，往往会发展成为潜伏感染者或活动性TB患者。有趣的是，近年来临床上发现有一部分与TB患者持续密切接触的个体，既不发展为活动性TB患者并显示出相关症状，也未表现出潜伏感染者的免疫学诊断特征。这类长期密切接触病原菌的健康个体被称作TB抵抗者。　　目前对于这类TB抵抗者的抗感染免疫机制所知甚少，深入揭示相关机制有望为TB的预防和治疗提供新线索和新策略。近日，刘翠华课题组与首都医科大学附属北京胸科医院教授逄宇团队合作，揭示了TB抵抗者人群在应对Mtb感染时的固有免疫应答特征。该合作研究发现：与对照组、潜伏感染者及活动性TB患者相比，TB抵抗者的外周血单核巨噬细胞在受到Mtb侵染时，可产生更高水平的TNF-α、IL-1β及IL-6等细胞因子，并且其清除胞内病原菌的能力更强。　　随后的一系列筛选及功能验证实验结果表明：在Mtb感染过程中，组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）仅在TB抵抗者来源的巨噬细胞中维持稳定的表达水平及酶活性，而在其他实验组人群中出现显著下降。同时，进一步抑制或沉默HDAC6可阻抑TB抵抗者来源巨噬细胞中细胞因子的分泌以及其中含Mtb的囊泡的酸化能力。这些结果提示，TB抵抗者来源的巨噬细胞高效清除Mtb感染的能力依赖于HDAC6，后者可能是一个促进细胞因子产生以及自噬流畅通进而加速Mtb清除的关键宿主因子。综上，该研究揭示了TB抵抗者人群依赖HDAC6清除Mtb感染的固有免疫新机制，为临床上TB患者密切接触者的TB感染和发病风险预测提供了重要新标识，并为靶向宿主的TB治疗提供了新思路。　　目前，相关结果已在线发表于The FASEB Journal。该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金及北京市医院管理中心“扬帆”项目的支持。　　论文链接

新闻背景：近日微信朋友圈又一条信息疯传 &ldquo 今接妇幼保健院提示，请不要给宝宝喝爽歪歪、旺仔牛奶等牛奶饮料，都含有肉毒杆菌，现在紧急召回。&rdquo &ldquo 喝了会导致白血病&rdquo 。这让很多家长十分担心：什么是肉毒杆菌?乳饮料中会有肉毒杆菌吗?有何危害? 　　肉毒杆菌没有毒!肉毒毒素才是&ldquo 真凶&rdquo ! 　　说到肉毒杆菌，很多人首先是想到它毒性很强。不过，我还是想说，看到这个消息，首先还是不要太恐慌。 　　肉毒杆菌的全名叫肉毒梭状杆菌(Clostridiumbotulinum，也叫肉毒梭菌)，是自然界广泛存在的一种细菌，比如土壤、动物粪便中经常可以见到它，它们可以随着空气中漂浮的灰尘、小液滴飘散到四面八方，继而污染我们的食品。在食品生产过程，由于很难做到所有生产环境都无菌，乳饮料生产过程中也是可能被肉毒梭菌污染的。 　　不过，即使存在肉毒杆菌并不意味着一定有毒害。具有卫生学意义的检验在于是否检出肉毒毒素。若只检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明此食物会引起肉毒中毒。 　　肉毒杆菌家族一共兄弟7个，本身其实没有毒性，但其中有4个能在一定条件下产生肉毒毒素。肉毒毒素是一种毒性很强的物质，不到1微克就可以置人于死地。而且这种毒素具有较强的耐酸性，不但胃液无法破坏其毒性，胃肠道的蛋白酶也对其无计可施。 　　肉毒毒素不容易&ldquo 被生产&rdquo 且易&ldquo 被杀死&rdquo 　　但是，要想产生肉毒毒素也不是一件特别容易的事情。肉毒杆菌能够繁殖和产毒条件相当苛刻：要严格隔绝空气，还要适宜的水分活度、营养条件、环境温度。当这些条件有一个不满足的时候，它就不能繁殖，也不能产生毒素。 　　也正因为肉毒杆菌生存繁殖所需要的苛刻条件，虽然肉毒杆菌它在自然界常见，但食品污染却比较少见，而且主要出现在家庭自制食品。目前还没有因为喝乳饮料导致肉毒杆菌中毒是案例。我国引起中毒的食品大多是家庭自制的发酵食品，如豆瓣酱、豆酱、豆豉、臭豆腐等，有少数发生于各种不新鲜肉、蛋、鱼类食品 在我国的新疆、青海等少数民族地区几乎每年都会出现自制发酵肉制品导致的肉毒中毒、甚至死亡。日本以鱼制品引起中毒者较多 美国以家庭自制罐头、肉和乳制品引起中毒者为多，欧洲多见于腊肠、火腿和保藏的肉类。 　　而且，虽然肉毒素的毒性很强，但是它自己也有很明显的弱点：怕热。肉毒素对热很不稳定，通常75-85℃，加热30分钟或100℃，10分钟可被破坏，煮开几分钟就破坏掉了。 　　肉毒素中毒不会导致白血病 　　还有人问肉毒杆菌会导致白血病吗?其实，肉毒素中毒是神经型食物中毒，中毒时，肉毒素可抑制神经传导介质&mdash 乙酰胆碱的释放，其症状主要是神经系统症状，如视力模糊、眼脸下垂、复视、瞳孔散大、语言障碍、吞咽困难、呼吸困难，继续发展可由于呼吸肌麻痹引起呼吸功能衰竭而死亡，并没有证据认为肉毒中毒会导致白血病。 　　事实上，这条朋友圈消息已经被证实为谣言。当地的记者向妇幼保健院和食药监部门打电话求证了，都证实没有发布过相关消息，这条消息完全是捏造的，大可不必恐慌。 　　肉毒杆菌真正的麻烦：&ldquo 芽孢&rdquo 　　说了这么多也不是想告诉大家完全不用担心肉毒梭菌。肉毒杆菌真正的麻烦在于它的芽孢。肉毒梭菌芽孢抗热性很强，但是有芽孢也不意味着有毒，芽孢还没开始生长就不产生肉毒毒素，因此，通常认为对人是无害的。然而，在儿童体内，由于肠道菌群的缺乏，肉毒梭菌的芽胞在儿童的肠道弱碱厌氧环境中是能够产毒的，也就是说即便将食物中的肉毒素破坏掉，但是对儿童的危害是不容忽视的。因此，被肉毒梭菌污染的食物是不能给小于1岁的孩子吃的。 　　在食品加工中，人们也采用了一些方法来防止肉毒杆菌。最常用的方法就是添加亚硝酸盐的方法来抑制肉毒梭菌。除了添加亚硝酸盐外，美国FDA提示的方法包括加酸剂(肉毒梭菌在pH 值低于4.5时生长会被抑制)、减少水分含量、加盐、加亚硝酸盐等，或者集中同时使用。另外，还有通过加入发酵剂和发酵基质来抑制咸肉中肉毒梭菌的生长。 　　如何避免肉毒梭菌中毒? 　　肉毒中毒最常发生在一些家庭自制食品中。那么，如何避免肉毒梭菌中毒呢?推荐从三个方面做起： 　　(1)烹调食物尽量熟透，吃熟食。可能受肉毒梭菌污染的食物，如肉制品、罐头等，最好吃熟食，烹调熟透。这个是避免肉毒毒素危害最有效的方法。 　　(2)平时自己在家做自制食物时，要注意加工卫生，尤其要做一些发酵豆制品、发酵肉类时。如果实在不太会，就不要自制了。 　　(3)加工后的食品迅速冷却并低温储存。 　　参考资料： 　　[1] BAM: Clostridium botulinum. FDA 　　[2] Merle D. Pierson, Leslie A. Smoot,Michael C. Robach. Nitrite, nitrite alternatives, and the control ofClostridium Botulinum in cured meats. C R C Critical Reviews in Food Scienceand Nutrition. Volume 17, Issue 2, 1983 　　[3] 刘爱萍.肉毒梭菌的控制.肉类研究，2007. 　　[4]罗云波. 食品安全导论. 　　[5]WHO.Clostridium botulinum 　　注：本文为食品与营养信息交流中心人员阮光锋原创，作者授权转载。