大鼠肝癌细胞

水果树莓可明显抑制肝癌细胞系增殖，使肝癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达减弱，并使抑癌基因野生p53的表达增强。由哈医大附属第四医院刘明博士完成的一项国家自然基金课题，首次成功锁定树莓预防肝癌生长的两个特异性蛋白质作用靶点，为果蔬预防原发性肝癌提供了重要的理论依据。这一成果近日获得2008年度黑龙江省医药卫生科技进步一等奖。 　　2000年，刘明博士赴美国康奈尔大学研修深造期间，尝试将树莓中的鞣化酸与肝癌细胞混合培养，发现前者能显著抑制后者的生长。近年来，他从医学、营养学等角度开展了“树莓预防及抑制肝癌机制的研究”。 　　研究结果表明，随着树莓中植物化学物质浓度的增加，总抗氧化自由基清除能力也随之增强。0.25毫克/毫升至10毫克/毫升的树莓提取物对肝癌细胞系HepG-2的抑制率呈逐渐增加趋势，最高抑制率可达90%%左右。 　　在利用化学毒物黄曲霉毒素和二乙基亚硝胺建立的稳定大鼠原发肝癌模型上，随着树莓提取物浓度的增高，实验组大鼠肝脏上的瘤径变小，肿瘤的数量减少，成瘤率减低，结节程度减轻；肝癌细胞VEGF、增殖细胞核抗原表达的程度亦明显降低。同时，实验组大鼠血清在两种特异蛋白(M2597、M4513)质峰上与树莓干预组及正常大鼠血清差异明显，说明蛋白质峰M2597、M4513极有可能为树莓预防肝癌的蛋白质作用靶点。 　　专家评价，今后，利用树莓中提取的植物化学成分，进行合理搭配及组成预防剂，十分有助于防范肝癌的发生，并能抑制肝癌的发展，提高患者生存率。

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是发病率高、治疗困难、死亡率高的恶性肿瘤，全球每年有1000000人死于肝癌。我国肝癌的死亡率在所有恶性肿瘤中居第二位，年死于肝癌的人数占全世界肝癌年死亡总数的53%。虽然肝癌的诊断和治疗有了长足的进步，但生存率在总体水平上变化不是很明显。迄今已建立的一系列人肝癌细胞系（cell line）和人肝癌细胞系的动物模型，为肝癌的发病机理和治疗研究奠定了良好的基础。咱们坛子里是否有做这方面工作的战友，分享一下相关文献。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=122088]人肝癌细胞系研究进展[/url]

肝癌是全球第3大癌症死亡原因，其中肝细胞癌约占所有肝癌类型的80%[1]。据世界卫生组织统计，每年因肝细胞癌死亡的人数高达83万例，且其发病率和死亡率仍呈现上升趋势，严重损害人类生命健康[2]。在慢性肝病的基础上，基因突变、表观遗传变化、信号通路失调和血管生成异常等分子机制相互作用，共同推动慢性肝病向肝细胞癌过程的发展[3]。目前肝细胞癌治疗的一线药物主要是索拉菲尼、仑伐替尼等靶向药及阿替利珠单抗、贝伐珠单抗等免疫治疗药物[4]。然而，靶向药及免疫治疗药的耐药性和不良反应导致肝细胞癌的5年生存率仍然不高。因此，亟需寻找安全性高、不良反应少的治疗药物，为肝细胞癌患者提供更有效、安全的治疗选择。 近年来，随着对肝细胞癌研究的不断深入，自噬在肝细胞癌中的作用逐渐被关注。在肝细胞癌的发展过程中，自噬一方面通过维持细胞内稳态来抑制肿瘤起始，另一方面通过影响信号通路的效应因子来抑制早期肝细胞癌的进程[5]。自噬受到多种机制的严格调控和影响，涉及自噬的几条重要信号通路有Wnt/β-catenin、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p53通路等[6]，这些通路在肝细胞癌中异常激活，参与肝癌细胞的增殖、凋亡和自噬等生物学行为。研究表明，mTOR通路在自噬调控机制中发挥至关重要的作用[7]，mTOR是自噬的负性调控因子，可以与UNC-51样激酶1（Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）的丝氨酸结合抑制自噬的启动过程，也可以通过磷酸化使自噬调节复合物失活影响自噬小体的发生，磷酸化自噬相关蛋白14（autophagy-related protein 14，Atg14）、自噬和Beclin-1调节器1（activating molecule in beclin-1 regulated autophagy protein 1，AMBRA1）和核受体结合因子2（nuclear receptor binding factor 2，NRBF2）直接调节自噬的成核步骤[8]。因此，针对自噬及其机制开展治疗可能是肝细胞癌的有效对抗策略。 地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.的干燥根，具有凉血止血、解毒敛疮的功效。地榆皂苷II是从地榆中提取的一种三萜皂苷类化合物，现代药理学研究发现，地榆皂苷II不仅具有抗炎、抗氧化、免疫调节的药理作用，同时具有广泛的抗肿瘤活性[9-11]，能通过多种途径抑制多种癌症的发生和发展，其机制可能与阻滞细胞周期、促进细胞凋亡和细胞自噬有关[12-15]。课题组前期研究发现，地榆皂苷II能够抑制小鼠肝细胞癌的发展[15]。然而，地榆皂苷II是否能通过影响Akt/mTOR通路诱导凋亡和自噬抑制肝细胞癌尚不明确。本研究中选择人肝癌HepG2细胞和小鼠肝癌Hepa1-6细胞作为研究对象，探究地榆皂苷II对肝癌细胞增殖、自噬和凋亡的影响，探讨地榆皂苷II在抗肝细胞癌方面的潜在作用机制，为将来用于临床治疗提供数据支持。 1 材料 1.1 细胞 HepG2细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，Hepa1-6细胞购自上海富衡生物科技有限公司。 1.2 药品与试剂 地榆皂苷II（批号MUST-11051204，质量分数≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；PVDF膜（批号IPVH00010）购自美国Sigma公司；青霉素-链霉素（批号S11JV）购自上海源培生物科技股份有限公司；DMEM培养基（批号C11995500BT）、胎牛血清（批号A3160801）购自美国Gibco公司；PBS（批号WHB823K091）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；0.25%胰酶消化液（批号C0203）、RIPA组织/细胞裂解液（批号P0013C）、蛋白酶抑制剂混合物（批号P1050-1）、磷酸酶抑制剂混合物（批号P1050-2）、EdU-555细胞增殖检测试剂盒（批号C0075S）购自上海碧云天生物技术有限公司；CCK-8试剂盒（批号A311-02）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号E112-01）、高敏型ECL化学发光检测试剂盒（批号E412-01）、相对分子质量为1.8×105的蛋白marker（批号MP-102AA）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；一抗稀释液（批号G2025）、二抗稀释液（批号G2009）、高相对分子质量marker（批号26625）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；7.5% PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号PG111）、10% PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号PG112）、12.5% PAGE凝胶快速制备试剂盒（批号PG113）购自上海雅酶生物医药科技有限公司；β-actin、Beclin1抗体（批号分别为20536-1-AP、11306-1-AP）购自美国Proteintech公司；B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、p62抗体（批号分别为ab196495、ab56416）购自英国Abcam公司；Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、Caspase-8、cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗体（批号分别为5023T、9662S、4790T、9664T、4685S、4060T、2972S、5536T）购自美国CST公司；甲醇（批号10014118）购自国药集团化学试剂有限公司；山羊抗兔二抗（批号RS0002）购自美国ImmunoWay公司；Annexin V-FITC染色液（批号E-CK-A211）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。 1.3 仪器 AL104型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；HH-S型恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；CKX53型倒置生物显微镜、IX73倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；3111型CO2培养箱、Multiskan Go-1510型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Centrifuge 5424R型微量离心机（德国Eppendorf公司）；SDS PAGE凝胶电泳及转膜电泳仪（美国Bio-Rad公司）；BETS-M5型转移微型翘板摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；XH-C型涡旋混合器（金坛市医疗仪器厂）；MINI-4K型微型离心机（杭州米欧仪器有限公司）；5200型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；CytoFLEX流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；ThermoCell恒温金属浴（杭州博日科技股份有限公司）。 2 方法 2.1 CCK-8实验 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于96孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组、不同剂量地榆皂苷II组，对照组仅加入培养基，其余各组分别加入5、10、15、20、30、40、60、80、100 μmol/L相应药物，继续培养24 h，用CCK-8试剂盒测定各组吸光度（A）值，计算细胞存活率。 细胞存活率＝(A实验－A空白)/(A对照－A空白) 2.2 EdU实验 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于96孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组和地榆皂苷II（10、20、40 μmol/L）组，给药组给予相应药物，对照组仅加入培养基，继续培养24 h。将EdU稀释到2×EdU工作液（20 μmol/L），预热后等体积加入96孔板中，孵育细胞2 h后去除培养液，加入100 μL固定液（4%多聚甲醛），孵育10 min后去除固定液，用100 μL洗涤液洗涤细胞3次后每孔加入100 μL通透液（含0.3% Triton X-100的PBS），室温孵育15 min。去除通透液，每孔用1 mL洗涤液洗涤细胞2次，每次5 min。参考说明书配制Click反应液。每孔加入50 μL Click反应液，轻轻摇晃培养板后室温避光孵育30 min。洗涤液洗涤3次，吸除洗涤液后，每孔加Hoechst 33342溶液100 μL，室温避光孵育10 min。用洗涤液洗涤3次，每次3～5 min，随后进行荧光检测。 2.3 细胞凋亡检测 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于6孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组和地榆皂苷II（10、20、40 μmol/L）组，给药组给予相应药物，对照组仅加入培养基，继续培养24 h。用胰酶消化细胞，300×g离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS洗涤，轻轻重悬细胞，300×g离心5 min，弃上清。用PBS洗涤细胞，离心后弃上清，加入Annexin V Binding Buffer重悬细胞。细胞悬液中加入Annexin V-FITC Reagent和5 μL的碘化丙啶（PI），轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15～20 min，立即上机检测。 2.4 Western blotting检测相关蛋白表达 将HepG2和Hepa1-6细胞分别以1×105个/mL接种于6孔板中，贴壁生长24 h，设置对照组和地榆皂苷II（10、20、40 μmol/L）组，给药组给予相应药物，对照组仅加入培养基，继续培养24 h。加入RIPA中强度缓冲液裂解后收集细胞，使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。蛋白样品经凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉，封闭1.5 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜；洗膜3次后加入二抗，4 ℃孵育1.5 h；最后使用ECL化学发光检测试剂盒，用化学发光图像分析系统显影。 2.5 统计学分析 采用GraphPad Prism 9统计软件对实验数据进统计学分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。 3 结果 3.1 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞增殖的影响 如图1所示，与对照组比较，随着地榆皂苷II浓度的升高，HepG2和Hepa1-6肝癌细胞的存活率明显降低，且呈剂量相关性。经GraphPad Prism 9软件分析，地榆皂苷II对HepG2、Hepa1-6细胞的IC50值分别为26.94、26.18 μmol/L，因此以10、20、40 μmol/L作为后续地榆皂苷II的给药剂量。 图片 3.2 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞增殖的影响 EdU-555阳性表示细胞正处于增殖状态，Hoechst33342阳性指示细胞为活细胞，EdU-555/Hoechst33342表示细胞的增殖率。如图2所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药后HepG2和Hepa1-6细胞的EdU-555/Hoechst33342值明显降低（P＜0.05、0.001），表明地榆皂苷II能够抑制肝癌细胞的增殖。 图片 3.3 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞凋亡的影响 如图3所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组HepG2和Hepa1-6细胞凋亡率显著升高（P＜0.01、0.001）。凋亡蛋白（包括调控凋亡的激活因子和执行凋亡的效应因子）参与细胞凋亡的过程。采用Western blotting检测地榆皂苷II对HepG2细胞和Hepa1-6细胞凋亡相关蛋白表达的影响，如图4所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2蛋白表达量显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达量显著升高（P＜0.05、0.01）。以上结果说明地榆皂苷II促进HepG2和Hepa1-6细胞的凋亡。 图片 图片 3.4 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6肝癌细胞自噬的影响 采用Western blotting检测细胞中代表自噬的核心蛋白LC3II、LC3Ⅰ、Beclin1、p62表达量，如图5所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值明显升高（P＜0.05、0.01、0.001），Beclin1蛋白表达量上升（P＜0.05、0.01），p62蛋白表达量明显下降（P＜0.05、0.01），表明地榆皂苷II促进HepG2和Hepa1-6肝癌细胞的自噬。 图片 3.5 地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6细胞中Akt/mTOR信号通路蛋白表达的影响 采用Western blotting检测地榆皂苷II给药后Akt/mTOR信号通路蛋白表达量，如图6所示，与对照组比较，地榆皂苷II给药组p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值明显下降（P＜0.05、0.01、0.001），表明地榆皂苷II能够抑制Akt/mTOR信号通路。 图片 4 讨论 肝细胞癌具有高发病率、高病死率的特点，虽然目前肝细胞癌研究备受关注，但其5年生存率仍为14.1%[16]。因此，迫切需要发现新的治疗策略和候选药物。近年来，地榆皂苷II在抗肿瘤方面的研究不断深入，研究发现地榆皂苷II抑制肿瘤与细胞自噬和凋亡存在紧密的关联，地榆皂苷II可通过诱导细胞凋亡来显著抑制乳腺癌MDA-MB-435细胞和胃癌BGC-823细胞的增殖[14-15]，诱导自噬显著抑制结直肠癌细胞增殖[17]。课题组既往研究证明，地榆皂苷II可在体内抑制肝细胞癌，其机制可能与抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路有关[15]。然而，目前关于地榆皂苷II是否通过自噬和凋亡抑制肝细胞癌及其机制尚不明确。因此，本研究利用体外实验对地榆皂苷II刺激后肝癌细胞的增殖、自噬、凋亡及相关机制进行探究，结果表明，地榆皂苷II能抑制肝癌细胞的增殖，促进肝癌细胞的凋亡和自噬，其机制与抑制Akt/mTOR通路有关。 自噬又被称为II型程序性死亡，负责真核生物细胞质中细胞器、蛋白质和大分子的降解和回收。细胞中降解和回收的底物被吞噬后形成自噬体，自噬体与溶酶体结合形成自噬酶体最后降解。本研究检测了自噬中具有代表性的LC3、p62和Beclin1蛋白。Beclin1蛋白是一种自噬启动子，帮助自噬过程中囊泡的形成[18]，地榆皂苷II作用于肝癌细胞后，Beclin1蛋白表达量上升，促进自噬启动，囊泡形成增多，从而自噬水平升高。在自噬形成时，LC3I通过泛素激活酶E1和泛素结合酶E2与磷脂酰乙醇胺偶联，生成LC3II，LC3II存在于自噬体的表面，负责膜的融合和选择性降解过程[19]，p62在自噬体表面与LC3II相互作用后包裹进自噬体降解，与LC3II共同调节选择性降解过程[20]。地榆皂苷II给药后LC3II/LC3I值增高，p62蛋白表达量下降，促进自噬过程中自噬囊泡的融合和降解，进而促进自噬。Beclin1是自噬过程中的核心因子，已有研究证明Beclin1可以与抗凋亡因子Bcl-2相互作用，从而对凋亡过程产生影响[21]。细胞凋亡是一种生理性或病理性的程序性的死亡过程，近年来通过诱导促进癌细胞的凋亡来控制癌症一直是抗肿瘤的热点。Caspase级联反应是细胞凋亡过程的关键步骤，其启动受到抗凋亡因子和促凋亡因子Bcl-2和Bax的调节。在Caspase级联反应中，启动性Caspase包括Caspase-8、Caspase-9被激活后调控下游执行性Caspase如Caspase-3进而引起凋亡反应[22-24]。地榆皂苷II作用于肝癌细胞后，细胞中的Bcl-2蛋白表达量减少，Bax蛋白表达量增多，Bax蛋白在线粒体表面形成孔道，释放细胞色素C，引发Caspase级联反应，Caspase-8、Caspase-9激活进而诱导下游的Caspase-3活化为cleaved Caspase-3，切割下游多种底物，促进细胞凋亡典型形态变化。 Akt/mTOR信号通路在正常细胞生理过程中发挥关键作用，同时在多种癌症中，该通路的异常激活对自噬、细胞凋亡、化疗耐药性及转移过程产生重要影响[25]。诸多研究证据表明，Akt/mTOR途径是调控癌症细胞自噬反应的核心通路[26-28]。地榆皂苷II作用于肝癌细胞后，Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平显著下降，Akt/mTOR信号通路被抑制，激活肝癌细胞凋亡和自噬，抑制肝癌细胞的增殖（图7，由Figdraw绘制）。 图片 上述体外研究结果初步解析了地榆皂苷II抑制肝细胞癌的机制，即地榆皂苷II通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导肝癌细胞的凋亡和自噬，抑制肝癌细胞增殖，为地榆皂苷II在肝细胞癌治疗的药物研究开发中提供了药理学证据。