细胞工厂观察台

生物显微镜观察细胞，光强对细胞状态有影响吗

想问生物显微镜观察细胞，光强会对细胞状态有影响吗，有没有懂这方面的，麻烦说一下谢谢

近日，德国IBIDI公司成功开发出一款超高分辨率生物显微镜。该公司宣称基于新型随机光学重建显微技术“（d）STORM”，利用该公司独创的特殊塑料底板“μ-Slides”可实现超高分辨率观察活体细胞。 STED，SIM，（F）PALM 和（d）STORM等新型光学显微技术可有效避免衍射极限，获得纳米级水平的超高分辨率成像。这些超高分辨率显示技术可应用到生物实验研究，观察了解组织细胞分子结构。IBIDI公司采用了创新性的含有亲水性膜涂层的塑料材质底板“μ-Slides”替代传统玻璃底板，首次实现了“活体细胞”超高分辨率观察。这种被成为“ibi-Treat”的亲水性膜涂层性能可以与标准的细胞培养瓶和培养皿相媲美。 IBIDI公司相关研发工作受到了德国联邦教研部《生命科学领域光学技术—基本细胞功能》项目的资助。

现在大多数对细胞超微结构的观察多采用化学染色法固定、染色、脱水、包埋的前处理，电镜观察。想请教一下各位大虾，有没有什么好的技术能实现对活细胞的超微结构的实时动态观察啊？最好不要染色什么的处理，直接在生理状态下就能观察。需要国内能够买到的仪器，谢谢大家了。目前查了一下文献，好像原子力显微镜、相差显微镜说可以，但我看了一下成像，感觉不如电镜的分辨率高啊。还有共聚焦显微镜，需要使用特定的荧光探针。

现在的问题在于，以前有人用扫描电镜这种方法，用扫描电镜应该肯定没有问题。如果用透射电镜，是否存在图象效果不是很好的问题（但是放大倍数好象不小，可能可以看清楚？），是否在观察的时候，因为样品有一定的厚度要求，因为这里观察的是细胞，所以直接观察细胞是否影响效果？是否还有其他我没有考虑到的因素，比如说是制备样品过程中的问题呢？同样是否可以用冰冻蚀刻技术呢？

我想用透射电镜观察不同类型的淋巴细胞，想问一下固定前的操作有哪些注意的？大概需要多少细胞？（我用流式分离的）离心时要多大的离心力？不知道有没有有经验的老师能给点帮助。谢谢

[align=left][font='times new roman'][size=18px]细胞培养及[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]形态学观察[/size][/font][/align][font='宋体'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='宋体'][size=16px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞复苏：从液氮中取出细胞后，将细胞冻存管用细胞复苏[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]盒迅速[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]转移至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]37[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]恒温水浴锅中，轻摇使细胞迅速解冻。细胞解冻后立即吸取至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]预热的完全培养基中，吹打混匀，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]9[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]00 rpm [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]离心[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]8[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]吸弃上[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]清，用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]完全培养基重悬细胞，将细胞接种至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]25 cm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养瓶中，沿培养瓶瓶底吹打，使细胞附着在培养瓶瓶底，恒温[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]37[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5% CO[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]条件下培养。[/size][/font][font='宋体'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='宋体'][size=16px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞传代：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]446[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]为半贴壁半悬浮细胞，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]MS114[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]为贴壁细胞，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]69[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]526[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]为悬浮细胞。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]吸弃培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]后用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5 mL 1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]清洗[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]次，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]吸弃上[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]清，每[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]25 cm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养瓶或[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6 cm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养皿加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]胰酶消化[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2 min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。镜下观察细胞变圆形或轻拍开始脱落，加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]完全培养基终止消化（悬浮细胞不需胰酶消化），移入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]15 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]离心管内，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]9[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]00 rpm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，离心[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]8[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]吸弃上清液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，加入新鲜培养基重悬细胞并吹打混匀。将细胞按实验需求接种于培养瓶或培养皿中，培养条件同上。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）细胞计数：制备细胞悬液（实验步骤同细胞传代），吹打混匀，取[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]200 [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]μ[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]L[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的细胞悬液至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.5 mL EP[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]管内，再加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]200 [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]μ[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]L[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]台盼蓝[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]染色剂，充分吹打混匀细胞悬液。取适量细胞悬液滴加于细胞计数板上，在显微镜下观察并计数（被[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]台盼蓝[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]染成蓝色的细胞为死细胞，死细胞不计数），分别计数视野中计数板上四个大格子中细胞的数量，并计算平均值。细胞密度[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]=[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]平均值×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，即每毫升培养基中细胞的数量。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞冻存：将处于对数生长期的细胞制备成细胞悬液（步骤同上）并计数。每[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.8-1.0[/size][/font][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]个细胞加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞冻存液，轻轻吹打混匀，每支冻存管加[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的细胞悬液（标记清楚冻存细胞代数，所用培养基，细胞来源，冻存日期，冻存者姓名缩写）。将冻存管用封口胶封好后放入细胞冻存盒（含异丙醇）中，放入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-80[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]冰箱保存，第二天将细胞移至液氮罐中以长期保存。[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]细胞形态学观察[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）铺板[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]取[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]对数生长期[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] H446[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]69[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]526[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]MS114[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数，分别接种等量细胞至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]“[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]十字形[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]”[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]晃动，使细胞分布均匀，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]继续[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）药物处理[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]待细胞融合率约[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]80%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]不同浓度（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]IC20[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]IC50[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）含药培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。每组均设置[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]MSO[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]对照组。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）放入培养箱培养[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]48[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]72[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]h[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]后观察细胞形态并拍照。[/size][/font]

问题：观察细胞调往用透视电镜还是扫描电镜？回答：应该是用扫描电镜。首先你应该选用24孔板，然后把一个大约边长1厘米的盖玻片（自己用剪刀剪的）保证无菌，放入24孔板的底部，然后把细胞点入培养板，培养过夜，让细胞帖壁于小盖玻片上，然后加药，按照你需要的处置时间，培养48小时，或者是72小时，然后用镊子把小盖玻片拿出来，用固定液固定梯度脱水，染色。最后由电镜专业操作人员在扫描电镜下观察。可以帮你分析是否出现淍亡小体，淍亡小泡等。

低温扫描电子显微镜可以观察不同含水量样品的细胞超微结构吗

我要观察重金属对植物细胞形态的影响，请问各位我是用扫描电镜还是用透射电镜？

各位好，新人报道，请多关照今天用FEI的透射电镜观察细胞样品，设置加速电压200kv，结果视野混乱不堪，没法看。后查阅文献，发现别人都设置80~120kv，我想请教各位，发射电压会对最终的结果产生决定性影响吗，多谢！

蔡康显微镜下的观察纤维细胞的微管分布-技术精华 目前显微镜观察微生物有：生物显微镜 蔡康高档显微镜 荧光显微镜 倒置显微镜 都可以观察研究微生物，请看下面阐述介绍 [img=340,340]http://www.zskp.org.cn/Article/UploadFiles/200803/2008030615471734.jpg[/img]一、目的要求　　1．明确显微镜计数的原理。　　2．学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。　　二、基本原理　　利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（ 0．1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。　　血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。血球计数板构造如图Ⅷ-1。　　计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图Ⅷ-2）；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图Ⅷ-1，C）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格，如图Ⅷ-2。　　每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。　　在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。　　下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数　　因1ml=1cm3=1000mm3，　　 　　 (即0.1mm3中的总菌数)为(A/5)*25*B=50000AB（个）　　同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A＇，则　　 1ml菌液中总菌数=(A＇/5)*16*10*1000*B＇=32000A＇B＇(个)　　 　　　三、器材　　酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。　　四、操作步骤　　1．稀释　　将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。　　2．镜检计数室　　在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。　　3．加样品　　将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。　　4．显微镜计数　　静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。　　5．清洗血球计数板　　使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。　　五、实验报告　　1．结果　　将结果记录于下表中。 A表示五个中方格中的总菌数； B表示菌液稀释倍数。　　2．思考题　　根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？这是多年以来上海蔡康光学经历磨炼 得出的结果，也为研究人员带来的方便，为国家作出贡献.

【序号】：1【作者】：刘璐璐【题名】：三维培养条件下骨髓间充质干细胞的形态学观察【期刊】：山西医科大学【年、卷、期、起止页码】：2022【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C475KOm_zrgu4lQARvep2SAkueNJRSNVX-zc5TVHKmDNkhj_JpBBTDZS90To-XUT-zkJYyY14qZp-BPIDn6w4bDJ&uniplatform=NZKPT

[font='times new roman'][size=18px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]顺铂的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]细胞毒性实验及细胞形态学观察[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）当[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H1299[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞融合到[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]80%-90 %[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]左右，消化处理细胞并计数。将[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]H1299[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞以[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]个[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]/[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔的比例接种到[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]96[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板中，保证细胞分布均匀，培养过夜使细胞[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]贴[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]壁。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）分别配置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]0[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]100[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1000[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]M[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]含顺铂[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]培养基，沿着侧壁加入到[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]96[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板中，每孔[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]200[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，每个浓度设置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]6[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]个复孔。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]96[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板外围加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]100[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PBS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]缓冲液[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，防止边缘效应[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）将[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]96[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板放入培养箱培养[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]天后，用倒置相差显微镜观察细胞形态并拍照。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MTS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]法测定细胞活力，每孔加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]20[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] MTS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]试剂，全程避光，继续培养[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3 h[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。利用酶标仪[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]490 nm[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]波长检测各孔[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]OD[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]值。用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODtreat[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]/[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODcontrol[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表征细胞活力，计算细胞活力。细胞活力测定数据是基于三次独立的实验。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]在细胞迁移过程中，细胞内上皮间充质转化（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]）相关蛋白的表达量会发生相应的变化。为了检测外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体与细胞孵育时间对[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]相关蛋白的影响，实验[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]测定了加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]个外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体颗粒后[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]在[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]第[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]天[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]相关蛋白的表达[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]量[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]变化[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。如图所示，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]E-Cad[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白的表达量在第[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]天逐渐减少至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]最初[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.7[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]倍。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]N-Cad[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Vimentin[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白在第[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]天的表达量分别增加了[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]倍和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]倍。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以上结果说明[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]与细胞共培养[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]天后，细胞内[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]相关蛋白变化更为显著。[/size][/font][table][tr][td][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108012221112395_9347_5111497_3.jpeg[/img][/align][/td][/tr][/table][align=center][font='times new roman']图[/font][font='times new roman']1[/font][font='times new roman']外[/font][font='times new roman']泌[/font][font='times new roman']体与[/font][font='times new roman']H1299[/font][font='times new roman']细胞孵育时间对[/font][font='times new roman']EMT[/font][font='times new roman']相关蛋白的影响[/font][/align][font='times new roman'][size=16px]为了进一步在蛋白水平上验证外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体可以促进细胞迁移，我们提取共育[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]天的细胞蛋白质，检测[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]EMT[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]相关蛋白的表达变化。实验结果显示，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]随着外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体浓度的增加，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]E-Cad[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白表达降低，而[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]N-Cad[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Vim[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]en[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]tin[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蛋白表达增加。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]上述[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]结果可进一步证明捕获的外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体可以诱导[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]迁移[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]具有良好的生物活性。[/size][/font]

【序号】：6【作者】： 林凯桑1范丽君1王思妤【题名】：温敏水凝胶负载脂源性干细胞对糖尿病大鼠皮肤创面血管新生影响的观察【期刊】：中国糖尿病杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2017,25(05)【全文链接】：[url]https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2017&filename=ZGTL201705016&uniplatform=NZKPT&v=EA0CPV8r76bbb--4Qj1qW8mJCho712c0S7Rn_S1GBICG9z5E1xkrKRZnX-sKhVIn[/url]

【序号】：2【作者】： 贺译贤陈朗周国富【题名】：自体脂肪源性干细胞基质凝胶治疗慢性难愈性创面的临床疗效观察及炎症调节机制研究【期刊】：四川医学. 【年、卷、期、起止页码】：2021,42(10)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2021&filename=SCYX202110003&uniplatform=NZKPT&v=Es9rYcCUNnG-j1KYphaJAWZJThEhNp8aOg4UwG5RyKOqkdTgFtgXQhqKeePdqqjL

利用活细胞成像工作站进行细胞和基因的功能研究，是生物医学研究的最新趋势。固定细胞观察仅能提供固定瞬间细胞的静态信息，无法反映细胞在正常生理生化条件下的状态活细胞观察，对处于正常生理状况下的细胞进行全程扫描和记录，获得其连续、全面、动态过程。由于其显示的正常细胞动态的活动过程，很容易发现和确定细胞间相互作用和信号传导的过程，以及在活细胞水平上的生物分子间的相互作用，不仅可以解决长期以来悬而未解的问题，更为未来的研究提出新的问题，指出新的方向。

美国南加州大学科学家表示，他们新发现的名为IQ－1的小分子在防止胞胎干细胞分化成一种或多种特殊细胞方面具有决定性作用，该研究成果有望帮助人们开发出无污染大规模培养胚胎干细胞的方法。有关研究刊登在美国《国家科学院院报》网站上。　　干细胞疗法是许多科学家研究的热门项目，大规模培养胚胎干细胞是干细胞疗法成功发展的前提。目前，实验鼠纤维原细胞饲养层是唯一被证明为能够培养胚胎干细胞的方法。在此方法中，必要的化学信号能促使胚胎干细胞不断分裂而不分化。然而，南加州大学凯克医学院医学和药学教授迈克尔卡恩博士表示，人体胚胎干细胞用饲养层培养会遭受实验鼠糖蛋白标识的污染，如果将培养的干细胞用于人体，或许出现可怕的免疫反应。　　作为发现IQ－1小分子的研究小组主要研究人员，卡恩表示，他们发现的小分子帮助人们向实现无实验鼠纤维原细胞饲养层培养胚胎干细胞的方法往前迈进了一步。对于IQ－1的工作原理，卡恩解释说，Wnt通道（也就是细胞信号通道）对干细胞具有分叉效应（dichotomouseffects），IQ－1能够在阻断Wnt通道一个分叉的同时，增强来自Wnt通道另分叉的信号。这样，人们可以从根本上维持干细胞的生长和所需的力量。　　卡恩认为，如果人们能够创造出一个化学物质环境的系统来培养人体胚胎干细胞，那么就可以避免干细胞受污染的危险，它将让科学家的工作更加容易，这是研究小组的奋斗目标。凯克医学院干细胞和再生医学中心主任马丁佩拉博士表示，卡恩他们的研究让人们能够观察胚胎干细胞内部分子控制机制，其新发现有望帮助人们开发出大规模繁殖纯胚胎干细胞的技术。

中国科技网讯 从一个受精卵发育成多种功能的胚胎，细胞要经过上千次分裂和复杂的排列重组。据物理学家组织网6月3日报道，霍华德·休斯医学研究院珍妮莉娅法姆研究学院开发出一种最新的成像技术，能以前所未有的速度和精确度看到这一过程，让人们能追踪胚胎成形时每个细胞在几天甚至几小时内的变化。相关论文发表在6月3日出版的《自然·方法学》上。 研究人员演示了一段约20小时的果蝇胚胎发育视频。在视频中，生物结构逐渐出现，从一小团简单的细胞簇慢慢变长，变成上万个细胞紧紧挤在一起的拉长的小胚胎，然后在新形成的肌肉收缩舒张下开始颤动，此时胚胎仅有半毫米长。此外，论文中还有一段果蝇胚胎中枢神经系统完整的发育视频，跟踪了单个细胞发育出感觉器官、脑叶及其他结构的过程，由于分辨率足够高，还能看到神经轴突尖端迅速变化。 发明该技术的珍妮莉娅法姆研究学院的菲利普·凯勒说，要理解一个单细胞怎样变成了复杂的组织，真实看到这一过程非常重要。传统光学显微镜速度太慢，无法跟踪细胞在生命初期的迅速变化，也容易破坏一个活胚胎，只能通过把多阶段、多组织的照片拼在一起，才能推测发生的变化，但“细胞分裂重组每次都不一样，这种观察方法可能会产生误导”。 新技术基于一种高速非侵入式光学显微镜，称为SiMView光层显微镜，能从4个角度同时拍摄图像，不仅能跟踪细胞运动，还能对发展过程进行数量分析。该显微镜由凯勒小组和德国的欧洲分子生物实验室合作开发，攻克了传统光学显微镜的两个难题：一是光源对样本造成的伤害，二是对海量数据进行处理分析。 大部分光源都会伤害细胞，使其中的荧光标记消失。研究小组设计的照明技术是一种激光扫描层，一次照射样本极薄的一层以减少伤害，由探测仪记录下被照亮的部分。光层来自两个相反方向，并用两个探测仪来探测荧光，照明与探测相结合，提供了4个不同的观察角度。不仅能避免由于光散射而造成的模糊，还将图像采集速度提高了50倍。 要让照亮样本和探测荧光在时间、位置上协调一致，时机吻合极为重要，光层交叉通过会造成图像模糊，发光间隔仅几毫秒。为了保持精度，SiMView还安装了实时调节的电子系统。 显微镜每秒会收集350Mb的数据，一个样本一天要产生海量数据，而不同条件或不同基因的发育对比实验，所要求的数据比这还要多好多倍。为此，研究人员开发出一种新的计算方法，能识别并跟踪显微镜视频中单个细胞并自动分析。这些都构成了拍摄活样本这一完整技术框架的必要组成部分。 凯勒表示，他们还将继续改进显微镜使计算过程更加有效。今后不仅能追踪胚胎中细胞的一代代世系，还可能控制发育以探索发育机制，并研究其他更大更复杂样本的发育过程。（常丽君） 《科技日报》（2012-06-05 二版）

大家还记得我吗？好久好久没有来发帖了，肯定都快被遗忘了。一直在忙着养细胞，这次过来给大家分享一些自己的心得体会。↓↓↓养了很久的细胞，有一些经验和体会总结一下，和大家分享一下。关于如何把细胞养的形态很好更漂亮。1.不同的细胞，喜欢的环境是不一样的。这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。有一些细胞是数量多一点比较好生长，生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞，生长速度非常得快，贴壁速度很快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。这个是我师兄发明的，谢谢他了。这个方法真的很好用！3.关于培养瓶内加入培养基的量的问题。这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。（可能也是竞争很大，有优胜劣汰吧。呵呵。）对于生长速度快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。4.关于选择培养瓶的问题。个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞，在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，塑料瓶比玻璃瓶会好，对于生长速度慢的细胞，玻璃瓶则会更好。同样，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候，塑料瓶会好一点，比如刚刚复苏的时候，或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。今天就先分享到这里吧，等下次有时间来逛帖的时候再来分享。大家一定要注意：要想把细胞养的漂亮，一定要保持实验室干净整洁。至于怎么保持，方法很重要，更重要的是要有责任心。方法的话，可能每个人都会有自己的一套方法，不过能走捷径的还是可以走的。像我们实验室，现在很多都是利用软件来管理的。还记得之前给你们推荐的那款软件吗？我们实验室现在还在用，倒是真的蛮好用的，至少大家做实验的时候不会再乱堆乱放了（因为有领用记录）可能新朋友不知道，或者没有看过我上篇帖子的人不了解，如果相信我的推荐，可以看下我上一篇帖，谢谢，希望能帮到大家！差点忘了，那款软件更新成了iLab，不叫Mr.F了。其他不多说，省得被当成打广告的！

大家还记得我吗？好久好久没有来发帖了，肯定都快被遗忘了。一直在忙着养细胞，这次过来给大家分享一些自己的心得体会。↓↓↓养了很久的细胞，有一些经验和体会总结一下，和大家分享一下。关于如何把细胞养的形态很好更漂亮。1.不同的细胞，喜欢的环境是不一样的。这个不仅仅是说培养基的不同，还有就是细胞生长的空间密度问题。有一些细胞是数量多一点比较好生长，生长状态也比较好。这种一般是属于生长速度慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数量少一点细胞状态会生长的比较好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞，生长速度非常得快，贴壁速度很快，所以传代时就应该留很少量的细胞，这样细胞状态会比较好。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该摸索该细胞喜欢的生长空间密度问题。2.对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。这个是我师兄发明的，谢谢他了。这个方法真的很好用！3.关于培养瓶内加入培养基的量的问题。这个是要靠自己去摸索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，大方瓶14ml的。有些细胞反而是培养基少一点相反细胞形态会长得比较好。（可能也是竞争很大，有优胜劣汰吧。呵呵。）对于生长速度快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基细胞形态会更好。但是要注意换液掌握。4.关于选择培养瓶的问题。个人发现生长速度快的细胞在玻璃瓶内生长的状态会比一次性塑料瓶相对好一些。而对于同一种细胞，在其生长旺盛快速的时期在玻璃瓶内的生长状态也比塑料瓶内好。这可能是因为塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速度快的细胞在塑料瓶这种相对“更安逸”的环境里反而长得状态不如玻璃瓶好。所以对于生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，塑料瓶比玻璃瓶会好，对于生长速度慢的细胞，玻璃瓶则会更好。同样，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候，塑料瓶会好一点，比如刚刚复苏的时候，或者原代培养的时候。而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。今天就先分享到这里吧，等下次有时间来逛帖的时候再来分享。大家一定要注意：要想把细胞养的漂亮，一定要保持实验室干净整洁。至于怎么保持，方法很重要，更重要的是要有责任心。方法的话，可能每个人都会有自己的一套方法，不过能走捷径的还是可以走的。像我们实验室，现在很多都是利用软件来管理的。还记得之前给你们推荐的那款软件吗？我们实验室现在还在用，倒是真的蛮好用的，至少大家做实验的时候不会再乱堆乱放了（因为有领用记录）可能新朋友不知道，或者没有看过我上篇帖子的人不了解，如果相信我的推荐，可以看下我上一篇帖，谢谢，希望能帮到大家！差点忘了，那款软件更新成了iLab，不叫Mr.F了。其他不多说，省得被当成打广告的！

请问活性污泥里细菌细胞需要用多少倍数生物显微镜，我用1600倍的只能看到放大的污泥，看不到细菌细胞。http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em61.gifhttp://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em61.gifhttp://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em61.gif

做cell biology实验，细胞铺板大概是最常见的一个实验了。但是有很多人不是很得要领，铺得不是均匀： 要么中间密周围稀，要么周围密中间秃顶。以下是我的一些技巧，希望可以帮助到大家。1. 一般96孔板我每孔是加100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部加入，加完半边板后，将未加的细胞悬液混一下再，继续加剩余的半边板子，都加完后盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度（我一般轻巧敲三下），太强或次数太多会导致细胞集中成堆，将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，静置约5分钟，放入37度培养箱。 6孔板12孔板或24孔板，我均采用将第一个孔加入少量无血清培养基，晃动浸润整个孔底，然后用移液枪吸至第二孔，同样方法浸润孔底，其它孔一次类推，这样整个孔底都是湿润的，细胞悬液会平铺在整个孔底，加细胞悬液的时候可以避免加在中间中间细胞多，而加在周边晃匀后周边细胞多中间少的现象，细胞分散较均匀，注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。这个方法就是有点慢，但操作熟练了也不慢。也可以采用轻拍的方式，但力度没有96孔板好掌握，效果没有96孔板好，所以我放弃改用浸润孔底的方法。2.细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。然后从底部敲击，使之分散。3. 如果实验室有平板振荡器的话，我建议用这个仪器稍振荡一下，效果不错，就是振幅小，频率高的那种。4. 细胞要尽量打散，大部分呈单个状态。离心后，要充分悬浮！还有转移到六孔板后，是要晃得！晃的时候最好不要让那个细胞液转圈，不然细胞就全被带到中间去了，就会不均匀！5. 一瓶细胞长满后，正常处理，在培养瓶里吹匀，然后铺6孔板，每孔2毫升，铺完之后不用观察直接用酒精棉擦拭，然后放到培养箱里，轻微的左三圈右三圈 前三圈 后三圈。基本上24小时之后观察 每孔的细胞都会很均匀。6.计算好所需要的全部液体量和细胞量，混匀后，加到六孔板里，六孔板按横8字型晃，显微镜下观察，如果不均匀，按上述方法再晃。如果细胞未计数直接种的话，在种六孔板的过程中，随时晃一下混匀用的瓶子，瓶子我通常是顺时针或逆时针转圈。7.放在水平板面上先上下移动，再左右移动，每个方向５到６次，但关键的是摇完后最好直接放入培养箱中，不要再做过多的运动，例如放到镜下去看，否则很容易就又聚到中间去了。

请教大家：有人用AFM进行过细胞成像吗？ 就是样品基底上生长细胞后，经过固定、脱水、干燥，能直接用AFM观察吗？（很多是经干燥后喷金，进行SEM观察的）要注意哪些问题呢？

二、仪器、用品与试剂0.4 % w/v 台盼兰trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline 血球计数盘及盖玻片(Hem℃ytometer and coverslip) 计数器(counter) 低倍倒立显微镜 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 三、操作步骤（一）细胞计数3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色 ( 或红色- Erythrosin bluish) 。3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数x 2/ 4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占 10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。（二）细胞活力1、将细胞悬液以 0.5ml加入试管中。2、加入 0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色 2一 3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用 。