细胞转瓶培养器

细胞培养是一项非常重要的实验技术，已经成为生物制药、生命科学、临床移植等领域*的一种研究方式。细胞培养必须借助细胞耗材方能达到细胞生长所需的条件，细胞培养瓶和培养皿是常见的两大类，那么这两种耗材有什么区别呢? 　　细胞培养瓶适合长期培养、传代、作为种子细胞，瓶口较小，细胞不易被污染。细胞培养皿适合在各种实验中选用，临时培养。二者的区别在于安全系数的高低和培养细胞数量的多少。以细胞为载体或者对象的实验用培养皿比较好，因为用的量比较少，节约细胞，而且培养皿比较方便做对照实验，但是培养皿开口较大，相对更容易污染，所以操作时更要小心。 　　组织块原代培养或容易被污染的细胞培养时用培养瓶，长出的细胞传代后就可以依个人喜好而定，细胞培养瓶的面积较大，所以需要大量扩增细胞的时候可以用培养瓶。 　　细胞培养瓶和培养皿都是实验室里面用于微生物或细胞培养的容器，具体选用哪种耗材要根据实验的具体需求而定，还要考虑到细胞的培养方式，是悬浮培养还是贴壁培养，合适的耗材是实验成功的基础。

作者： 陈文庆 王建超 刘华杰 高飞 张韧 （北京清大天一科技有限公司 102200 ） （《中国兽药杂志》 2010.44 （ 10 ）： 37-41 ）【摘要】 采用反应器全悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒与微载体悬浮培养Vero细胞生产狂犬病毒分别与相应的转瓶培养工艺生产案例对比分析，比较悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的生产效益。分析显示，与转瓶培养工艺相比，反应器悬浮培养工艺获得的细胞密度、病毒效价、产品的产量和质量明显提高，生产时的能耗和劳动力需求明显降低。结果表明悬浮培养工艺的生产效益明显高于转瓶培养工艺，适宜于国内生物制品工业化生产的升级换代。【关键词 】 细胞培养；生物反应器；悬浮培养；微载体细胞悬浮培养技术是指细胞在生物反应器中自由悬浮于培养液内生长增殖的一种培养方法。根据细胞是否贴壁，又分为全悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体培养。国际上该项技术发展较快，已趋向成熟，是疫苗、抗体等生物制品生产的普遍生产工艺模式。与转瓶培养技术相比，该工艺具有操作简单、产率高、容易放大等优点，本文结合口蹄疫病毒和狂犬病毒的生产，分别对细胞悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的经济效益等进行了分析和分析。1. 全悬浮培养口蹄疫病毒与转瓶培养案例对比高效、安全的病毒性疫苗是防止口蹄疫情发生的最有效方法。BHK21细胞是繁殖FMDV的理想宿主，早在1962年Capstick PB等就实现FMDV的悬浮培养。1965年Telling, R.C.等实现在不锈钢发酵罐中悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗。目前国外（Intervet公司、Merial公司）普遍已经采用2000~5000L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫苗。本文就本公司自主研发的650L生物反应器和无血清培养基进行悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗与转瓶培养工艺进行比较和分析。1.1主要材料细胞株：BHK21贴壁细胞株（中国兽医药品监察所）毒 株：FMDV-O型（某兽用疫苗企业）培养基：低血清MEM培养基(产品代号MD611)、BHK21细胞无血清培养基（北京清大天一科技有限公司）血 清：特级新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）仪 器：5 L反应器（德国贝朗），120L和650LCLAVORUS ® 生物反应器（北京清大天一科技有限公司）1.2实验方法1.2.1转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒将复苏的BHK21细胞在T75培养瓶中使用低血清培养基（含5％牛血清）培养，连续传代扩增接种15L转瓶，37 ℃培养48小时，传代比例为1:8-1:10，按常规方法接种病毒及维持液，细胞病变90%左右收获病毒液。1.2.2反应器全悬浮无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒（1）贴壁细胞悬浮驯化培养：用BHK21细胞无血清培养基在恒温摇床或者方瓶中无血清驯化贴壁BHK21细胞，可采用直接驯化或者逐级降低血清驯化等方法，每代观察细胞数量和细胞活率，直至BHK21细胞在无血清培养基中的生长增殖速率正常，细胞活率达95%以上，并可连续稳定传代，说明细胞已适应无血清悬浮培养。（2）反应器用种子细胞扩增：采用反应器罐倒罐逐级放大技术，细胞从摇瓶→5 L反应器→120 L反应器→650 L反应器进行逐级放大培养。细胞培养方式为批培养，控制反应器各参数在正常范围：温度37.0 ℃、pH7.2~7.4、溶氧（DO）20~70%、搅拌转速50~150 r/min。（3）反应器培养口蹄疫病毒：待650 L反应器中细胞达到一定密度，提高培养pH至7.5左右，按一定比例直接接种口蹄疫病毒进行病毒维持培养，控制温度、pH、DO、搅拌转速等参数在合适范围，在线无菌间隔取样判断细胞病变情况并检测病毒毒价（LD50,TCID50），确定收获的最佳时间。1.3 细胞培养结果对比分别对低血清培养基15 L转瓶培养的贴壁BHK21细胞进行观察和细胞计数，反应器全悬浮培养的BHK21细胞取样进行数量和活率检测。培养条件和结果对比见表1。表1 转瓶培养和反应器全悬浮培养BHK21细胞对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442105_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442106_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442107_small.jpg 图1 转瓶BHK21细胞低血清培养48 hr，100X 图2 反应器全悬浮无血清培养48 hr，100X 结果显示，转瓶培养的BHK21细胞，培养48小时显微镜观察成致密单层，见图1，96小时细胞开始出现脱落死亡；反应器无血清全悬浮培养BHK21细胞48小时的细胞显微镜观察状态如图2，生长至96小时细胞密度可达5.4x106 cells/ml，活率维持在94%左右。从细胞数量比较，650L反应器培养一批的细胞数量相当于500～700个15 L转瓶培养的细胞总量。1.4 病毒培养效果对比两种不同培养工艺，细胞在满足活力要求的基础上，以同等条件分别接种FMDV病毒，取样测定病毒毒价，结果见表2。 表2 转瓶和反应器全悬浮培养BHK21细胞病毒毒价对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442112_small.jpg结果表明，无血清悬浮培养的口蹄疫病毒毒价（TCID50和LD50）检测不低于转瓶培养工艺。根据反应器低血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫完整病毒粒子（146S）检测较转瓶高10倍左右的情况，应用无血清悬浮培养工艺，杂蛋白含量更少，口蹄疫完整病毒粒子和口蹄疫疫苗质量均提高。1.5 反应器和转瓶经济效益估算对比依据培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺过程要求，从细胞密度、病毒毒价、产品效力、资源环境、劳动力等方面进行简单对比，借以一窥二者的经济效益差别（见表3）。 表3 反应器无血清悬浮培养与转瓶培养BHK21细胞经济效益对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442114_small.jpg*按照反应器无血清悬浮培养一条生产线（5L-120L-650L）、转瓶体积15 L进行对比按照目前培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒质量要求，对悬浮无血清培养工艺的产能进行预估，一条5L-120L-650L的反应器生产线年生产病毒量约为2.1亿毫升，生产疫苗量约为4.2亿毫升。2. 人狂犬病毒微载体培养与转瓶培养的对比我国是受狂犬病危害最为严重的国家之一，近年报告狂犬病死亡人数均在2400人/年以上，一直位居我国各类传染病报告死亡数的前三位，根据有关国家成功控制狂犬病的经验，世界卫生组织提出倡议，到2020年消除人狂犬病。我国距此倡议目标还有大量工作要做，国内也对人用和兽用狂犬病疫苗的生产做了大量研究工作。下面就120L反应器微载体培养Vero细胞生产狂犬病毒效果与转瓶培养工艺和培养效果比较分析。2.1主要材料细胞株：Vero细胞株毒 株：aG株（细胞株和毒株均来自某人用疫苗企业）培养基：低血清199培养基（产品代号MD504）、 Vero细胞反应器培养用培养基（产品代号MD505）, 均来自北京清大天一科技有限公司仪 器：5 L反应器（德国贝朗）、120LCLAVORUS ® 生物反应器（北京清大天一科技有限公司）血 清：特级新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）微载体：Cytodex 1 （美国GE

对于微生物培养，大家常用的是恒温培养箱、霉菌培养箱、震荡培养箱、恒温水浴箱、发酵罐等，满足了日常工作需要；当然，这都是针对好氧菌而言。 而对于厌氧菌和兼性好氧菌，则需要考虑选用合适的厌氧、微好氧/低氧培养装置（如厌氧培养盒/袋、厌氧罐以及专业的厌氧培养箱、厌氧工作站、微好氧/低氧培养箱、厌氧发酵罐/反应池等）。 常规的动物细胞培养，一般选用CO2培养箱、滚瓶培养装置、悬浮培养装置、生物反应器/细胞培养罐等。为更接近或模拟体内微环境，三气培养箱（即CO2培养箱加配O2传感器）逐渐为人们所熟知！当然，更专业的Biospherix 系列O2/CO2控制器加培养盒、H35微好氧/低氧细胞培养箱、X vivo 一体化细胞工作站等三气培养装置也给大家提供了更多的选择！

注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ，可在配制时调 PH 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。R 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

张韧，王建超，陈文庆，刘华杰，高飞，徐舸辰，林龙飞（北京清大天一科技有限公司，北京102200） 反应器悬浮培养技术是目前国内外疫苗生产的热点之一，它可以极大提高疫苗的质量和生产率。介绍了该技术在国内外疫苗生产中的研发和应用现状，表明国内该技术目前已经在口蹄疫疫苗生产中获得成功应用，利用MDCK、Vero等细胞培养生产禽流感疫苗的技术也正在积极研发中，并将逐步替代传统的鸡胚生产工艺。积极推广和应用这一新型疫苗生产技术将是我国兽用生物制品行业升级换代的必然趋势。 生物反应器；悬浮培养；微载体培养；口蹄疫；禽流感 在我国，细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产领域的研发和应用正成为行业技术革新、产业升级的重要内容。农业部公告第1708号中明确规定，自2012年2月1日起，各省级兽医行政管理部门停止转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。该公告对动物疫苗生产技术升级做出了强制性规定。本文就反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在口蹄疫疫苗和禽流感疫苗生产中的国内外应用和发展进行了综述，分析了动物疫苗产业发展趋势和我国疫苗产业技术升级所面临的机遇和挑战。1 反应器悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用口蹄疫被认为家畜传染性疾病中传染性最强的一种疾病，国际兽医局（OIE）将之列为A类传染病。2010和2011年，在亚洲、非洲都有口蹄疫局部的爆发。接种安全、高效的疫苗是预防口蹄疫疫情发生的最有效策略之一。通常主要通过浓缩技术提高口蹄疫疫苗的有效抗原量来实现其高效性；通过病毒纯化工艺、有效的病毒灭活工艺来保证疫苗的安全性。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒能显著提高口蹄疫病毒抗原浓度。国际上先进的口蹄疫疫苗的生产工艺都采用反应器悬浮培养BHK21细胞技术、有效的病毒纯化工艺及二次病毒灭活工艺。当前，面对国内外严峻的口蹄疫防控形势，高质量的口蹄疫疫苗必将在口蹄疫防控中发挥关键作用。1.1 国外应用现状和发展趋势 BHK21细胞是繁殖口蹄疫病毒的理想宿主。20世纪60年代，许多国家实验室建立起了转瓶培养BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的生产系统。1962年BHK21细胞悬浮培养成功，细胞增殖迅速，并成功应用于口蹄疫病毒的生产。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒也就成为最普遍的口蹄疫疫苗生产方式，主要集中在印度、土耳其、巴西、阿根廷等国家（表1）。印度口蹄疫生产企业使用8000L反应器生产口蹄疫疫苗，南美口蹄疫疫苗生产企业一般采用3000~5000 L反应器生产口蹄疫疫苗，口蹄疫病毒抗原146S浓度大约在2 μg/mL。因为口蹄疫疫苗保护力与146S有正相关性，这些企业根据口蹄疫病毒146S来配制疫苗有效地保证了疫苗的质量。表1 国外部分悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗企业及其生产工艺http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1375859824_small.jpg*来自作者所属公司的客户信息调查但是，这种20世纪60年代开发的口蹄疫疫苗生产工艺延续至今，存在许多技术上的缺陷。国外口蹄疫疫苗生产使用的BHK21细胞培养液是添加磷酸肉汤（Tryptosephosphate broth, TPB）或水解乳蛋白（Lactalbumin hydrolysate, LAH）的GMEM及EMEM，再补加5%~10%牛血清（表1）。不同批次间血清质量差异引起细胞培养效果不稳定，导致影响疫苗生产工艺的稳定性和疫苗质量。疫苗中残留的血清蛋白使接种动物过敏反应升高，一定程度上影响疫苗的安全性。在口蹄疫强制免疫的国家，牛血清中存在含有抗口蹄疫病毒抗体的可能性，不仅影响病毒繁殖，而且可能导致口蹄疫病毒在抗体压力下选择性变异。牛血清中潜在污染朊病毒或疯牛病病毒可给动物疫苗带来潜在的生物危害，TPB或LAH等动物来源成份也存在安全隐患。为提升产品质量及安全性，目前国外多数口蹄疫疫苗生产厂家急于将现使用的含血清生产工艺升级为不含血清生产工艺。自从20世纪的80年代起，细胞培养基（液）发展迅速，低血清细胞培养基、无血清细胞培养基、无血清无动物来源成分细胞培养基已商品化，为疫苗生产中少使用或不使用血清奠定了物质基础。1.2 国内应用现状 默克密理博北京清大天一科技有限公司（以下简称“清大天一”）在国内较早开发了BHK21低血清细胞培养基和BHK21无血清无动物来源成分细胞培养基。2008年，清大天一开发了BHK21低血清细胞培养基及反应器悬浮培养BHK21技术，并于2009年成功应用到国内一家口蹄疫疫苗生产企业中。使用该工艺生产的口蹄疫抗原146S浓度可以达到3 μg/mL左右，工艺全过程管道化操作，产品内毒素含量低，口蹄疫疫苗生产和质量显著提高，同时生产成本下降30%。2009年，清大天一成功开发了BHK21无血清无动物来源成分培养基和反应器无血清悬浮培养BHK21细胞技术，并 2010年成功应用到国内某口蹄疫生产企业。相比于含血清悬浮培养工艺，无血清悬浮培养工艺具有巨大的技术优势。从种子库复苏BHK21细胞开始，到口蹄疫病毒繁殖、直至收获的全过程，不添加任何的血清和动物来源成分，消除了血清抗体对病毒繁殖的干扰，同时减轻了纯化压力。无血清悬浮培养BHK21细胞的细胞密度可以达到5×106~6×106/mL以上，为生产高浓度口蹄疫疫苗奠定了技术基础。图1是反应器无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒的工艺流程图，相比于含血清口蹄疫病毒生产工艺，因实现细胞无血清培养，工艺过程无需沉降换液。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1375859832_small.jpg 图1 4000L反应器无血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺流程目前国内某企业使用该工艺生产的口蹄疫疫苗正处于报批阶段，其他多家口蹄疫疫苗生产企业及研究单位也在研发或寻求无血清悬浮培养生产口蹄疫疫苗的工艺。

从大小来讲，细胞培养瓶约可分为约600ml，250ml，50ml和25ml的，一般都经过表面改性处理，适合细胞贴壁和生长。600ml 、300ml的多用于大规模培养时用（如单克隆细胞的培养等），50ml的多用于一般性细胞实验用（一般性的传代，保存细胞，为实验提供细胞等），25ml一般是用来复苏细胞或细胞较少时的培养，还有做原代细胞时也可以做多瓶而避免交叉污染。当然还有其他如圆形的等，都可根据个人爱好和实验需要自己选择。 根据细胞培养瓶制作材料的不同，也有玻璃和塑料之分，这里谈一点自己的浅见（欢迎不同意见的战友拍砖）。不同的细胞对胰酶的敏感度不一样，所以在实验中我们常常会遇到一些细胞消化半天也没有起色，导致细胞状态不断下滑，直至最后的死亡以至于实验进展的不顺利。当然，有时候是可以通过加一些EDTA等来增强胰酶的能力，或者提高胰酶的浓度来实现，在培养一些细胞过程中，我发现，一些细胞对玻璃和塑料制品粘附能力不同，如RAW264.7，平滑肌细胞等，在转换培养瓶之后，可以发现好消化了很多，并且在回到原制品的培养瓶时不会改变它的贴壁能力。这里希望有经验的战友可以分享你们的经验。 关于培养板的购买其实我也没有什么经验，想说的就是要尽量避免购买国产的培养板，国产的一些培养瓶还可以，但是培养板我们买过很多国产的，确实效果不是很好，细胞在里面基本上长的非常非常磕碜。所以经费富余的情况下，这些东西能买进口的就买吧。大公司的基本都可以买，BD，Corning等等。这些东西原则上是一次性的，但是我们大部分实验室根本不可能做到，其实泡酸，洗干净再用也没问题，毕竟我们没有老外那么富足的经费，所以我们就累点吧，多做点体力活锻炼一下身体吧。滴管其实也没什么好说的，国产的就足够了。要说的是图中我比较喜欢用C类的滴管，原因就是塞上棉花后吹打细胞不会怕棉花湿掉而引起污染，而且用完棉花也方便取出，便于下次再用。

新型细胞培养系统研制成功作者：张笑 来源：科学网美国威斯康辛大学麦迪逊分校的科学家们近日开发出一套新细胞培养系统，有望为细胞治疗提供更加一致和安全的细胞培养物。11月14日的《自然—方法学》刊登了这一成果。领导这项研究的Laura Kiessling教授表示这套系统并不昂贵，可承担多能细胞培养中的大量预估工作。这项技术“很简单”，“任何人都能使用”。目前，大部分人类胚胎干细胞的培养都是作为实验室研究用途的，而通常所采用的培养方法又容易造成各种污染。这套新系统采用一种化学合成制得的可与干细胞相结合的蛋白片段底物，并通过与特定培养基结合，可将细胞培养固定在未分化阶段达三个月或者更长时间。据报告显示，该系统亦可用于诱导多功能干细胞培养。“科学家现在普遍采用的培养系统都有着非特定的缺点，并且缺乏一致性，以致出现质量差异”， 领导这项研究的Laura Kiessling教授解释，“我们研发的这套系统特定性很好，而且并不贵”。（科学网 张笑/编译）相关仪器及方法：新型细胞培养系统 IX81显微镜 7500 Fast实时PCR系统 发光光度计

[b][font=宋体]细胞培养实验室组建的基本要求[/font]:[/b]1[font=宋体]、细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。[/font]2[font=宋体]、细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。[/font]3[font=宋体]、细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，为[/font]10[font=宋体]万级洁净环境的洁净室。而洗刷消毒工作设在洁净室外，避免物品污染洁净室内环境。细胞洁净室需要一个空调系统并对外界保持一定的正压。[/font]4[font=宋体]、解剖实验室主要用于对器官组织的分离，需要有无菌操作台、解剖显微镜、各种手术器材等。[/font] [align=center][url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/shiyanshilixinji/2018-10-12/301.html][img=实验室离心机]http://www.hexiyiqi.com/d/file/hexi2012chanpinzhongxin/luodishigaosulengdonglixinji/2019-05-14/4b60dacaa256bcc4fe665e2eb3536c0a.jpg[/img][/url][/align][align=center][b]智能台式高速冷冻实验室离心机 3H24RI[/b][/align][font=宋体]组织细胞培养室除一般实验室的普通常规设备外，尚有一些特殊需要的设备。基本可分为两大类：[/font][font=宋体]第一类为常用的基本设备；[/font][font=宋体]第二类为较高级的特殊设备。[/font][b]1. [font=宋体]细胞培养实验室常用的基本仪器设备[/font]1.[font=宋体]显微镜：[/font][/b][font=宋体]倒置显微镜——是组织细胞培养室所必需的日常工作常规使用设备之一，便于掌握细胞的生长情况并观察有无污染等。[/font][b]2.[font=宋体]培养箱：[/font][/b][font=宋体]体外培养的细胞和体内细胞一样，需要在恒定的温度下生存，大多数情况下，最适温度是[/font]37[font=宋体]℃，温差变化一般不应超过±[/font]0.5[font=宋体]℃，细胞在温度升高[/font]2[font=宋体]℃[/font] [font=宋体]时，持续数小时即不能耐受，[/font]40[font=宋体]℃以上将很快死亡。因此需要有能控制温度的培养箱，如具有较高灵敏度的恒温培养箱及[/font]CO2[font=宋体]培养箱。[/font][b]3.[font=宋体]干燥箱：[/font][/b][font=宋体]用于细胞培养箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用，玻璃器皿等须干热消毒。[/font][b]4.[font=宋体]水纯化装置：[/font][/b][font=宋体]细胞培养对水的质量要求较高，细胞培养以及与细胞培养工作相关的液体的配制用水必须事先严格纯化处理。进行细胞培养时配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水：即使是用于玻璃器皿的冲洗，也应使用二次以上蒸馏水。[/font][b]5.[font=宋体]冰箱：[/font][/b][font=宋体]细胞培养室必须配备。[/font]a[font=宋体]、普通冰箱或冷藏柜——储存培养液、生理盐水等培养用的物品及短期保存组织标本。[/font]b[font=宋体]、低温冰箱（[/font]-20[font=宋体]℃）——用于储存需要冷冻保存生物活性及较长时期存放的制剂，如酶、血清等。[/font][b]6.[font=宋体]细胞冷冻储存器：[/font][/b][font=宋体]储存器常用的是液氮容器。根据使用需要分为不同的类型及多种规格。选择购置液氮容器时要综合考虑容积大小，取放使用方便及液氮挥发量（经济）三种因素。[/font][b]7.[/b][font=宋体][url=http://www.hexiyiqi.com/][b]离心机[/b][/url][b]：[/b]进行细胞培养时，常规需要进行制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等工作，通常需要使用[url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/shiyanshilixinji/]实验室离心机[/url]。一般可常规配置[/font]4000rpm[font=宋体]的国产台式离心机，例如细胞沉降，使用[url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/]低速离心机[/url]即可，离心力过大有时可能引起细胞的损伤。[/font][align=center][url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-17/69.html][img=低速离心机]http://www.hexiyiqi.com/d/file/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-17/0e080cd46b2ee061b55caabaaee8cbf2.jpg[/img][/url][/align][align=center][b]台式低速离心机TD5A[/b][/align][b]8.[font=宋体]天平：[/font][/b][font=宋体]常用的有扭力天平、精密天平及各种电子天平。[/font][b]9.[font=宋体]消毒器：[/font][/b][font=宋体]一般为高压蒸汽灭菌锅，直接或间接与细胞接触的物品均需消毒灭菌处理。[/font][b]10.[font=宋体]滤器：[/font][/b][font=宋体]目前细胞培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。目前常使用的滤器有玻璃滤器和微孔滤器，各种滤器有其使用原理和特点。[/font][b][font=宋体]常用的培养器皿：[/font][font=宋体]培养用器皿[/font][/b][font=宋体]是[/font][font=宋体]供细胞接种、生长等用的器皿，可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。[/font][font=宋体]细胞培养中需要的各种耗材[/font],[font=宋体]各类细胞培养板，细胞培养瓶，平皿移液管等。[/font][b][font=宋体]培养瓶[/font][/b][font=宋体]：由玻璃或塑料制成。主要用于培养、繁殖细胞。进行培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞，胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格以容量（[/font]ml[font=宋体]）表示，如[/font]250ml[font=宋体]、[/font]100ml[font=宋体]、[/font]25ml[font=宋体]等；进口培养瓶则多以底面积（[/font]cm2[font=宋体]）表示。[/font][b][font=宋体]培养皿：[/font][/b][font=宋体]由玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或做细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿规格有[/font] 10cm[font=宋体]、[/font]9cm[font=宋体]、[/font]6cm[font=宋体]、[/font]3.5cm[font=宋体]等。[/font][font=宋体]多孔培养板：为塑料制品。可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大量样本，易于进行无菌操作。培养板分为各种规格，常用的规格有：[/font]96[font=宋体]孔、[/font]24[font=宋体]孔、[/font]12[font=宋体]孔、[/font]6[font=宋体]孔、[/font]4[font=宋体]孔等。[/font][b][font=宋体]培养操作有关的器皿[/font][font=宋体]贮液瓶：[/font][/b][font=宋体]常见的为蓝盖瓶，主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。贮液瓶分为各种不同规格，如[/font]1000ml[font=宋体]、[/font]500ml[font=宋体]、[/font]250ml[font=宋体]、[/font] 100ml[font=宋体]、[/font]50ml[font=宋体]、[/font]5ml[font=宋体]等。[/font][b][font=宋体]吸管：[/font][/b][font=宋体]主要分为刻度吸管、无刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体，常用的有[/font]1ml[font=宋体]、[/font]2ml[font=宋体]、[/font]5ml[font=宋体]、[/font]10ml[font=宋体]等规格。无刻度吸管分为直头吸管及弯头吸管，除可以作吸取、转移液体外，弯头尖吸管还常用于吹打、混匀及传代细胞。[/font][b][font=宋体]加样器（[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]）[/font][/b][font=宋体]：分为微量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]电动[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]。用于吸取、移动液体或滴加样本。可根据需要调节量的大小，吸量准确、方便。可保证实验样品（或试剂）含量精确，重复性良好。[/font][b][font=宋体]其他用品：[/font][/b][font=宋体]尚有收集细胞用的离心管，放置试剂或临时插置吸管用的试管，装放吸管以便消毒的玻璃或不锈钢容器，用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝制饭盒或贮槽，套于吸管顶部的橡胶吸头，封闭各种瓶、管的胶塞、盖子、冻存细胞用的安瓿或冻存管、不同规格的注射器、烧杯和量筒以及漏斗，超净工作台使用的酒精灯，供实验人员操作前清洁消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型喷壶等。[/font][b][font=宋体]器械[/font][/b][font=宋体]主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。常用的有：手术刀或解剖刀、手术剪或解剖剪（弯剪及直剪），用于解剖动物、分离及切剪组织，制备原代培养的材料；眼科虹膜小剪（弯剪或直剪），用于将组织材料剪成小块；血管钳及组织镊、眼科镊（弯、直），用于持取无菌物品（如小盖玻片）夹持组织等；口腔科探针或代用品，用以放置原代培养之组织小块。[/font][b]2[font=宋体]、细胞培养实验室特殊设备[/font][/b][font=宋体]细胞培养实验室除了应配备上述的常用基本设备以外，如有条件，可添置一些特殊或先进的设备仪器，以便更有效、更精确、更深入地进行实验室工作。例如：[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）酶联免疫检测仪——可用于进行免疫学测定及细胞毒性、药物敏感性检测等。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）[/font] [font=宋体]超低温冰箱（[/font]-80[font=宋体]℃）——便于储存某些试剂及标本。[/font][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）旋转培养器——用于某些特殊细胞或需要收获大量细胞的培养。[/font][font=宋体]（[/font]4[font=宋体]）[/font] [font=宋体]荧光显微镜——进行荧光染色样本的观察。[/font][font=宋体]（[/font]5[font=宋体]）[/font] [font=宋体]流式细胞仪——可更精确及快速检测细胞。[/font][font=宋体]（[/font]6[font=宋体]）用于检测细胞培养条件的各种仪器，例如专门为快速分析细胞培养基中主要或关键营养成分、代谢产物及气体含量设计的多功能细胞培养分析仪、手提式[/font]CO2[font=宋体]浓度测定仪等。[/font][b][font=宋体]其余仪器[/font][/b][font=宋体]对于细胞实验还可能需要振荡器及磁力搅拌器用于混匀液体；还有一些沾满细胞的难清洗的不锈钢类或玻璃类器皿，则需要超声波清洗机的帮助；如果涉及免疫实验，肯定需要冰浴，碎冰的需求量大的话，则需要购买制冰机；另外破碎细胞可能会需要超声波细胞破碎仪；[/font]

1 实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响.细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁,空气清新,干燥和无烟尘.细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室. 2 常用设施及设备 (1)超净工作台:也称净化工作台,分为侧流式,直流式和外流式三大类. (2)无菌操作间:一般由更衣间,缓冲间和操作间三部分组成.操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱,离心机,倒置显微镜等.缓冲间可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等. (3)操作间:普通培养箱,离心机,水浴锅,定时钟,普通天平及日常分析处理物(4)洗刷消毒间:烤箱,消毒锅,蒸馏水处理器及酸缸等. (5)分析间:显微镜,计算机及打印机等. 3 培养器皿 常用细胞培养器皿有培养瓶,培养板,培养皿等.常准备量是使用量的三倍.器皿应选择透明度好,无毒,利于细胞粘附和生长的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品.常用的器皿有下面几种. (1)液体储存瓶:用于储存各种配制好的培养液,血清等液体,常用规格有500ml,250ml, 100ml等几种. (2)培养瓶:根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异,用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀,便于细胞贴壁生长和观察,瓶口要大小一致,口径一般不小于1cm,允许吸管伸入瓶内任何部位,规格有200ml,100ml,50ml,25ml,10ml等几种. (3)培养皿:用于开放式培养及其它用途.分直径30mm,60mm,120mm等几种. (4)吸管:常用的有长吸管和短吸管两类,长吸管也称刻度吸管.其改良后管上部有球型刻度称改良吸管,刻度吸管用于移动液体.常用1ml和10ml两种.短吸管也叫滴管,分弯头和直头两种. (5)离心管:离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿,根据用途不同形态各样,常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类.前者分别为50ml,30ml,15ml;后者则多为10ml和5ml. (6)其它:如三角烧瓶,烧杯,量筒,漏斗,注射器等.4 细胞培养温度 维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定而适宜的温度.不同种类的细胞对培养温度要求也不同.人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡.培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过39℃时,细胞代谢与温度成正比;人体细胞在39-40℃1小时,即能受到一定损伤,但仍有可能恢复;在40-41℃1小时,细胞会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢复;41-42℃1小时,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡,个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1小时,细胞全部死亡.相反,温度不低于0℃时,对细胞代谢虽有影响,但并无伤害作用;把细胞放入25-35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度减慢;放在4℃数小时后,再回到37℃培养,细胞仍能继续生长.细胞代谢随温度降低而减慢.当温度降至冰点以下时,细胞可因胞质结冰受损而死亡.但是,如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂(二甲亚砜或甘油),可在深低温下如-80℃或-196℃(液氮)长期保存. 5 合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中.二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6.每种细胞都有其最适pH值.

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。 我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。1． 材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置 灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧 排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料 培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。2． 结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。

细胞培养知识1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

1. 如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。2. 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。4. 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5. 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。6. 培养细胞时应使用5% 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5% CO2 培养细胞。7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。8. 细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。9. 悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。10. 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后， 须立即放入37℃水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15 ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于-20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。13. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1 000 rpm)，5-10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。14. 细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。15. DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4℃， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。16. 冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃30~60 分钟→ (-20℃ 30 分钟*) → -80℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至-80℃以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

大规模动物细胞培养的问题及对策动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动 物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。1.细胞培养环境细 胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己 糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。氨抑制Gln代谢途径，使Asp和Glu消耗增加。细胞消耗Asp增加，可能是细胞线粒体膜上苹果酸－天冬氨酸泵转运NADH加快，使细胞维持糖酵解途径的需要。Asp消耗增加可能会从Gln代谢多经天冬氨 酸转氨酶途径而不是丙氨酸转氨酶或谷氨酸脱氢酶途径得以补偿。氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺，因此需要防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量，并尽量去除培养基中的氨。乳酸是细胞糖代谢的产物。高浓度乳酸会抑制乳酸脱氢酶(LDH），从而减少乳酸产生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶联的丙酮酸/乳酸转 换，从而导致NADH[font=T

细胞培养FAQ： 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。 7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外， [font=宋

培养箱 培养箱的作用是为细胞生长提供合适的环境。培养箱大小应足够满足实验室需要，具有强制空气循环，并且具有温度控制系统，可将温度波动控制在 +0.2℃范围内。不锈钢培养箱易于清洁，耐腐蚀，尤其适合使用湿化空气进行培养的情况。虽然细胞培养箱的无菌性要求不如细胞培养通风橱严格，但是必须经常对其进行清洁，以免培养的细胞受到污染。 培养箱种类 目前培养箱有两种基本类型，即:干式培养箱和湿式二氧化碳培养箱。干式培养箱较为经济，但是需要将细胞在密封的培养瓶中培养，以防止培养基蒸发。在干式培养箱中放置一只水盘可以增加一定的湿度，但是无法精确控制培养箱内的空气条件。湿式二氧化碳培养箱较为昂贵，但是能够准确控制培养条件。这种培养箱可用于培养皿或多孔板中细胞的培养，这种培养方式需要将空气控制在高湿度、高二氧化碳压力的状态。 储存 细胞培养实验室应设置多个储存区，分别用于存放液体(如培养基和试剂)、化学品(如药物和抗生素)、耗材(如一次性吸管、培养瓶和手套)、玻璃器皿(如培养基瓶和玻璃吸管)、特殊设备以及组织和细胞。 玻璃器皿、塑料制品和特殊设备可置于架子上或抽屉中于室温下存放:但是，所有培养基、试剂和化学品均应按照标签说明存放。 一些培养基、试剂和化学品对光线敏感，尽管其可耐受光照状态下正常的实验室使用但是不使用时必须将其存放在暗处或者用铝箔包裹起来。 冰箱 对于小型细胞培养实验室，家用冰箱(最好是不含自动除霜冷冻室的冰箱)即可供试剂和培养基于 2-8℃下存放之用，而且价格低廉。大型实验室，采用专供细胞培养的冷藏室较为合适。应确保定期打扫冰箱或冷藏室，以防污染。 冰柜 大多数细胞培养试剂可于-5℃ 至-20℃ 下储存:因此，可以采用超低温冰柜(即:-80℃冰柜)存放多数试剂。与实验室冰柜相比，家用冰柜是一种较为便宜的选择。尽管大多数试剂可耐受自动除霜(即:自动解冻) 冰柜内的温度波动，但是有些试剂(例如抗生素和酶)则应储存在无自动除霜功能的冰柜中。 低温储存 随着传代次数的增加，连续培养的细胞系可能发生遗传不稳定:因此，必须准备工作细胞储备并将其存放于低温状态下(更多信息，请参阅第 37 页的“细胞冻存”部分)。不得将细胞存放于 -20℃或 -80℃冰柜中，因为细胞存放于上述温度条件下活力会迅速降低。 目前主要有两种液氮储存系统，即:蒸汽相和液相储存系统，分别采用广口和细口储存容器。蒸汽相系统可降低冻存管爆炸危险，储存生物危害性物质时应使用该系统，液相系统通常具有更长的静态保温时间，因而更为经济。 细口容器中液氮蒸发速度较慢，更为经济，而广口容器存取方便，储存容量较大。 细胞计数器 细胞计数器是定量监测细胞增殖动力学的必备工具，实验室内同时培养 2-3 种以上细胞时，细胞计数器能够提供巨大的便利。 Countess”自动细胞计数器是一款台式设备，它采用标准台盼蓝摄入技术，可准确测定细胞数量和活性(活细胞、死细胞和总细胞)，测定每个样品只需不到1分钟的时间。Countess"自动细胞计数仪计数所需的样本量与您目前使用的血球计数器所需量相同，且不到一分钟即可完成一个样本的典型细胞计数，适用于各种真核细胞。

骨髓间充质干细胞总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为详实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。1. 直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞（2）原代培养24 h,48 h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来。（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48 h~72 h后首次换液，一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6 w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48 h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073 g/ml的percoll分离（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72 h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400 rpm×20 mins后可见中间有一层约1～2 mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs。周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1 d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。二、骨髓间充质干细胞的培养 天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。三、骨髓间充质干细胞的特性 体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。四、其他相关内容 Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。参考文献 生理学报2003.55（2）：153－159 人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169 培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem CellsNATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow干细胞生物学 裴雪涛 主编

如题，我现在培养的HT29大肠癌细胞，想要培养到Sephadex微珠上，但是文献中都需要搅拌培养或者转动培养，我们没有这样的设备，只有培养瓶，请教各位应该怎样操作啊？

简单介绍一下细胞培养技术，本人这段时间主要做细胞工作，和大家共勉吧！细胞培养技术一、细胞培养的条件和要求 二、细胞分离 三.体外培养细胞龄的计算四.细胞鉴别试验 五、细胞计数六、细胞传代 七、细胞的冻存和复苏 八、细胞培养用水处理 九、选择小牛血清的微量细胞培养检查法 十、葡萄糖测定法 十一、乳酸测定法十二、细胞培养方式

发点有关细胞的资料　　希望对大家有用[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=52143]细胞培养资料[/url]

什么是细胞培养? 细胞培养是指从动物或植物中取出细胞，然后使其在合适的人工环境中生长。这些细胞可于培养前直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离，或者也可来自已经建立的细胞系或细胞株。 原代培养 原代培养是指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增殖直到占据所有可用基质(即:达到汇合状态)的培养阶段。在此阶段，必须将细胞转移到新的容器中并更换新鲜培养基，从而对细胞进行传代培养，为其提供更多继续生长的空间。 细胞系 首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系或者亚克隆。来自于原代培养的细胞系寿命有限(即:有限细胞系，见下文)，随着细胞的传代，生长能力最强的细胞会占据优势，最终导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度的均一性。 细胞株 如果将细胞系的一个亚群通过克隆或者其他方法从培养物中明确地选择出来，则此细胞系就成为一个细胞株。与亲代细胞系起始时相比，细胞往往会获得其他一些遗传学改变。 培养条件 各种细胞的培养条件相差很大，但是细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体 (0,、CO,)，并可调节其物理化学环境 (pH、渗透压、温度)。大多数细胞均具有贴壁依赖性，必须贴附在固体或半固体基质上培养(贴壁或者单层培养)而另一些细胞则可在培养基中漂浮生长(悬浮培养)。 有限细胞系与连续细胞系 正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老 这种细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞系会通过被称为转化的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生，也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力后，就成为连续细胞系。 冻存 如果传代时有多余的细胞，可通过适当的保护剂(例如:DMSO 或甘油)处理细胞，储存在 -130℃ 以下的温度下 (冻存)，直到需要使用之时。

污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免 的 1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！ 2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理

每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了 ，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢?早走早脱身，从此专注黑生物1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。　　2. 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。　　3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。　　4. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换 (灭菌水加进去)。　　5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。　　6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。　非科班出身经验分享　　1. 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。　　2. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。　　3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。　　4. 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个 30 分钟。　　5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。　　6. 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过 2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。　　大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。　　最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了 5 天吧，感觉都长了几层出来，培养基都黄了。抱着试一试的心情传了一次，又坚强的活过来了。当然，状态肯定也差的很了。　换种心情，好好生活!　　养了三年细胞，各种肿瘤细胞，说一点自己的看法：　　1. 培养细胞前，可以看看细胞特点说明书，包括细胞正常生长的状态图、传代、培养基的类型等。　　2. 不同细胞生长周期不同，有的生长很快，比如说 MDA-MB-231，传代的时候取离心悬液的十分之一就已经足够了，有的又是特别慢，等的人心焦，BT474 就是，传代是一分二，复苏起始的时候两周多才能长满，所以就要在培养细胞的过程中多多摸索了。　　3. 对于娇弱的细胞，就得细心呵护了，胰酶消化不能过久，吹得时候要轻柔，离心时候也要注意转速和时间，每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。　　4. 冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基。　　5. 培养箱隔一段时间彻底用酒精棉擦洗一次。　　6. 养细胞最大的教训：不能偷懒!　细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋。　　1. 不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手赶紧做两件事：检测是否有支原体污染; 迅速扩增冻存。　　2. 发现有污染迅速处理掉，特别是当你养了很多种细胞时; 细菌污染，真菌污染很容易发现，支原体污染的话，细胞会长的慢，买个支原体检测的 kit 定期检测一下。　　3. 细胞房日常的值日清洁是必须的，此外还要定期熏蒸。　　4. 细胞的传代一定要规律，保持相同的 confluency 和传代时间间隔，不要随心所欲或者拖延。　　5. 注意个人卫生。　靠内心感动细胞　　1. 自己的细胞自己养，血的教训。　　2. 在生物安全柜 (或者超净台)，枪头，血清管，血清，培养基，瓶子都足够好，并且细胞房有良好的卫生措施 (比如隔离服，手套，口罩，清洁，HEPA 等等) 且不违法操作原则的情况下，你其实很难污染。　　3. 上述条件不完备的情况下，就要多注意无菌操作了：比如要用的东西提前拿到台子里照啊 (不过这个其实也不大好，因为会挡住紫外线)，使用前 SDS+酒精擦台子，进出超净台一定要酒精擦手。　　4. 少对细胞说话，多靠内心来感动它们 (是的! 心不诚是不可以的!) 至少 1 天看 1 次。　养细胞很容易　　养细胞真的不难，最关键几点：　　1. 所有的东西使用最好的，如果你用的血清、培养皿、培养基、胰酶什么的都是进口的，真的很难相信你会把细胞养坏。　　2. 动作要快，胰酶消化，换液什么，细胞暴露在空气中的时间越少越好。另外，要掌握好胰酶消化时间，所谓的细胞状态差，很多时候是传代的原因。　　3. 有时间的话，需要细胞计数，传相应数目的细胞到培养皿中，可以大致清楚细胞的生长曲线，不会临时要处理，手足无措。　　4. 要做什么心里要非常清楚，合理安排时间，细胞房的实验穿插进行，可以节省很多时间，也不会耽误别人的实验。　　5. 个人的实验器具自己收一套，不要和别人混用，最近换了什么新的东西稍微记一下，试剂一旦怀疑污染，马上丢。　　6. 细胞房不能进去太多人，避免相互干扰。　细胞养不好，自挂东南枝　　现在一大型药企养细胞做检测，工作量很大，很多地方都没办法非常仔细的做。但是两年下来只出现过一次污染，总结一下心得：　　1. 好的洁净室，空调系统跟得上。　　2. 好的生物安全柜，硬件跟的上。　　3. 瓶子移液器吸头大都是进口，耗材跟的上。除了这些就是自己的操作习惯了。　　4. 任何东西不要从敞开的瓶口上面经过。　　5. 虽然酒精灯会干扰安全柜气流但是还是需要一盏用来勤烧瓶口。　　6. 实验时所用材料的位置摆放要顺手，污染源和已灭菌物品要分开放置。　养细胞就像打仗　　细胞饲养涵盖的内容太广了，而且不同种类细胞的饲养难度以及技术要求不同，肿瘤细胞，成纤维细胞，上皮细胞... 甚至各类干细胞... 每一种都有自己的生长要求。如果只是单纯的一般性操作，大同小异，个人觉得练好技术的情况下注意几点就好:　　1. 各种无菌，从培养基到操作过程再到培养箱，时刻注意无菌。本人曾经所在的实验室出现过大规模污染并最终导致所有细胞集体毁灭... 教训惨痛。　　2. 培养基的配制一定要做好梯度摸索并详细记录，否则细胞死都不知道怎么死的。　　3. 尽量提高操作熟练度，减少培养皿在培养箱外的滞留时间，细胞很脆弱，经不起折腾，不像人，热了有空调，冷了能烤火。　　4. 把握好培养基更换的时间，不同细胞类型时间不同，早了浪费试剂，晚了可能全军覆没。　　5. 经验很重要，养细胞的很多经验你是无法在公开的书籍和资料上找到的。多向实验室前辈学习，他们会让你少走很多弯路，真的。　　养细胞就像打仗，知彼知己，百战不殆。只有了解你养的对象，才能把他养好。　细胞就是矫情　　养细胞细胞这个东西呢有的时候真说不清。养过一段时间的巨噬细胞，一开始操作各种谨慎小心，随时默念各种无菌原则，培养基什么的都用的进口的，其实国产货真的不差，有钱就是任性! 但细胞还是萎靡不振，两个多星期过后实在懒得管，换液等操作也很随意的草草进行，酒精也懒得喷，结果这货却开始疯长，过了几天居然达到一天要传一次代，而且数量甚至可以一传三， 所以说，有的细胞就是矫情。

作为一只刚进实验室的菜鸟把自己遇到的东东总结一点发出来，抛砖引玉吧，为即将进实验室的朋友些资料，同时欢迎老鸟们指正。1、在实验室登记领试剂和药品pbs 1640 Gbico的FBS 台盼蓝 计数板 酒精灯 胶塞 封口胶 消毒的喷剂 记号笔 镊子 标签 饭盒 消毒时包饭盒的布 冻存管 冻存剂 离心管 培养瓶 6孔板 96空板 吸管 吸球。pbs 1640 Gbico的FBS 我都是买的现成的，就是那些实验室老师用原料配好了来卖的那种，我是害怕自己本来就是一个新手，为省那钱自己配，别污染了多的事情都来了，当然很多老鸟都自己配，别鄙视我哈。2、换液a 开瓶盖的时候，网上的视频里是用镊子开的，但是现在用的瓶塞多是新的，稍微一使劲，胶塞就会被扯破（我这周换了好多塞子了），扯破了的塞子把瓶子包不住，有污染的危险，特别是冰箱里试剂装得很拥挤的时候。方法：切忌男生像我一样用力过猛，如果实在要扯烂，干脆就用手去扯塞子，不过严格按照翻起塞子-烧-扯-再烧就是了，完全没有污染的顾虑b 加液体的时候很很容易就吸到赛棉花那一截去了（很多熟练的都不塞棉花了，他们力度控制得好，只要不吸过头，完全ok的），这时候，就不要再吝惜你的培养基了，全部甩到废液缸里去吧，毕竟吸球没有消毒（我们这里是这样的哈），浸湿过了棉花就可能沾到吸球。c 往培养瓶里加pbs、FBS等液体时候，手抖得厉害。不是滴在瓶口，瓶壁上，就是滴在超净台上。方法：滴在瓶口的一定要烧干，不然小心污染，瓶壁和台子上的可以用消毒后的干净纱布擦拭；另外就是自己找个空瓶子，自己练习加液体，熟能生巧。3、传代a 消化细胞的时间真的是不同细胞就不同，我的细胞是消化5分钟，还是在孵箱里放着的，拿出来以后还要又拍又晃的，朋友的一分钟就全飘起来了，如果你是第一次做，或者你们实验室没有做过这个细胞，您就最好一直在镜下看着细胞，摸一下时间（用表记录时间，不光是“摸”哈），消化过头的细胞，长得不好，如果你是外面买的细胞，就又可能浪费经费了。另外，认真分析了一下，我的癌细胞稍微比朋友的正常组织的细胞消化得慢，他的细胞长得慢，细胞少（毕竟正常细胞不能和癌细胞比），3天才传第一代，我的都2代的瓶子了都铺满60%，他的贴的也不怎么紧。b 离心离心的时候，因为忙着把刚终止了消化的细胞拿去离心，很容易忘记在您的离心管上标记，配平完了，机子都转到1000转了，才想起来，也没法子了。方法：实在是忘记了标记，用于配平的管子里的液体没有你刚做完消化的液体清亮，你反正选最清亮的那个就是了。c 分装的时候，我一传3，加上离心管的盖子，满桌子都是瓶盖，很容易搞错，尤其是在和别个拼台子做实验的时候，更是拥挤，千万要放好，不然空间一拥挤，你取东西的时候很容易从这些面朝上的盖子塞子上面经过，就有可能污染了，虽然盖盖子的时候还要过火烧，但是说实话，烧那几下，连手指都烧不烫，咱还是从不污染的角度做起吧。4、我犯其他的傻a 进细胞间去照台子（说实话，是去抢台子，别人要是紫外照起了，就只能等他们做完再照，就又要等半小时），结果口罩帽子都忘记了带，挨了顿批评。b 吸管在酒精灯上过火烧几次的时候，吸管尖碰在了灯芯旁的酒精瓶铜的那部分。c 倒老的培养液的时候才发觉，废液缸没拿进细胞间。跑出去再拿。记得重新消毒手，而且我离开台子的时候，很怕其他人经过污染我已经打开了的各个试剂的瓶子。不放心的只有盖好再走，再进来时再从头弄，浪费时间。5、其他要注意的问题a 我看见也是个新进实验室的女生，双手悬在空中费劲的塞胶塞（估计也是新胶塞，太紧了，塞不大进去），结果手一滑，整瓶胰酶倒在超净台上。（还好不是加GbicoFBS的1640，呵呵），倒了记得把台子擦干净，上次不知道是谁把什么有机溶剂都倒在台子上了，我一去，还沾手，郁闷，自己做好自己分内的，别让实验室里其他的人说你是个污染源或者细胞杀手。b 某天朋友准备换液，结果就把培养基pbs胰酶全都放在37摄氏度水浴里，结果后来有事走了，只把照台子时候放那的东西收拾了，5个小时后才突然想起，只好暂时不用那个培养基了，重新再用新的。养到后面细胞多了，不怕细胞死的时候，还是可以试验着用用那瓶培养基的。

本人不是生物，医学出身，但现在博士期间的研究工作与生物医学相关，想学细胞培养技术，但课题组里没有师兄师姐可以请教，请问全国有没有哪个机构可以提供细胞培养的培训？ps：本人只了解过一些细胞培养的理论知识，从未进行过实际操作，希望培训能以实际操作为主。谢谢！

名称：细胞培养操作规程关键词：细胞培养目的：建立一套适用的培养操作规程，进行无污染条件下体外细胞扩大培养。主体内容：操作步骤：1、紫外灯照射超净台30分钟（根据实际情况，可适当延长或缩短照射时间，但时间长一点总比时间短一点安全。）2、将培养液、PBS、胰酶放在37℃水浴中温育（每次用多少，温育多少，这样既可节约温育的时间，又可延长药品的使用期限。）3、超净台照射30分钟后，关闭紫外，打开照明，打开排风10分钟后再次进入细胞培养室。（注意：要打开排风10分钟后再进行操作，这样才能保证循环的风是无菌的。同时还会避免有菌的风直接吹到人的呼吸道中，对人体也有一定的保护作用）4、戴上口罩及手套（有条件的最好戴上帽子，不过也没关系，我们实验室就没戴）5、用70-75%的酒精擦试实验物品，然后拿入超净台中。6、操作时注意以下几点：尽量在酒精灯火焰附近操作，但如果管子里有细胞就要离火焰有一定距离了，否则细胞要烫死了；不要重复使用移液管（即吸一次后，就换新的管）；不要在敞开的容器上方操作；手上的酒精不要擦太多，否则靠近酒精灯时容易把手烧到（我想很多人都有过被烧的经历吧）；其实操作是很简单的，但一定要仔细。尤其是第2步许多人都不注意，细胞平时放在37℃培养，如果加入的PBS或胰酶温度太低，会对细胞有操伤的，虽然这种损伤短期内察觉不到，但时间长了，就会显现出来。

1培养基中丙酮酸钠的作用是什么？答：丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。2GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？答：GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。3二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？答：二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。4细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？答：不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下pH8.0、温度37oC其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为：（1）0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA；（2）0.25% 胰蛋白酶 多数细胞传代消化可使用0.25％胰蛋白酶＋0.02％EDTA这种消化液。

细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术。广泛应用于现代医学、农业科学、生物科学、材料科学和环境科学等领域，培养的细胞为上述领域提供研究的模型和实验材料。目前细胞间可以供从事蛋白质表达工作的昆虫细胞培养实验及如HEK293T细胞系,Hela细胞系，CHO细胞系等常用细胞系的培养、传代及其他分子实验的操作条件。

[align=center][b][size=14pt][font=等线]如何做好细胞培养？[/font]—实验室细胞培养技术面面观[/size][/b][/align][align=center][size=11pt]会议时间[/size][size=11pt]：[/size][size=11pt]2020年[/size][size=11pt]4[/size][size=11pt]月[/size][size=11pt]17[/size][size=11pt][font=等线]日[/font]1[/size][size=11pt]4[/size][size=11pt]:00[/size][/align][b][size=12pt]内容[/size][size=12pt]介绍：[/size][/b][size=10.5pt]1. 细胞培养简介[/size][size=10.5pt]；[/size][size=10.5pt]2. 细胞培养实验室[/size][size=10.5pt]：实验室安全等级、培养设备[/size][size=10.5pt]/耗材[/size][size=10.5pt]、无菌技术；[/size][size=10.5pt]3. 细胞培养基础[/size][size=10.5pt]：细胞系、细胞培养环境（[/size][size=10.5pt]PH，CO2浓度，温度，湿度）[/size][size=10.5pt]；[/size][size=10.5pt]4. 细胞培养方案[/size][size=10.5pt]：贴壁细胞传代、悬浮细胞传代、细胞冻存、细胞复苏、细胞计数；[/size][size=10.5pt]5. 细胞培养常见问题[/size][size=10.5pt]：细胞污染、细胞太稀、细胞消化过度、细胞复苏状态不佳。[/size][b][size=12pt]讲师[/size][size=12pt]介绍：[/size][size=11pt]雷俊[/size][size=11pt]:[/size][/b][size=11pt]北京大学细胞生物学博士博士研究生期间，主要从事细胞周期事件与肿瘤发生关系的研究，具有细胞生物学、蛋白质组学等学科背景，精通分子细胞生物技术、成像技术等研究手段。现任瑞沃德生命科技有限公司细胞产线产品经理。[/size][b]报名地址：[/b][url=https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_10287.html][u][font='Times New Roman'][color=#0000ff]https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_10287.html[/color][/font][/u][/url]

1、搅拌式动物细胞培养罐　　搅拌式培养罐靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护，因此对剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害，传统的用于微生物的搅拌培养罐用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以，动物细胞培养中的搅拌式培养罐都是经过改进的，包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在培养罐内加装辅件等。　　(1)供氧方式的改进　　一般情况下搅拌式培养罐还常伴有鼓泡，为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。笼式供氧是搅拌式动物细胞培养罐供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。培养罐既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞培养罐，整体呈梨形，搅拌置于培养罐底部，在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡，丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。　　(2)搅拌桨的改进　　搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进，并在反应器内加装了辅件，实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨，顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°，垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力，实验中用于昆虫细胞的培养，最终的培养密度达到6×106个/mL，成活率在98%以上。　　2、非搅拌式动物细胞培养罐　　搅拌式细胞培养罐用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大，容易损伤细胞，虽然经过各种改进，这个问题仍很难避免。相比之下，非搅拌式培养罐产生的剪切力较小，在动物细胞培养中表现出了较强的优势。　　(1)填充床反应器填充是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小，适合细胞高密度生长。　　(2)中空纤维反应器中空纤维培养罐由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类培养罐由中空纤维管组成，每根中空纤维管的内径约为200μm，壁厚为50～70μm。管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧分。　　(3)气升式细胞培养罐气升式生物反应器(airliftbioreactor)也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一，其特点是结构简单，操作方便。有人在气升式反应器中利用微载体培养技术，研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞，在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下，细胞可以正常生长至长满微载体表面，终密度可达1.13×106个/mL。