微滴式数字系统

永诺生物将在2021年5月18日“第四届基因测序网络会议”上推出最新型号MicroDrop-20微滴式数字PCR系统。在本次大会上，您可了解到最新产品优势，及其应用解决方案等，同时将请专家全面介绍数字PCR技术在临床中的应用。 演讲嘉宾吕晓明南方医科大学肿瘤学博士南方医科大学/香港城市大学博士后，香江学者南方医科大学第三附属医院副研究员，硕士生导师作为课题负责人承担国家自然科学基金青年项目1项，广东省自然科学基金3项，广州市产学研协同创新重大专项，中国博士后基金面上项目，南方医科大学科研启动计划各1项。作为主要参与者参与国家基金9项。共发表SCI论文30余篇，其中通讯作者及第一作者（含并列）在PLOS Pathogens，Molecular cancer, Nature communications, Oncogene, Molecular Therapy - Nucleic Acids , Biomaterials 等国际知名期刊发表论文10余篇,被引用频次820次，H因子16。Emerging Infectious Diseases, Genomics, OncoTargets and Therapy，Oncology letters等杂志审稿人。发布会时间会议形式：线上会议日期：2021年5月18日(周二)时间：上午09:30-10:30长按下方二维码，进入会议现场 什么是数字PCR?微滴式数字PCR（Droplet digital PCR, ddPCR)是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR以及QPCR相比，微滴式数字PCR拥有绝对定量，无需标准曲线；以及更高的检测灵敏度，基因突变检测灵敏度可高达十万分之一，基因表达绝对定量检测灵敏度高至单拷贝，基因拷贝数变异检测灵敏度高至0.1倍；和更好的数据重复性，更高的数据精密度，更高的抑制物的耐受度，以及绝对定量等优势，对于相对复杂的临床样本都能够很好的应用场景，如肿瘤液体活检，肿瘤早筛或NIPT等靶标核酸分子含量很低的情况，凭借微滴式数字PCR技术特点，能够有效对靶标分子进行精准检测，从而及时为临床提供预防或治疗方案。 新品优势！永诺MicroDrop-20微滴式数字PCR系统：1. 灵敏度：基因突变0.1%；绝对定量CV微滴生成快速高效，一张芯片可同时处理8个样本，一次微滴生成耗时2mins。4. 检测通量高，约2mins检测一个样本，可同时检测高达96个样本，样本信息支持灵活设定。 创新My点！MicroDrop系列产品：1. 型号MicroDrop-100可一次生成10万微滴，高端精准，已获批医疗器械注册证，适合多重数字PCR的应用。最新推出型号MicroDrop-20，可一次生成2万微滴，检测快速，质量保证且性价比高，适合大部分数字PCR应用场景及进口替代。2. 微滴生成采用油包水乳化微滴技术，微滴生成芯片为高精度微流控芯片设计，三维微纳防污染结构，生成微滴效果稳定高效。3. 专业团队研发验证的微滴生成配方，微滴均匀稳定，不易破裂。4. 全封闭防污染，一键式自动化操作，配套QuantDrop软件界面中英可选，人性化设置，多种分析工具供用户选择，全自动分析，直接显示分析结果，采用最新工业数据标准格式fcs3.1，支持输出JPG/WORD格式报告。5. 超过40种配套基因检测试剂盒，拥有强大的研发团队，支持定制开发应用试剂。 关于永诺：广州永诺生物科技有限公司成立于2010年，总部位于广州国际生物岛，是一家专注于医学科学技术开发与服务、分子诊断产品研发与生产的高新技术企业。公司目前占地面积近6000㎡，其中硕、博士以上学历员工占比近40%。公司依托先进的技术力量以及优秀的人才储备，在科研服务、医学检测和数字PCR产品三大业务上保持领先的竞争优势。2017年10月永诺生物旗下全资子公司--永诺医疗成功研发了国内首款拥有完全自主知识产权的微滴式数字PCR系统MicroDrop并投入生产，并已建成符合GMP标准的分子诊断试剂及产品车间3000㎡，联合广东顺德创新设计研究院成立工程技术中心，联合香港中文大学深圳研究院成立研发实验室，累计申请国家发明专利22项，授权13项，目前MicroDrop® 数字PCR系统于2020年8月，取得医疗器械注册证。成为国内第一家国家认证的高通量流式微滴数字PCR仪，能广泛应用于科研、医疗、食品安全、出入境检验检疫等领域。

导读反刍动物是指具有反刍习性的一类哺乳动物，如牛、羊、长颈鹿、兔子等。反刍动物采食一般比较匆忙，大部分未经充分咀嚼就吞咽进入瘤胃，经过瘤胃浸泡和软化一段时间后，食物经逆呕重新回到口腔，经过再咀嚼混入唾液并再吞咽进入瘤胃，这种行为称为反刍行为。反刍动物的食物种类比其他种类的动物更丰富，结构组成也更复杂，但草料中的粗纤维含量较高导致其难以消化，反刍动物依赖于胃部微生物群的代谢能力来消化各种物质，但其转化效率低也是养殖业广泛关注的问题。虽然已有研究证明瘤胃中不同微生物的活性可以调节宿主利用植物生物能量的能力，但定植于宿主瘤胃中的微生物却很少受到关注。奥地利维也纳兽医大学的Cameron等人在Research Square在线发表了题为《Differential partitioning of key carbon substrates at the rumen wall by recently diverged Campylobacteraceae populations》的研究论文。文章采用多重数字PCR（dPCR）量化同一菌科的两种菌群，分析反刍动物瘤胃上的定植菌群分布及生物进化动态，为今后畜牧业提高动物代谢能力的研究提供了新思路。应用亮点：▶ 宏基因组测序发现瘤胃上皮细胞中弯曲杆菌科两个种群的基因序列高度相似，利用naica® 微滴芯片数字PCR系统可以对两个种群进行精准量化。▶ 使用不同培养添加物后，可以利用naica® 微滴芯片数字PCR系统进行微生物种群分布跟踪。研究成果：作者通过对瘤胃上皮微生物组的16S rRNA扩增子分析发现了一个优势菌株（OTU）为弯曲杆菌科（Campylobacteraceae），并通过宏基因组测序发现该OTU两个主要种群Ca. C. stinkeris与Ca. C. noahi的基因含量高度相似，但pgl（蛋白质糖基化）操纵子不同。为了探究Ca. C. stinkeris与Ca. C. noahi两个种群空间分布的差异，作者通过naica® 微滴芯片数字PCR系统比较了这两个种群在不同动物瘤胃乳突离上皮壁最近和最远两个位置的含量。结果发现不同动物的两个种群在这两个位置的比例接近。▲图1 Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在动物瘤胃乳突顶端和隐窝的含量比例。A）从乳突切片两个位置提取DNA使用dPCR进行定量分析。B) Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在动物瘤胃乳突两个位置的含量比例。横坐标为取样动物的名字。然后作者使用naica® 微滴芯片数字PCR系统对两种菌群进行生长和适应性测定，数据显示Ca. C. stinkeris可以在以醋酸盐为主要碳源时积累的生物量，更好地生长，但被丙酸盐抑制，而Ca. C. noahiz在任何一种添加物存在的情况下在都没有检测到生长优势。因此，作者推断可能存在一些其他机制来最小化竞争，这种机制通过某些代谢生态位维度上的分化，防止它们生长动力学的重叠来支持两个种群的共存。▲图2 醋酸盐利用和丙酸盐抗性检测。A)通过种群特异性dPCR，评估添加5 mM醋酸盐（acetate）或丙酸盐（propionate）对生物量积累的影响。分别用单个菌株(左，单一培养)和竞争菌株(右，共培养)进行了实验。通过数字PCR这种精准的定量技术，作者发现在瘤胃乳突的顶端和隐窝都分布有这两种优势菌群，且与上皮细胞分布数目无显著的相关性。另外，这两种菌群能够促进相关脂肪酸的代谢，进而发挥促进食物消化的功能。该文章为通过调节反刍动物体内某些盐离子浓度来调节优势菌群的分布比例进而提升消化能力提供了思路。

2021年4月30日，北京新羿生物科技有限公司正式推出具备多达五个荧光检测通道的微滴数字PCR系统，一举将基于流式检测的微滴数字PCR检测通道数推向了全球领先水平！将使微滴数字PCR更快捷、更容易、更高效地分析生物样本，为科学研究和临床应用提供有力工具。这一高性能产品的推出，既是数字PCR仪器领域的突破，也体现了我国在高端仪器设备研制方面的进步。数字PCR作为一种新兴的核酸检测和定量方法，因为其绝对定量、单分子灵敏度等突出优势，正成为生命科学和精准医学领域的关键技术，在重大疾病的精准诊断、基因治疗和细胞治疗等方面应用日益广泛，国际主流生命科学和医学诊断企业竞相投入研发。数字PCR的技术路径，主要包括反应体系分割和荧光检测两个关键环节。从反应体系分割实现方式可以分为微滴和微孔两种方式，从检测方式可以分为流式和成像检测两种方式。其中，微滴方式具有耗材成本低、微滴尺寸均一性好、样本通量高等优点；流式检测具有荧光检测灵敏度高、信噪比高、多指标检测能力强、液滴数目不易受限制等优点。基于微滴和流式检测结合的技术路线开发的数字PCR平台，在数字PCR多个关键环节表现更优异且性能继续升级的发展潜力大。新羿生物通过自主创新，是掌握上述流式微滴数字PCR核心技术的领先企业。精准医学尤其分子诊断的快速发展，对于多指标并行检测需求日益迫切，目前全球市场上，流式微滴数字PCR系统仍然以2-4色荧光通道为主。新羿生物利用首创的激光准共聚焦光路高效激发液滴荧光，在光谱带宽内完成更多荧光通道检测，利用专利算法消除通道间的荧光串扰，从而实现5色荧光通道同步高速检测，在全球率先推出五色荧光通道的流式微滴数字PCR平台，不仅实现了荧光通道数的突破，还实现了高灵敏度高信噪比的微滴荧光检测，领先国际行业水平。新羿五色通道数字PCR的优点（SMART）：Saving：节省稀有样本、检测试剂耗材和检测时间；Multiplex：满足多指标联检需求；Accurate：提供准确的核酸定量结果；Rapid:3小时内获取检测结果；Throughput：一次扩增多至96个样本。新羿五色通道数字PCR的创新点：1．全球首创准共焦光路，微液滴流式5色荧光通道同步检测实现高信噪比液滴荧光检测，无需专门添加本底荧光，每个通道性能稳定一致。可获得更丰富的样本数据信息，多重检测应用空间大。2．全新的高维分水岭分类算法五色荧光通道自动分类，简化多指标体系的荧光分类过程，分类结果准确可靠，分析结果查看便捷直观。3．全封闭微滴PCR扩增和检测全封闭PCR扩增和检测，有效防止气溶胶污染，保证结果准确。“作为一家研发和生产高端数字PCR的高科技企业，新羿生物致力于提供持续创新的核酸检测技术，努力追求为用户提供更加优质的服务。此次在全球率先推出五色通道微滴流式数字PCR系统，将有助于临床科室和研究团队节约人力以及时间成本，节省珍贵的临床样本，提升工作效率。”新羿生物杨文军博士说。●关于新羿生物●新羿生物成立于2015年，位于中关村科技园，专注于分子诊断技术的自主创新及重大疾病应用转化，拥有在仪器、芯片、材料、试剂软件等领域的高水平研发团队，公司发展迅速，申请国内外专利100余项，授权专利40余项，持续在权威期刊发表学术论文，承担国家级科研基金，公司基于自主知识产权研发的国际领先数字PCR系统，连续两年获得中国体外诊断优秀创新产品金奖，荣获中关村国际前沿科技创新大赛总冠军，公司秉承“创新，让精准触手可及”的理念，发展多指标、高通量、自动化、防污染、成本低的分子诊断技术，致力于成为领先的生命科学和分子诊断企业，服务于生命科学、精准医疗、药物开发及健康管理。

在现代水产养殖中，水产养殖系统的水质直接影响鱼类的健康和生产。微生物在去除有机物和氮循环、有毒硫化氢(H2S)的产生方面发挥着至关重要的作用，但是如果微生物对鱼类致病或发挥益生菌特性，则会直接影响鱼类的健康。近日，法国Stilla公司和挪威SINTEF Ocean合作在《Journal of Microbiological Methods》杂志上发表了一篇名为“Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR”的文章，旨在对水产养殖的相关优势细菌进行检测。在本文中，作者主要分析了与鲑鱼生产相关的三种不同的细菌：第一种为鱼类病原体，与鱼类的溃疡性疾病有关的Moritella viscosa，会引起肠性红嘴病的Yersinia ruckeri以及与鱼类的细菌性冷水病有关的Flavobacterium psychrophilum。第二种为可以从海产品转移到消费者身上的人类病原体，Listeria monocytogenes。第三种为通过破坏饲养环境威胁鱼类健康的细菌。通常硫酸盐还原细菌（SRB）在厌氧条件下通过将硫酸盐（SO42-）转化为有毒的硫化氢（H2S）来影响鱼类健康。可通过以Desulfovibrio desulfuricans为参考菌株进行SRB检测。研究学者利用naica® 微滴芯片数字PCR系统的单重和多重检测方式对上述优势菌种进行绝对定量。结果表明Moritella viscosa， Yersinia ruckeri，Flavobacterium psychrophilum检出限在20 fg左右，Listeria monocytogenes和Desulfovibrio desulfuricans DNA检测含量可低至2 fg，同时它们都具有较高的线性动态范围（图1）。多重cdPCR检测结果与在相应的单重分析中检测到的目标基因浓度非常吻合（图2，图3）。此次试验充分证明了naica® 微滴芯片数字PCR系统可以同时精确定量复杂水质样品中多种优势菌株。▲图1 ：naica® 微滴芯片数字PCR系统定量5种优势菌种的线性回归图，分别给出相应的方程和回归系数▲图2：对Yersinia ruckeri（A）Flavobacterium psychrophilum（B）的单、双重分析结果进行比较。在MMC-DNA背景(1 ng/μl)中添加Yersinia ruckeri ，Flavobacterium psychrophilum gDNA，10倍稀释后进行基因拷贝数定量。▲图3 ：在1 ng/μl MMC-DNA背景下，单重(圆形)和三重(三角形)测定的靶基因拷贝浓度绘制。恒等线表示每个点的X坐标和y坐标相等的位置。文章基于naica® 微滴芯片数字PCR系统完成对多种优势菌株的定量检测。naica® 微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司的naica® 微滴芯片数字PCR系统在进行核酸检测时具有独特的优势。该系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要两个半小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

仪器简介：DIC（Digital Image Correlation）数字图像相关技术是一种非接触式测量材料全场应变、位移的光学测量技术，该技术几乎适用于任何材料且测试面积广、结果精确。Dantec Q-400μDIC丹迪公司研发生产的一款专门用于测量微电子元件、生物材料变形的显微DIC测量仪，可测量一些显微结构的翘曲实验、热膨胀系数等，具有精度高，体积小等优点。技术参数：测量维度：二维、三维测量区域：0.1mm×0.1mm至17mm×17mm测量精度：位移（1μm），应变（0.005%）主要特点：精度高、测量范围广、无接触、方便使用创新点：显微结构测量，可检测100微米至15mm范围的试件 可以直接测量构件的翘曲、热膨胀系数 显微数字图像相关系统

导读韩牛（Bos taurus coreanae）是一种驯化的哺乳动物，在韩国消费市场作为食物资源，其牛肉消费量远超其他品种，这种消费模式导致了区分韩牛和其他牛品种的分子研究的出现。不仅是牛，其他经济动物的不同品种在市场中的经济价值也存在较大的差异，所以准确进行种质鉴定势在必行。在之前的一项研究中，使用传统的PCR方法和Sanger测序验证确定了由TE关联缺失事件产生的韩牛特异性SV。它可以用作区分不同牛品种的分子标记（即韩牛与荷斯坦牛）。然而，PCR存在缺陷，每个样品都有各种最终拷贝定量。为了克服传统PCR的局限性，并准确评估先前研究中确定的韩牛特异性SV位点，檀国大学生物医学科学系联合畜牧研究所和檀国大学医学院，使用naica️ ® 微滴芯片数字PCR系统对韩牛特异性SV位点进行了更为精确的检测，并将成果《Quantitative evaluation of the molecular marker using droplet digital PCR》发表在Genomics & Informatics杂志上。转座元件（TEs）约占牛基因组的一半。它们可以是一个强大的物种特异性标记，在基因组进化时没有结构变异（SV）的回归突变。因此，作者应用naica️ ® 微滴芯片数字PCR系统对韩牛特异性SV进行准确的定量检测。虽然样品在韩牛群体中的等位基因频率变化较低，但naica️ ® 微滴芯片数字PCR系统可以通过绝对定量进行高灵敏度检测，可以做到比PCR更准确的定量。所以naica️ ® 微滴芯片数字PCR系统平台相比于传统PCR更适用于分子标志物的定量评价。应用亮点：▶ 使用naica® 微滴芯片数字PCR系统对韩牛特异性SV进行准确的定量检测。▶ dPCR测定在计数单分子和分析特定群体的少量拷贝时可以高精度地定量，与qPCR相比，具有更高的准确性。▶ 经过sanger测序，确定了naica️ ® 微滴芯片数字PCR系统检测准确无误，且操作和成本均低于测序。▶ naica️ ® 微滴芯片数字PCR系统适用于分子标志物的定量评价。实验方法：检测样本信息：共提取了五个棕色韩牛DNA和五个荷斯坦DNA作为实验样本。检测方法：为了更准确地检测韩牛特异性SV，将“Del_96”位点应用于naica️ ® 微滴芯片数字PCR系统（Stilla Technologies）。进行naica️ ® 微滴芯片数字PCR系统前确认韩牛和荷斯坦牛的DNA的浓度定量。FAM引物组和FAM探针用于检测韩牛和荷斯坦牛基因组。VIC引物组和VIC探针设计在韩牛特异性缺失（图 1B)。因此，FAM引物组和FAM探针（阳性对照）设计在所有牛DNA中检测。VIC引物组和VIC探针设计用于仅检测韩牛的荧光。▲图 1B实验结果：FAM染料在所有牛基因组中均被检测到，VIC染料仅在韩牛样品中显示出显著的检测。这表明所有韩牛基因组都包含特定的缺失序列（Del_96区域）。在韩牛样品中检测到VIC染料的信号平均浓度为243（copies/ μL）。虽然在荷斯坦样品中也检测到平均浓度0.12（copies/μL）的VIC染料信号，但这些信号相比韩牛可忽略不计。▲naica® 微滴芯片数字PCR系统检测韩Del_96和荷斯坦样品之间区域的绝对拷贝数比较。浓度图在 X 轴上指示样品数，在 Y 轴上指示对数刻度条（拷贝/μL）。（A）在所有样品中检测到FAM荧光。韩牛样品的绝对拷贝数大约是荷斯坦样品的两倍。（B）仅在韩牛样品中强烈检测到VIC荧光。最后，文章Results and Discussion给出-数字PCR适合作为验证物种特异性标记的平台。综上，对于naica️ ® 微滴芯片数字PCR技术，准确定量绝对拷贝数是一个关键特征，相比qPCR准确性更高，naica® 微滴芯片数字PCR为本文的检测提供了有利的支持，也验证了这一特征。在不久的将来，通过将物种识别工具应用于naica️ ® 微滴芯片数字PCR系统，它作为大样本量物种鉴定平台具有巨大潜力。所以naica️ ® 微滴芯片数字PCR系统适合作为验证物种特异性标记的平台。期刊介绍：Genomics & Informatics是由韩国基因组组织发行的涉及农业和生物科学、生物化学、遗传学、分子生物学、健康信息学等领域的期刊。

国家CDC在Diagnostic Microbiology and Infectious Disease发表了一篇文章，文中使用naica® 微滴芯片数字PCR系统检测了不同时间段临床流感样本的病毒载量，来评估RNA完整性和样本采集质量及对监测系统中流感诊断的影响。.应用亮点：▶ 使用naica® 微滴芯片数字PCR系统完成RNase P(RNP)RNA和流感基因的检测。▶ 低病毒载量的流感样品（ 10 拷贝/μl），在采集八天后依旧可以被naica® 微滴芯片数字PCR系统检测到，高低病毒载量的流感样品之间存在明显不一致的降解速率。▶ 检测作为样本采集质量的关键指标RNase P(RNP)RNA，对于流感的预防和控制至关重要。流感监测对于流感的预防和控制至关重要。然而医院一般只进行流感抗原快速检测，核酸鉴定却在网络实验室进行。由于流感病毒作为一种RNA病毒，不如DNA病毒稳定。因此诊断目标区域的RNA稳定性和完整性是实验室检测的主要挑战，并且人们对冷藏临床标本中流感核酸的稳定性也知之甚少。本文采用先进的核酸定量技术--naica® 微滴芯片数字PCR系统、用于对临床样本的RNA完整性进行系统评价，探索流感监测标本质量控制和评价的科学方法。通过实时RT-PCR检测的所有甲型或H1型流感阳性样本用数字RT-dPCR检测也呈阳性。图1清楚地显示了RNA随时间的降解。在甲型流感和H1流感测试中，RNA降解随着时间的推移不断扩大。在所有四个时间点通过数字RT-dPCR共检测了91个甲型流感病毒阳性样本的RNA含量和72个H1阳性样品的RNA含量，发现低病毒载量样本RNA降解比高病毒载量更显著且速度更快。在低病毒载量甲型流感样本测试中，第4组RNA降解率为75%至100%共有8个，其中有5个样本的RNA降解为检测不到（图1C）。在H1测试中，在第4组中75%至100%的RNA降解有9个低病毒载量样本，其中7个样本的RNA降解为检测不到（图1D）。▲图1.阳性样本的RNA随时间降解。(A)甲型流感阳性样本的RNA降解。(B) H1阳性样本的RNA降解。(C)低病毒载量甲型流感样本的RNA降解。(D)低病毒载量H1样本的RNA降解。(E)高病毒载量甲型流感样本的RNA降解。(F)高病毒载量 H1 样本的RNA降解。RNA降解=（第1组RNA含量-第n组RNA含量）/第1组RNA含量*100%。Y轴代表样本数。蓝色条表示0-25%之间的 RNA 降解，橙色条表示 25%-50%之间的RNA降解，灰色条表示50%-75%之间的RNA降解，黄色条表示 75%-100%之间的RNA降解。在研究中使用第1组RNP和流感RNA浓度参数比较样本采集质量。RNP值是样本采集质量的关键指标。样品质量采用 A-D 等级进行评估。图2表明，样本采集质量存在明显变化。图3比较了四家医院的样本质量。在甲型流感检测中，从M医院采集的样本质量最好，N、L、P医院采集的样本质量次之；在H1测试中，医院N采集的样本质量最好（图3）。▲图2：样本采集质量评估。(A)使用甲型流感和RNP参数评估样本采集质量。(B)使用H1和RNP参数评估样本采集质量。X轴代表流感A M基因(A)或H1 HA基因(B)的Log10 RNA浓度。Y轴代表RNP的Log10 RNA浓度。一个点代表一个样品的结果。红点代表M医院样本，黄点代表L医院样本，绿点代表N医院样本，蓝点代表P医院样本。样本质量分为A、B、C、D四个等级。▲图3：不同医院样本采集质量的比较。(A)不同医院甲型流感阳性样本采集质量的比较。(B)不同医院H1阳性样本采集质量比较。蓝条代表A级样本，绿条代表B级样本，红色条代表C级样本，黄色条代表D级样本。使用naica® 微滴芯片数字PCR系统检测流感样本的病毒载量，研究RNA完整性和样本采集质量，提醒我们，应定期开展样本质量评估，以发现和改进医院样本采集中存在的问题。

多重分析，即在单个反应中检测多个靶标，可以帮助用户节省宝贵的样品，并节省时间、试剂和成本。此外，和做多次单重实验相比，由于多重反应所有靶标都在同一个反应中进行扩增和检测，使得样品和试剂的移液操作误差减少，因此多重检测可以提高定量精度。naica® 微滴芯片数字PCR系统的多重检测与单重检测一样灵敏和精准。专业的分析设计和优化可以实现更复杂的多重检测，从而在单个PCR反应中用多对引物和探针扩增多个DNA目标。Crystal Miner软件是一个开放的数据分析软件，可以通过其提供的强大工具来帮助优化和完成多重分析。评估引物和探针性能的实验指南1.Stilla建议使用naica® multiplex PCR mix，该试剂设计的初衷是为了得到更好的多重naica® 微滴芯片数字PCR系统的实验数据。2.单重反应测试。在进行多重反应之前，每个引物/探针/模板均需要进行单重性能验证。例如，对于三重分析，在多重反应混合进行之前，首先应对核酸靶标进行三个单重反应。当进行单重反应时，预期结果只出现单一阳性。3.为了优化多重分析性能，样品性质也是十分重要的因素(例如，游离DNA和基因组DNA需要设计不同的DNA片段，分析游离DNA需要设计成短片段DNA，分析基因组DNA需要设计更完整的DNA片段)。4.使用的DNA模板应该没有污染物和可能的抑制剂。如果样品材料稀少或不容易获得，可以合成寡核苷酸作为模板分析优化。5. 评估每个单重反应的退火温度范围，在最佳反应温度下，阳性和阴性微滴分离良好且没有非特异性扩增(图1)。由Crystal Miner软件(图2)提供的Stilla可分离评价可以作为一种度量标准，用于确定所有探针的最佳退火温度。如果单重反应没有被很好地优化，可能会出现明显的非特异性扩增。此外，非特异性扩增可能由几个非优化参数造成。包括引物/探针二聚体或引物/探针非特异性。在这种情况下，可以采用多种方法限制非特异性序列的扩增，如提高退火温度、进行touch down PCR或重新设计引物序列等。实验前可使用相关软件评估引物探针的特异性。▲图1 ：Crystal Miner软件展示单重反应一维点状图，在60°C到65°C退火温度内， 蓝色、绿色和红色荧光通道检测到的荧光强度。黑框部分表示单重反应的最佳退火温度。可分性评分(e)可用于确定3个靶标扩增的最佳退火温度。(带*数字为可分性评分)▲图2 ：可分性评分是基于阳性和阴性微滴群体的距离。可分性评分是由Crystal Miner软件自动计算，并可以在高级QC标签栏下找到。6.在选定的退火温度下，使用所有引物和探针进行多重naica® 微滴芯片数字PCR系统，并以区分度为指导，评估反应性能。如果有需要，可从以下几点优化:★ 调整PCR的循环数——建议从45个循环开始，并增加循环数，以进一步优化阳性和阴性微滴群体之间的分离度。★ 调整引物和探针浓度——naica® 微滴芯片数字PCR系统推荐的引物和探针浓度范围可从0.125到1μM (图3)。对于多重分析的设计建议从较低的浓度范围开始,以减少反应的复杂性,减少引物和探针所占据的体积。▲图3。Crystal Miner软件的一维点状图显示了一系列引物(左图)和探针(右图)浓度不断增加时蓝色检测通道中的荧光强度。黑框部分表示良好的可分性评分，及在低引物探针浓度的选择标准下确定的用于多重分析的引物探针浓度。(带*数字为可分性评分)★ 使用修饰的碱基，如锁核苷酸(LNA)碱基或小沟结合基团(MGB)，以提高探针的Tm值，同时保持较短的长度(可能20nt)。然而，在多重检测中建议探针添加的MGB不超过2个，以避免扩增减少。7.评价引物和探针的相互作用：在同一个多重实验中引物和/或探针之间形成同源/异源二聚体的概率应保持在最低。二聚体是可以评估的，相互作用的分数可以用多种工具来确定(例如，IDT Oligo Analyzer Tool, Primer 3, Primer express, Beacon designer) (图4)。高浓度的引物和探针会增加非特异性相互作用的概率。因此，多重分析时，建议所有检测都从低浓度的引物开始(例如，0.25 uM)，如果需要，逐步增加浓度至1 uM(例如，提高扩增效率)。▲图4：引物和探针之间的相互作用示例。a)target 1的探针与target 2的反向引物相互作用(R2 target 2，红框)。当使用反向引物RI target 2时，没有检测到这种相互作用。在本例中，应选择RI target 2进行多重检测。b) target 1的探针与target 2的正向引物的相互作用(F2 target 2. 蓝框)。当使用正向引物F1 target 2时，没有检测到这种相互作用。在本例中，FI target 2应被选择用于多重检测。8.对于多重分析，荧光溢出补偿是十分重要的。使用多个单色参照，Crystal Miner软件可以创建一个补偿模型用于特定的多重反应。有关荧光溢出的更详细描述,请访问https://www.gene-pi.com/item/spill-over-2/。执行荧光溢出补偿的操作说明请参考Crysta Miner软件用户手册。naica® 微滴芯片数字PCR系统naica® 微滴芯片数字PCR系统，以Sapphire芯片（全自动）或Opal（高通量）芯片为耗材，形成25,000-30,000个微滴的2D阵列，以单层平铺方式进行PCR扩增实验。反应完成后对微滴进行三色通道或六色通道检测，从而对起始核酸浓度进行绝对定量。2.5小时内，可快速获得结果。

导读在过去的几十年中，糖尿病的发病率在全球范围内显著增长。除了不健康的生活方式外，环境污染物被认为是糖尿病发生的危险因素。多环芳烃 (PAH)是一类含有2-7个芳环的有机化合物，由自然和人类活动产生并广泛存在的污染物。流行病学研究表明，PAHs水平与成人和儿童的肥胖和二型糖尿病相关。厦门大学生命科学学院细胞应激生物学国家重点实验室的研究人员在Ecotoxicology and Environmental Safety上发表了题为《Prenatal exposure to a mixture of PAHs causes the dysfunction of islet cells in adult male mice: Association with type 1 diabetes mellitus》的文章。文中应用naica® 微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因DNA甲基化水平进行量化，揭示了产前暴露于多环芳烃混合物对成年雄性小鼠胰岛细胞功能的不良影响。应用亮点：▶ 使用naica® 微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因启动子甲基化水平进行量化。▶ 在产前暴露于500µg/kg PAHs的小鼠中，胰岛素编码基因启动子的甲基化水平显著升高。▶ 产前暴露于PAHs可能促进I型糖尿病的发病。作者使用8种PAHs的混合物进行了实验，以研究产前PAHs对成年期胰岛细胞功能和质量的影响，同时试图阐明 I型糖尿病发病的环境原因。他们分离了成年雄性小鼠的胰岛，对胰岛素编码基因的启动子DNA甲基化水平进行分析。研究成果：▲图1. 产前暴露于多环芳烃对成年雄性小鼠胰岛素编码基因甲基化水平的影响。(A) 数字PCR结果代表性一维图。(B)胰岛素编码基因启动子甲基化水平。(每个处理三只母鼠, 每只母鼠取一个雄性后代) 。在本研究中，子宫内暴露于500µg/kg PAHs的小鼠胰岛中胰岛素编码基因启动子中的DNA甲基化水平显著增加，同时胰岛素编码基因转录显著下调。▲图2. 不同PAHs浓度对胰岛素编码基因转录水平的影响原文链接如下：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651322005358期刊介绍：Ecotoxicology and Environmental Safety 1977创刊，隶属于爱思唯尔出版集团。是一份多学科交叉期刊，主要研究环境污染对包括人类健康在内的生物体的暴露和影响。最新影响因子为7.129。naica® 六通道数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

Naica高通量微滴芯片式数字PCR系统是实现DNA/RNA绝对定量的技术工具，自动生成和组装单层平铺的微滴，进行单分子PCR扩增，通过三色荧光通道检测，自动QC质控，识别三色荧光中有效的阴阳性微滴，从而达到目的DNA/RNA的绝对定量检测。同时提供原始数据、单微滴追溯等功能，确保数据真实可靠。¨ 只需一步加样操作，无需标准品和标准曲线是真正的绝对定量系统。通过对模板的有限稀释，耐受抑制剂能力强，更有利于临床、环境等复杂样本的检测。¨ 兼容高灵敏Sapphire芯片和高通量Opal芯片，实现样本通量灵活选择的同时，有效微滴数实现低浓度、低丰度的核酸样本进行准确定量。同时提供Pooling功能，轻松实现多孔合并分析，满足更高灵敏度和更高分辨力的实验要求。¨ 封闭式芯片设计，样本间独立，避免了加样交叉污染风险，同时防止扩增后的气溶胶污染，保证结果安全可靠和实验环境安全。Naica高通量微滴芯片式数字PCR系统的应用领域：¨ 液体活检¨ 肿瘤学研究¨ 精准医疗¨ 分子诊断¨ 感染疾病¨ 器官移植¨ 食品检测¨ 环境监测 Naica高通量微滴芯片式数字PCR系统可分析的实验类型： ¨ DNA/RNA绝对定量¨ CNV拷贝数变异¨ 稀有突变检测¨ 融合基因¨ 甲基化检测¨ 基因表达¨ microRNA表达 更多信息，可登陆：http://www.cycloudbio.com/或邮件至：info@cycloudbio.com； 关注“深蓝云生物科技”官方微信或者Gene-π数字PCR学堂 北京深蓝云生物科技有限公司 北京经济开发区科创四街25号院2号楼2单元2层电话：010-57256059 Email:info@cycloudbio.com 网址：www.cycloudbio.com 创新点：样本通量灵活：1-48个样品/次 高度自动化：只需一次加样，兼容多道移液器 成本更为经济：可实现7uL反应体系 高灵敏度、高分辨力：Pooling分析功能 多通道快速安全检测：样本独立且全封闭设计，2.5小时/次的三色通道检测 Naica高通量微滴芯片式数字PCR系统

自从引入联合抗逆转录病毒疗法 (ART) 以来，HIV-1感染已从一种致命疾病转变为一种可控制的慢性疾病。然而，虽然ART可有效抑制个体的病毒复制，但它并不能治愈HIV-1感染。这是由于患者体内存在一个潜伏病毒库（latent resservoir），其中包含一小部分具有复制能力的完整原病毒（约占1-5%），在ART停止后为病毒复制提供“燃料”。因此，科学家若想通过消除该病毒库达到HIV-1治愈的目的，就不得不对这些完整原病毒进行准确评估。但是，接受ART治疗的患者可能具有载量非常小的完整潜伏病毒库，在有限的血液采样中进行检测，可能会遗漏这些潜在储库。▲图源：网络（侵删）在过去的几年里，已经出现了几种基于PCR与二代测序 (NGS) 相结合来检测病毒库的方法。比如基于双重dPCR方法来量化HIV-1患者的完整原病毒，即IPDA（intact proviral DNA assay）方法，该方法通过双重实验检测HIV-1基因组中的PSI和ENV两个靶点。另一种常见方法是Q4PCR，其在HIV-1全长测序方案中引入了四重qPCR，在全长测序之前评估HIV-1基因组的完整性。尽管这些方法提高了检测灵敏度并且可以提供全长的 HIV-1序列，但其成本效益不高，需要多步人工操作且耗时较长。比利时根特大学、根特大学数字PCR联盟、艾滋病毒治疗研究中心等科学家近日在知名期刊《Methods》上发表了一篇HIV-1病毒库研究相关文献，文章对IPDA方法和Q4PCR方法进行集成，并在naica® 微滴芯片数字PCR系统进行验证，该方法增加了IPDA 方法检测HIV-1的靶点数量，提高了检测灵敏度，实现对潜伏病毒库的精准定量。研究方法：结合IPDA和Q4PCR方法，设计基于naica® 微滴芯片数字PCR系统的三重数字PCR实验。☑ PSI靶点-FAM蓝色探针标记☑ ENV靶点-HEX绿色探针标记☑ GAG靶点 & POL靶点-Cy5红色探针标记▲ 靶点对应的基因组位置图研究结果：☑ 使用J-Lat 8.4细胞系（每个细胞含有1拷贝的HIV-1基因组）进行单重实验，并测定naica® 微滴芯片数字PCR系统三重试验的性能，结果显示定量结果和理论值一致，重复性好；各靶标阴阳性微滴区分良好。▲ 对阳性对照J-Lat 8.4细胞的拷贝数进行量化-设定PSI、ENV、GAG/POL单重检测及IPDA和三重等多重实验，并对DNA剪切情况进行校正（DSI）☑ 使用naica® 微滴芯片数字PCR系统直接定量来自HIV-1患者的五个PBMC样本，这些样本病毒载量较低，且均经过ART治疗，检测结果显示5个患者均检出了HIV-1。此外，发现一个比较有趣的现象，在患者SLR_26样本中几乎没有检测到ENV且PSI也只有非常低的信号，该结果表明PSI和ENV序列中可能存在缺失或突变，如果只检测这两个靶点的话，该病人可能被判读为HIV-1阴性。幸运的是，使用naica® 微滴芯片数字PCR系统设计的三重实验，GAG或POL基因正常检出，表明该样本含有HIV-1。▲ 使用naica® 微滴芯片数字PCR系统对5个HIV-1病人的PBMC(每百万个)进行定量文章结论：通过naica® 微滴芯片数字PCR系统对HIV-1患者潜伏病毒库进行了量化，相较于传统方法增加了亚基因组区域的检测数量，提高了对潜伏病毒库的检测的灵敏度，降低结果误判的可能性，且该方法甚至可以在未来开发的5色或6色的数字PCR系统中进一步放大。原文链接如下：https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.05.006单位简介：根特大学（Ghent University），简称UGent，由荷兰国王威廉一世于1817年创办，迄今已有200多年历史，是比利时学术排名第一的世界顶尖研究型大学，一直以其极高的学术水平享誉全球，2020年世界大学学术排名中位列第66名，根特大学校友中诞生了4位诺贝尔奖得主。随着数字PCR技术的发展，根特大学已成立数字PCR联盟，该联盟致力于开发数字PCR检测和数据分析工具，同时该平台还会不定期举办数字PCR培训课程，帮助广大学子及专业人士更好的了解和应用数字PCR技术。naica® 微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司的naica® 微滴芯片数字PCR系统在进行核酸检测时具有独特的优势。该系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要2.5小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。

减数分裂通过产生单倍体细胞和基于同源重组（HR）产生的遗传变异来支持有性生殖。HR通过重组交换(CO)、同源染色体之间的联会，交换等来确保减数分裂染色体分离，同时保证遗传变异在育种过程中发挥作用。在植物中，同源重组可以通过几种技术检测到，例如通过减数分裂染色体分析进行细胞学检测，通过测序进行基因分型和分离群体中的分子标记或荧光标记株系（FTLs）。FTLs在拟南芥中是测量花粉或种子中减数分裂重组事件的有力工具。但FTLs不适用于作物，因为在基因组特别大的作物中产生FTLs既费力又昂贵。此外，不同的作物或某些基因型不适合遗传转化。作为替代，使用小孢子(四分体或花粉核)基因分型或测序用于直接检测减数分裂产物中减数分裂重组的结果。然而，作物小孢子的测序/基因分型相当昂贵，因此可以进行检测的数量有限，特别是对于大基因组物种如谷物。在受精前测量雄配子的减数分裂重组率有样本量大，分子标记分析独立和即时重组交换分析的优势，但配子DNA含量有限，测序/基因分型方法通常依赖于全基因组扩增(WGA)。而直接通过PCR反应分析单个配子进行基因分型也由于单倍体配子的低DNA含量无法达成。在大麦中，单花粉核基因分型是通过荧光激活细胞分选从种内杂种中分离出单个单倍体花粉核，然后进行WGA和多位点KASP基因分型或单细胞基因组测序完成的。单个单倍体花粉核的DNA有限，且WGA价格较高，导致分析样品的数量有限，无法完成高通量的分析。德国莱布尼茨植物遗传和作物植物研究所的科学家近日在《The Plant Journal》上发表了一篇减数分裂重组率测量的相关文献，该文章采用naica® 微滴芯片数字PCR系统对配子中减数分裂重组率进行测量，实现高通量和低成本的基因分型。使用基于naica® 微滴芯片数字PCR系统的基因分型分析，无需大量预先进行的WGA就可完成对大麦花粉细胞核中减数分裂重组率的高通量测量。在取得花粉后，将花粉中的花粉核取出，并通过流式进行纯化，将得到的花粉核加入naica® 微滴芯片数字PCR系统的Mix中进行检测，从而得到减数分裂重组率，通过对总共42，000个单个花粉核进行基因分型(每株分析多达4900个核)，在杂交植物中测量了两个着丝粒和两个远染色体间隔内的减数分裂重组率。花粉核中确定的重组频率与分离群体中的检测到的频率接近。▲ 图1：用naica® 微滴芯片数字PCR系统进行大麦单花粉核基因分型的工作流程。（a）杂交植物的花药；(b)通过使用不同筛孔大小的过滤器(100和20微米)在悬浮液中分离花粉和花粉核。(c)花粉核用碘化丙锭染色，并流式分选到数字PCR反应Mix中。(d)将25微升数字PCR反应Mix(包括分选的花粉核)装入sapphire芯片的四个腔室之一。(e)在Geode中进行液滴生成和热循环。(f)在热循环之后，在naica® Prism 3中扫描sapphire芯片，然后在Crystal Miner软件中进行数据分析该文章在进行花粉核减数分裂重组率的检测时采用双探针法，如前期可行性验证时检测的InDel3118和InDel3135之间的区间Id 3-1，用HEX标记Barke (B)等位基因特异性探针(绿色)，用FAM标记Morex (M)等位基因特异性探针(蓝色)(图2b)，研究者将来自亲本基因型的花粉核以1∶1的比例混合，同时也检测了Id 3-1杂合的杂交植物的花粉核。在亲本混合样本检测中，两种亲本基因型的液滴相等，两种标记显示相同的荧光(B的HEX或M的FAM)(图2b)。在杂交材料样本检测中下，预计会出现代表重组事件的不同液滴群，即同时显示两种颜色的液滴(InDel3118为HEX，InDel3135为FAM，反之亦然)(图2b)。在实际检测中发现，亲代基因型得到了数量大致相等的液滴，它们对两种标记物显示出相同的荧光(图2d，e，绿色和蓝色矩形)。在对杂交植物的花粉核的检测中，检测到具有两种颜色(HEX和FAM)的液滴，表明重组事件(图2e，红色矩形)。此外，可以区分只有一个标记成功扩增的液滴(图2d，e，簇I和iii)以及没有任何扩增的液滴(图2d，e，簇ii)。表明使用naica® 微滴芯片数字PCR系统对单个花粉核进行包裹和基因分型是完全可行的。▲ 图2。用naica® 微滴芯片数字PCR系统进行大麦花粉单核基因分型。(a)在大麦染色体1和3上定义四个染色体间隔的的InDel或单核苷酸多态性(SNP)标记。(b)以Id 3-1为例的基于naica® 微滴芯片数字PCR系统的花粉核基因分型分析:两种荧光探针的可能组合能够区分重组和非重组花粉核。（c）有效微滴阵列原始视图。每个腔室通常包含大约25000个稳定的有效液滴。在任何通道(FAM或HEX)中成功扩增的液滴是浅灰色的，而暗灰色的液滴是阴性的。(d，e)来自芯片室的基于naica® 微滴芯片数字PCR系统的花粉核基因分型数据，在软件中显示为来自以1:1比例混合的亲本基因型的花粉核的点图(d)和来自与Id 3-1杂合的杂交植物的花粉核的点图。(e)通过两个HEX标记的(绿色方框)或FAM标记的等位基因探针(蓝色方框)将两个非重组亲代群体检测为具有成功基因分型的微滴。在亲代基因型混合物(d)的点状图中以灰色框表示HEX和FAM双阳性微滴为假阳性+噪声。杂交植物中HEX和FAM双阳性微滴为包括假阳性和噪音在内的重组群体，显示为红色方框(e)。簇(I)和(iii)代表仅成功扩增一种标记的微滴naica® 微滴芯片数字PCR系统具有极高的分辨率，因此在那些成功扩增标记物的微滴中，也可以观察到微滴内的细胞核(图2c)，研究者通过对微滴包裹核的数量分析进一步优化实验，通过用热稳定的限制性酶预处理花粉核来提高基因分型的效率，且因为细胞核数量与单个包裹细胞核的微滴数量呈正相关，提出上样细胞核的最佳区间（不同物种的不同大小细胞核有差异）。本文基于2色探针进行检测是非常成功的，而进一步通过6色平台可以同时进行更多组基因分型检测，将获得多重基因分型数据，也可以对相同或不同染色体上的一个以上染色体间隔的重组率进行平行测量，或者对CO干扰强度/存在的测量。总的来说，基于naica® 微滴芯片数字PCR系统的单个大麦花粉核基因分型在种内杂种植物的规定染色体间隔内提供了可靠、快速和高精度的减数分裂重组测量。来自一系列具有不同细胞核和基因组大小的物种的细胞核的成功包裹表明，所提出的方法广泛适用于单个细胞核的基因分型。德国莱布尼茨植物遗传与作物研究所(IPK)的Stefan Heckmann教授和Yun-Jae Ahn博士也给我们在线分享了他们的研究成果，想要直观的去了解这篇文章的详细内容，请点击https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A进行观看哦。本文链接：https://doi: 10.1111/tpj.15305naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

维也纳兽医大学的研究者们进行了一项回顾性研究，用以评估马细小肝炎病毒EqPV-H在蒂勒氏病以外的组织病理学异常的马和驴肝脏中是否存在及其相关性，研究者们希望通过该研究确认新发现不久的EqPV-H是否会导致其他的肝脏疾病，并且通过EqPV-H的感染情况进一步分析EqPV-H病毒的感染模式。亮点：1.通过采用新技术的回顾性研究，对之前收集的样本进行分析，找到EqPV-H病毒可能与肿瘤性疾病存在关联。2. 凭借naica® 微滴芯片数字PCR系统的直接绝对定量和对抑制剂的高耐受性，快速、高效的进行拷贝数的检测，确定组织样本中的病毒含量。3.通过对不同部位病毒含量的检测进一步佐证了EqPV-H病毒的嗜肝性，以及其慢性感染的可能性。马细小肝炎病毒是什么？蒂勒氏病是一种与马相关的急性、爆发性肝坏死疾病，该疾病1918年在南非发现，后续也不断有马出现该病，且主要与马源性生物制品如马血浆、破伤风和肉毒中毒抗毒素的给药有关，因此推测该病应该与一种传染性的病原体相关，但一直没有找到该病原体。直到2018年，科学家在一匹接受破伤风抗毒素后死于蒂勒病的马的血清和肝脏样本中检测到一种未知病毒，新发现的病毒被命名为马细小病毒肝炎EqPV-H。通过对最近的蒂勒氏病例检测发现，该病毒在染病马匹中均存在。且该病毒具有嗜肝性，血清和肝中的病毒载量最高。其他方面的研究也支持了该病毒是蒂勒氏病的病原体的假说。本文则主要通过对之前的标本进行分析，探寻EqPV-H作为一种新发现的病毒，其是否还有一些其他的病理作用，是否与其他肝脏疾病相关？回顾性的EqPV-H检测结果如何？研究者们收集了各类因肝组织病理学异常的临床样本，将其分为7组，包括肿瘤疾病，炎症性疾病、肝硬化、循环障碍、毒性和肝代谢疾病、多种疾病（1-5组中2种以上的病理学特征）和正常肝组织。在这些收集到的92例肝脏样本中，只有2例发现了EqPV-H病毒，且两例均诊断为腹部肿瘤。但癌症与机会性感染的高易感性是相关的，因为肿瘤性疾病伴随的全身虚弱和免疫抑制可能促进EqPV-H继发感染，所以EqPV-H是否可能是马科动物原发性肝肿瘤发生的诱因，需要进一步的研究来评估。通过对这两例样本的进一步分析发现，在这匹马的脾脏组织（肿瘤转移部位）以及心脏和肺组织中也可以检测到非常低的EqPV-H。这与之前的研究相一致，肝脏中病毒载量最高，其他组织中含量较低但也可持续存在，这意味着该病毒可能存在慢性感染。进一步通过naica® 微滴芯片数字PCR系统对病毒的载量进行绝对定量分析，EqPV-H核酸阳性的两个肝脏样本，病毒载量分别为5×103和9.5×103GE/百万细胞，略低于其他研究中肝脏样本1.26×104GE/百万细胞到2.04×109GE/百万细胞的病毒载量，这可能是慢性感染的另一个迹象。▲ naica® 微滴芯片数字PCR系统检测肝脏1号和2号样本中EqPV-H和细胞校正基因TTC17绝对定量结果。由于这项研究是回顾性的，所有的组织样本在室温下被石蜡包埋1至17年，这可能会影响可检测病毒的数量。但仍然在其中2匹肿瘤性疾病的马样本中检测到EqPV-H病毒，这表明EqPV-H感染和肿瘤性疾病之间可能存在关联甚至相互作用。尽管这篇文章最终并未得出某种疾病与EqPV-H的确切关系，但是通过naica® 微滴芯片数字PCR系统这样的新技术和新发现的病毒EqPV-H对以前的样本进行回顾性研究，仍然发现了一些之前从未了解到的新内容，也为其他的研究提供了新的思路和方向。期刊《viruses》Viruses (ISSN 1999-4915) 是一个国际性开放获取期刊， 至今已被SCIE、PubMed 、Scopus等各类数据库索引，其最新影响因子为3.465。作为病毒学研究的高级论坛，该期刊旨在帮助研究人员细致的展示他们的前沿发现和观点，并使其迅速传播。naica® 微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司的naica® 微滴芯片数字PCR系统在进行核酸检测时具有独特的优势。该系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要2.5小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

导读在新型冠状病毒感染咳嗽的诊断与治疗专家共识（2023，46）中针对咳黄脓痰或外周血白细胞增高提示可能存在细菌感染，在2021年发表的95例COVID-19患者合并细菌及真菌感染的临床分析中，结果表明，COVID-19危重型患者易合并鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌等细菌和真菌的感染，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)属于肠杆菌科克雷伯菌属，是一类重要的医源性感染革兰氏阴性条件致病菌，对多数抗菌药物易产生耐药性，占临床分离菌的13%，成为仅次于大肠埃希菌 (19%)的院内感染第二大致病菌。上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国重实验室科学家基于naica® 微滴芯片数字PCR系统建立了肺炎克雷伯菌的数字PCR检测方法。数字PCR检测灵敏度最低检出限可达到3.37copies/μL；方法的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)均小于25%；本研究利用优化后的数字PCR方法共检测了28 株临床菌株，检测到14株为肺炎克雷伯菌，14株为其他种属，该方法特异性好、灵敏度高、准确度高，适合肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析，也为其他临床病原菌的分子检测提供了新的技术参考。应用亮点：▶ 数字PCR (digital PCR，dPCR)作为第3代 PCR技术，具有简便快速、灵敏度高、精确度高的特点，可检出微量的细菌核酸分子。▶ 与传统的qPCR 相比，dPCR不受扩增效率的影响，无需依赖扩增曲线、无需标准曲线即可进行绝对定量，同时对低浓度的核酸定量更加准确可靠。实验结果：１、通过数字PCR的检测范围和灵敏性实验得到，cdPCR样品后续可在S5&minus S9样本检测范围内进行。▲图１.数字PCR对不同稀释度标准品灵敏度测试结果。蓝色：阳性微滴；灰色：阴性微滴；NTC：阴性对照２、数字PCR与荧光定量PCR的检出范围和灵敏性实验，得到cdPCR对低浓度样品的检测更准确。此外，cdPCR的最低检出限(3.37copies/μL)，较qPCR (194.9 copies/μL) 有更高的检测灵敏度。▲图2: pUC57-16S的数字PCR (A)和荧光定量PCR (B)的标准曲线图 2B不同稀释倍数标准品检测的Ct值：S1：9.84；S2：12.89；S3：16.21；S4：19.74；S5：22.34；S6：25.69；S7：28.11；S8：32.56；S9：35.42３、同时对3株肺炎克雷伯菌和4株其他菌株进行特异性评估验证，cdPCR方法对肺炎克雷伯菌的特异性检测有效。4、利用cdPCR对28株临床菌株进行检测，有14株菌为肺炎克雷伯菌，14株为其他菌株，说明cdPCR具有临床菌株检测应用潜力。综上所述，本研究建立了检测肺炎克雷伯菌的数字PCR方法。与qPCR技术相比，cdPCR可以精准地对核酸进行绝对定量分析，检测下限低至单拷贝，不依赖于标准曲线， 具有较好的数据重现性，在稀有样品或痕量样品的检测方面具有独特的优势。因此，该方法为提高肺炎克雷伯菌的早期核酸检测提供了新方法，也为核酸绝对定量提供了新的数据支持。同时naica® 六通道数字PCR系统为新冠病毒合并细菌感染的多重检测提供可能。naica® 六通道数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

欧洲分子生物学实验室研究人员Moritz Kueblbeck, Andrea Callegari等在bioRxiv分享了一项基于CRISPR方法优化的技术文章，目的在于提升从基因编辑产生的细胞中筛选纯合子的效率。众所周知，使用CRISPR精确敲入 (knock-in) 外源性DNA后，产生的基因编辑克隆需要严格的筛选才能得到目的克隆（纯合子）。基于常规PCR和Southern Blot检测目的克隆的方法耗时长、需要大量劳动力。因此研究人员对传统方法进行了优化，采用荧光标记蛋白和naica数字PCR联合的方法，精准快速的实现了基因编辑后目的克隆的筛选，大大降低了检测的人力、物力、时间成本。亮点：☑ 采用数字PCR和荧光标记的方法，可以在基因组编辑的早期阶段进行检测，整个流程只需要大约3-4小时即可获得结果，能够及时停止“不理想”的编辑克隆的培养，节省人力物力成本。☑ 数字PCR方法只需要检测少量的细胞，相较于Southern Blot大大减少样本制备时间。☑ 基于naica® 微滴芯片数字PCR系统的多重检测能力和Crystal Miner软件的荧光补偿校正功能，能够快速、可靠的对CRISPR编辑细胞进行定量筛选检测。文章内容分享背景原理介绍：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），规律间隔成簇短回文重复序列，是一种RNA引导的基因组编辑技术,能对基因进行精确性敲除,敲入,替换等,从而实现探究基因功能,修复致病基因等目的。但是，CRISPR技术也会导致有潜在危险的“脱靶”问题，带来不可预测的基因变化，因此对于CRISPR基因编辑的脱靶情况需要灵敏且精准的验证及检测。▲CRISPR结构示意图研究目的：提升从基因编辑产生的细胞中筛选纯合子的效率。传统方法筛选目的克隆的局限性：基因编辑后，筛选纯合子的方法是生成杂合克隆后，通过轮次迭代产生纯合子，整个过程耗时甚至能长达一年，且容易发生脱靶修饰。使用常规PCR区分纯合克隆和杂合克隆的方法只能检测到目的基因，还需要金标准Southern Blot检测脱靶整合的情况，然而，Southern Blot是一种耗时且低通量的技术，需要相对大量的基因组DNA和细胞材料，这些材料的制备会浪费大量的时间和人力成本。优化后的新方法：针对上述问题，Moritz Kueblbeck等人优化了CRISPR的实验流程，改进了CRISPR的转染效率，通过添加荧光标签蛋白实现CRISPR编辑的克隆菌落中相关标记蛋白的正确亚细胞定位，并通过dPCR 来定量目的基因和脱靶基因组编辑事件。通过该方法，快速、可靠的对荧光标记CRISPR编辑细胞进行了定量筛选。【见下图】▲Moritz Kueblbeck等人优化的CRISPR纯合子筛选实验流程▲PCR进行两种细胞系中的标签基因检测。U2OS- TPR-SNAP标签基因整合总数检测 （左）；HK- Nup93-mEGFP标签基因整合总数及目的标签基因检测（右）。矩形图代表克隆，每个红点代表一次测量结果。对于多重荧光检测实验，进行荧光溢出的补偿校正是十分必要的。本研究使用naica® 微滴芯片数字PCR系统进行多重检测，并使用Crystal Miner软件进行荧光补偿校正分析，确保每一个荧光基团被单一检测通道捕获，得到的结果精准可靠。如想对荧光补偿校正有更多了解，请复制下方链接地址到浏览器进行查看：http://dx.doi.org/10.1016/j.bdq.2016.10.002原文链接如下：https://doi.org/10.1101/2021.06.23.449557CRISPR WEBIANR相关视频链接：▲点击上方图片观看相关视频naica® 微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司的naica® 微滴芯片数字PCR技术在进行核酸检测时具有独特的优势。系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的唯一耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要两个半小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。

法国Stilla Technologies公司邀请美国IDT公司共同开展的网络研讨会将于2021年2月4日（周四）北京时间00：00AM进行，来自美国IDT公司资深应用工程师Erik Wendlandt博士和来自法国Stilla Technologies公司高级应用科学家Kimberley Gutierrez博士将与我们在线分享“基于naica® 六色微滴芯片数字PCR系统高度多重实验设计和优化”的相关内容。主题：基于naica® 六色微滴芯片数字PCR系统高度多重实验设计和优化日期：2021年2月4日（周四）时间：北京时间00：00AM内容简介：本次研讨会探讨qPCR和dPCR实验中多重靶点同时检测，以最大限度地从有限生物样本中获得更多基因信息的潜力。我们将讨论荧光染料的选择，如何避免解决二聚体，并比较单重和多重数据，以达到实验的确证。对于更具挑战性的多重等位基因突变检测，我们还将介绍IDT Affinity Plus™ 的核酸探针的技术优势。研讨会将重点介绍使用法国Stilla® 公司最新产品naica® 六色微滴芯片式数字PCR系统进行多重数字PCR（dPCR，digital PCR）分析。naica® 六色微滴芯片式数字PCR系统可以提供完整的数字PCR解决方案，具有灵活的样本通量以及高灵敏度的靶标核酸检测和绝对定量。naica® 六色微滴芯片式数字PCR系统可在多达6色荧光通道中进行至少六重靶标基因定量检测，将多重数字PCR（dPC，digital PCR）检测提高到更高维度。我们还将展示更多基于naica® 六色微滴芯片式数字PCR系统的液体活检检测数据。主讲人介绍：Viviane Sternkopf博士（Stilla Technologies公司应用科学家）Viviane在格赖夫斯瓦尔德大学获得分子生物学博士学位。在超过10年的时间里，她作为分子生物学领域的主题专家和客户培训师，支持不同的分子诊断产品。Erik Wendlandt博士（美国IDT公司应用工程师）Erik Wendlandt博士是美国IDT资深现场应用工程师，致力于帮助科学家设计和解决qPCR和dPCR实验的问题。注册页面：注册方式：1）关注：“深蓝云生物科技”公众号，找到对应的研讨会新闻进行注册。 2）访问：“北京深蓝云生物科技” 网站----“新闻动态”栏目，找对应研讨会新闻注册。

对于珍贵的生物样本来说，使用有限的生物样本获取更多的数据结果，能够帮助科研学者和诊断人员获得更全面的信息，同时降低运行成本，提高工作效率。11月18日，法国Stilla Technologies公司将举办naica® 六色微滴芯片数字PCR系统线上Seminar，本次Seminar邀请了Eugène Marquis癌症中心学者分享数字PCR在肿瘤基因PIK3CA突变检测方面的研究进展，免疫表型中心学者进行数字PCR在表观遗传学和基因编辑领域的应用研究报告；同时，还将举办线上naica® 数字PCR实验培训，届时欢迎大家前来学习。【关于Stilla Technologies】法国Stilla Technologies是总部位于巴黎的欧洲生物创新技术公司，具有跨学科专业知识的全球团队，利用先进的微流体化学，分子生物学和计算机科学等技术，拥有80多项全球专利，致力于提供突破性且灵活的naica® 系统来加速下一代基因检测的开发。为全球的研究人员和临床医生提供高精度的遗传分析解决方案来改善健康状况。【关于深蓝云】北京深蓝云生物科技有限公司作为法国Stilla Technologies公司在中国的数字PCR技术示范与服务中心，在北京和苏州建有标准PCR实验室，致力于为用户提供新型生命科学研究仪器和分析产品以及优化的整体应用解决方案。深蓝云生物配备着专业的技术支持和应用支持，依托生命科学产品和解决方案，专注为用户提供分析产品和完善的售前咨询和售后服务。naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

导读尽管各国卫生系统发展迅速，但由病原菌引起的传染病仍然是人类健康的主要威胁之一。据报道，全世界每年有220多万人死于水传播大肠杆菌病原体。尽管大多数大肠菌群是无害的，但某些大肠杆菌的存在可能会导致甚至威胁到人类健康，例如，大肠杆菌O157:H7和其他产志贺毒素的大肠杆菌菌株（非O157 STEC）是食源性疾病的常见因素，可能对健康造成严重后果，尤其是对幼儿。因此，检测大肠杆菌对于生物医学应用以及食品、水和空气质量监测非常重要。大连理工大学环境科学与技术学院，工业生态学与环境工程教育部重点实验室的科学家，开发出基于naica® 全自动微滴芯片数字PCR系统的单细菌检测方法，该方法可以在1.5小时内以单细胞灵敏度选择性检测临床尿液样本中的大肠杆菌 。该方法发表在《Analytical Methods》，题为“Single bacteria detection by droplet DNAzyme-coupled rolling circle amplification”。应用亮点：▶ dDRCA系统，能够快速、选择性地检测具有单细胞敏感性的大肠杆菌 ，dDRCA系统的检测灵敏度比之前报道的PAD高1000倍。▶ 证明了dDRCA系统在尿路感染诊断中的潜在临床适用性，dDRCA能够在不到1.5小时内，从20份临床尿液样本中成功识别出5名UTI患者，而传统的基于培养的方法需要数小时。文中采用naica️® 全自动微滴芯片数字PCR系统液滴微流控技术，快速精准的检测到复杂样本和高背景样本中的致病大肠杆菌。通常扩增需要约4小时进行定量大肠杆菌检测。在这项研究中，我们描述了DNA酶偶联滚圈扩增（RCA），这是一种高效的等温酶DNA复制过程，可在naica️® 全自动微滴芯片数字PCR系统上进行，以建立液滴DNA酶偶联RCA（表示为dDRCA）系统。我们进一步证明，该系统能够在1.5小时内以单细胞敏感性选择性检测临床尿液样本中的大肠杆菌。▲图2（a）通过琼脂糖凝胶电泳分析RCA产物（RP）。（b） 反应混合物在指示反应条件下的荧光响应：+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (blue line) RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (green line) RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (red line) + RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (pink line)。（c） Naica Prism3阅读器图像（左）、CLSM图像（中）和荧光显微镜图像（右）为微晶芯片液滴的大小。比例尺：1.4 mm（左）和100 mm（中、右）。指示反应条件下dDRCA系统的荧光图像和荧光滴数：（d）+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli （e）-RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (f) -RFD-EC1/+ RDS/ E. coli (g) + RFD-EC1/+ RDS/ E. coli.使用Naica Prism3阅读器对生成的荧光液滴进行成像和分析。dDRCA系统能够在75分钟内选择性计数具有单细胞敏感性的大肠杆菌，包括20分钟的细胞裂解时间、12分钟的液滴生成时间和43分钟的液滴反应时间。通过比较其他三种常见细菌，包括枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、酸性乳片球菌（P.acidilactici）和唐菖蒲伯克霍尔德菌（B.gladioli）存在时的信号反应，也检查了dDRCA检测大肠杆菌的选择性。当用缓冲液或尿液中的这些意外靶点测试每个dDRCA系统时，未观察到明显的荧光液滴（图4c和S4†）。▲图4（a）不同大肠杆菌浓度（每毫升细胞数）下dDRCA反应的荧光图像。比例尺：1.4 mm。（b） 不同浓度下计数的液滴数与大肠杆菌之间的关系。提供了计数的液滴数量，插图显示了1–104大肠杆菌范围内的线性反应。误差条代表三个独立实验的标准偏差。（c） dDRCA的特异性。最终证明了dDRCA系统在尿路感染（UTI）诊断中的潜在临床适用性。分析了20份患者和健康献血者的临床尿样。整个操作程序包括：（1）细胞收集和裂解（25分钟）；（2） 液滴生成（12分钟）；（3） 液滴反应（43分钟）。如图5c所示，五个尿样，即ID 6、8、9、12和14，比其他尿样产生大量荧光液滴（3000）。使用传统的大肠杆菌培养方法进一步确认了这些有无大肠杆菌感染的样本（图5d）。因此，对UTI的诊断有很大的希望。▲图5（a）检测尿液样本中的大肠杆菌。（b） 显示尿液样本中计数数与大肠杆菌细胞在1-104范围内的线性相关性的曲线图。（c） 20份临床尿液样本中阳性液滴的数量。（d） CLED（胱氨酸、乳糖电解质缺乏）琼脂细菌尿液培养板。黄色菌落代表大肠杆菌在37℃的CLED琼脂中培养22小时后的生长。该系统能够在不到1.5小时的分析时间内，从20份临床尿液样本中成功识别出5名UTI患者，而传统的基于培养的方法需要数小时。原文：https://doi.org/10.1039/D2AY00656Anaica® 六通道数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

美国伯乐公司(Bio-Rad Laboratories Inc., 以下称Bio-Rad公司)上周四宣布它的微滴数字PCR产品，QX200TM Droplet DigitalTM PCR (ddPCRTM) 系统，获得欧盟体外诊断产品CE认证(CE IVD marking)，这也是欧盟体外诊断(in vitro diagnostic, IVD)领域首个获得CE认证的数字PCR系统。　　因为获得CE认证，欧盟的执业医师就能够使用这种QX200系统进行高准确地定性和电量检测核酸，从而有助于在治疗包括从癌症到移植排斥和病毒感染在内的疾病时作出临床决策。　　Bio-Rad公司数字生物学部门执行副总裁Annette Tumolo说，“作为一种诊断工具，我们的系统检测速度比较快，而且是有成本效益的，这就使得它很理想地将精准医疗的期望变成现实。”　　QX200 ddPCR系统将会快速影响癌症精准医疗的一个方面是液体活检(Liquid Biopsy)，即一种越来越流行的用于非侵入式检测肿瘤基因型、追踪治疗效果和预测癌症复发的技术。这种液体活检技术大有希望用于指导治疗决策。前瞻性试验当前正在开展以便评估液体活检技术在临床上的有效性，特别是，与微滴数字PCR和下一代测序技术结合使用在分析基因组变异上的实用性。　　自从2011年以来，微滴数字PCR技术仅供研究使用。这种技术将DNA或RNA样品划分为20,000个微滴，然后对每个微滴内的靶序列进行扩增，从而允许科学家们精确地定性和定量检测低浓度的靶DNA或RNA序列。它具有一系列重要的基因组应用，包括癌症突变检测、基因拷贝数确定、病毒载量监控和基因编辑检测。　　关于Bio-Rad公司　　Bio-Rad公司开发、制造和销售范围广泛的创新产品和用于生命科学研究和临床诊断市场的解决方案。该公司因对质量和顾客服务的承诺而在大学、研究所、医院、公共卫生和商业实验室以及生物技术、制药、食品安全行业闻名于世。创建于1952年的Bio-Rad公司总部位于美国加州赫苦斯市(Hercules, California)，通过它的全球运营网络给100,000多个研究领域和健康医疗领域的客户提供服务。该公司在全世界拥有7,700多名员工，2015年收入超过20亿美元。

导读中国疾病预防控制中心国家病毒病预防控制研究所和中国首都儿科研究所的科学家在Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology上发表了题为The Viral Load of Human Cytomegalovirus Infection in Children following Hematopoietic Stem Cell Transplant by Chip Digital PCR的文章。文中应用naica® 微滴芯片数字PCR系统建立了芯片数字PCR（cdPCR）方法，能够精准定量HSCT前后儿童HCMV感染的病毒载量。质粒pUC57-UL83的cdPCR检测限为103拷贝/ml，qPCR检测限为297拷贝/ml。cdPCR检测HCMV AD169毒株的结果为146拷贝/ml，表明cdPCR的灵敏度高于qPCR。人类巨细胞病毒（HCMV）是一种普遍存在的β-疱疹病毒，已感染发展中国家高达90%的人口。作为一种常见病原体，HCMV感染在免疫抑制个体中引起了显著的发病率和死亡率，特别是在接受了造血干细胞移植（HSCT）的患者中，原因是原发感染后潜伏感染的主要靶细胞是造血细胞。对于HSCT后的高危儿童，应在出现临床症状之前检测HCMV感染，因为HCMV病毒的载量及变化与HSCT儿童HCMV感染的发展和严重程度高度相关。因此，HCMV病毒载量的定量检测对患儿的治疗至关重要。应用亮点：▶ 使用naica® 微滴芯片数字PCR系统开发了一种快速、直观、简便和准确的检测HSCT前后儿童HCMV病毒的绝对定量方法。▶ 通过质粒和培养毒株验证naica® 微滴芯片数字PCR系统灵敏度、特异性和重复性。实验方法：作者从首都儿科研究所儿童医院收集了122名异体造血干细胞移植患儿、3名自体造血干细胞移植患儿样本（男/女:73/52），中位年龄7.5岁。该研究通过质粒和培养毒株验证naica® 微滴芯片数字PCR系统灵敏度、特异性和重复性均优于qPCR。在HSCT前后，通过qPCR和cdPCR检测所有供体和受体血清中的HCMV病毒载量。实验结果：作者通过含有pUC57-UL83基因的质粒DNA分别评估cdPCR和qPCR的动态范围。cdPCR的检测限 (LOD) 为103拷贝/ml (2.0拷贝/反应)，qPCR的LOD为297拷贝/ml。结果表明，cdPCR的灵敏度高于qPCR。为了评估cdPCR数据的重现性，作者使用质粒建立了HCMV DNA拷贝数的标准曲线。分析cdPCR检测的变异系数（CV、标准差/平均值）。结果表明，cdPCR检测具有良好的重复性（CVHCMV在125个HSCT患儿的检出率为30.40% (38/125)，HCMV病毒载量范围为107拷贝/ml-6600拷贝/ml。男性组的检出率为30.14% (22/73)，女性组的检出率为30.77% (16/52)。在0-12岁HSCT后HCMV阳性儿童中，HCMV的检出率为89.47% (34/38)。在0-6岁组中，男性的检出率为25.64% (10/39)，女性的检出率为22.58% (7/31)。在7-12岁组中，男性的检出率为39.29% (11/28)，女性的检出率为40% (6/15)。12岁以上患儿HCMV检出率为33.33% (4/12)，男性检出率为16.67% (1/6)，女性检出率为50% (3/6)。结果如表3所示。综上所述， cdPCR方法在HCMV检测领域比qPCR更敏感，能快速、直观、简便和准确的检测HSCT患儿HCMV感染率及病毒载量。参考文献：1.P. Griffiffiffiths, I. Baraniak, and M. Reeves, “,e pathogenesis of human cytomegalovirus,” Journal of Pathology, vol. 235, no. 2, pp. 288–297, 2015.2.L. Dupont and M. B. Reeves, “Cytomegalovirus latency and reactivation: recent insights into an age old problem,” Reviews in Medical Virology, vol. 26, no. 2, pp. 75–89, 2016.naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

导读西瓜 (Citrullus lanatus, 2n=22)是世界第三大水果，是世界各地种植的重要经济作物，也是一种受欢迎的新鲜水果，含有糖、番茄红素和瓜氨酸等有益人体健康的化合物。研究人员通过杂交开发了大量西瓜品种以满足消费者的偏好。但长期栽培和对果实品质性状的筛选，不同地理区域采集的栽培西瓜显示出较低的遗传多样性，因此需要更多的遗传种质资源用于可持续生产西瓜的创新品种。参考基因组对于性状和基因发现是必不可少的。西瓜基因组测序工作始于十几年前。除西瓜基因组初稿外，自2019年以来已经发布了三个高质量的西瓜参考基因组。然而，每个基因组仍然不完整，存在许多空白。高质量的参考基因组与从相同遗传库产生的突变体数据相结合，将有助于发现和分离遗传和育种所需的突变体。无缺口参考基因组是基因组组装的最终目标，为识别“暗物质”区域中的独特基因和结构变异带来了新的机会。北京大学高等农业科学研究所科研人员在Molecular Plant（最新JCR分区Q1，影响因子21.9496）上发表了题为《A telomere-to-telomere gap-free reference genome of watermelon and its mutation library provide important resources for gene discovery and breeding》的文章。研究者使用西瓜优良近交系G42组装了一个T2T（telomere-to-telomere）无缺口参考基因组，弥补了当前可用参考基因组中所有剩余的组装缺口。通过基因组信息比对识别了甜西瓜种质中一个包含ClTST2（液泡膜糖转运蛋白）基因的17.5 kb串联重复序列(sv04611)。该研究应用naica® 微滴芯片数字PCR系统对西瓜CITST2基因的拷贝数进行检测，证实了不同西瓜种质之间CITST2基因拷贝数存在差异，甜西瓜种质中CITST2基因的拷贝数增加可能是造成糖含量增加的原因。应用亮点：▶ 使用naica® 微滴芯片数字PCR系统对甜西瓜和不甜西瓜种质之间CITST2基因拷贝数的差异进行准确定量。▶ 甜西瓜和不甜西瓜种质中CITST2基因分别为两个拷贝和单个拷贝。▶ CITST2基因的拷贝数变异可能会改变西瓜糖含量。G42基因组组装比其他参考基因组组装具有更高的完整性和准确性，为更准确地描述基因结构变异（SVs）提供了更多的数据支撑。数字PCR技术已被证明可以灵敏可靠地检测拷贝数变异的核酸绝对定量工具。该研究采用naica® 微滴芯片数字PCR系统精确定量不同西瓜种质之间CITST2基因拷贝数的差异，验证了无缺口参考基因组识别SVs的准确性。研究成果：本研究成功组装出G42 西瓜的T2T无缺口参考参考基因组，包括所有22个端粒和11个着丝粒的信息。利用无缺口参考基因组数据，研究者识别了甜西瓜种质（97103和G42）sv04986结构中一个包含ClTST2基因的17.5 kb串联重复序列(sv04611)。这是不甜西瓜种质（PI 595203和PI 296341-FR）基因组中不存在的。ClTST2基因编码一种定位于液泡的糖转运蛋白，其表达与西瓜果肉中的糖积累呈正相关。▲图1. (A)sv04986 结构在甜西瓜（97103和 G42）和不甜西瓜（PI 595203和PI 296341-FR）种质中含有 ClTST2 基因。甜西瓜种质中存在一个17.5kb的串联重复序列sv04611，包含2bp的CA插入突变。红色箭头代表引物 ClTST2-R8/ClTST2-F3的位置。(B)使用ClTST2-R8/ ClTST2 -F3 引物扩增四个西瓜种质DNA 样本的结果。随后作者使用naica® 微滴芯片数字PCR系统对甜西瓜和非甜西瓜种质之间CITST2基因拷贝数的差异进行了准确定量。FAM通道仅能检测到存在CA插入突变的区域。HEX通道用于检测ClTST2基因。CY5通道检测的是西瓜中的单拷贝内参基因Actin。当CITST2基因为双拷贝时，FAM/HEX/CY5拷贝数比约为1:2:1。当CITST2基因为单拷贝时，FAM/HEX/CY5拷贝数比约为0:1:1。数据显示两个不甜西瓜的种质仅包含单拷贝CITST2基因，而甜西瓜种质在包含两个拷贝CITST2基因。▲表1.利用dPCR技术估算甜和不甜西瓜种质中CITST2基因拷贝数期刊介绍：Molecular Plant (《分子植物》)是由中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所（IPPE）与中国植物生理与植物分子生物学学会（CSPP）主办，中科院上海生命科学信息中心生命科学期刊社承办的学术期刊，创刊于2008年。2022最新JCR分区Q1，影响因子21.9496。

最近，人们发现新冠病毒SARS-CoV-2有可能在母婴之间进行垂直传播，而这种传播的后果，无论是胎儿还是新生儿，均尚不清楚。来自法国艾克斯-马赛大学的科学家在《Clinical Infectious Diseases》杂志上发表了一篇名为Congenital Infection of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 With Intrauterine Fetal Death: A Clinicopathological Study With Molecular Analysis 的文章，该文章是关于SARS-CoV- 2因母胎传播而继发胎死腹中并伴有先天性感染，胎盘和胎儿组织损伤的第一篇报道。文中采取个案研究的方式，来自于一个SARS-CoV-2孕中期先天性感染的病例。一名孕妇在SARS-CoV-2检测呈阳性后入院观察。随后检测到胎儿只有少量运动，羊水正常，胎盘形态正常。第二天，患者出现失血，胎儿运动减少。在超声检查中未发现胎儿心脏活动。在引产后，这对夫妇提出并同意了胎儿和胎盘的病理学检查。后续采用免疫化学，RT-qPCR和RT-dPCR对胎儿和胎盘进行病理学检查和SARS-CoV-2基因组变异分析。为了提高SARS-CoV-2基因组检测的灵敏度，文中作者采用naica® 微滴芯片数字PCR系统进行检测。在SARS-CoV-2病毒RNA的3个特异性区域设计引物和双标记探针：NI和N2为N基因，IP2为RdRP基因。均在FAM通道中检测荧光信号，可以提高检测的敏感性和特异性，在HEX通道中测量的人类基因被用作内部控制来验证样本的存在。▲利用RT-dPCR技术，从阳性对照(PAC)、固定肺组织和胎盘检测SARS-CoV-2病毒载量的2D微滴图。(A)HEX通道的阳性微滴检测内源性细胞。(B)FAM通道检测3个SARS-CoV-2靶点。(C)在FAM通道和HEX通道均可以检测到内源性细胞和SARS-CoV-2靶点。(D)阴性微滴通过临床病理学和分子水平的综合分析，结果表明：胎盘发生组织学病变，出现组织细胞间炎症和滋养层细胞坏死。胎儿表现出轻微的生长限制，出现肝细胞损伤和含铁血黄素沉着症，在胎儿组织中没有发现炎症细胞，在福尔马林固定胎盘、冷冻胎盘标本和胎儿肺和肝样品中均检测到SARS-CoV-2，在福尔马林固定胎盘组织中检测到最高的病毒载量。本案例中，SARS-CoV-2孕中期先天性感染，伴有子宫内胎儿死亡，继发于SARS-CoV-2感染的极度弥漫性胎盘损伤特征。母胎交换严重受损，导致胎儿缺氧伴心力衰竭和胎盘组织中高水平的病毒RNA。因此，在疑似SARS-CoV-2垂直传播的病例中，应考虑对孕妇进行产科急诊管理，特别是存在血小板减少症导致胎儿移动减少的情况下。原文链接：https://doi.org/10.1093/cid/ciab840

p 　　2018年12月1-4日第60届美国血液学年会(ASH)暨博览会在美国加州圣迭戈举行。每年的美国血液学年会是全世界血液学研究者的盛会。年会上公布和发表世界各国的最新血液学的研究进展。本次会议中的一些研究强调了微滴式数字PCR(ddPCR)灵敏度高和准确性高的特点，对微小残留病(MRD)的量化是一个强有力的工具，以下摘选了几个报告的重点内容： /p p 　　 span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 01 /strong /span /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong ddPCR应用于治疗TP53突变的MDS和AML的1b期临床试验 /strong /span /p p 　　佛罗里达州Moffitt肿瘤研究中心的血液肿瘤学家David Sallman博士介绍了一项临床试验的结果。Sallman博士及其团队研究了阿扎胞苷(一种化疗药物)与小分子药物APR-246的联合用于治疗具有TP53突变的骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓性白血病(AML)的患者。前期数据已经表明，单独使用阿扎胞苷可使20-30%的TP53突变的MDS和AML患者完全缓解。当加入小分子药物APR-246后，这些患者的完全缓解率达到了82%，这比单独使用阿扎胞苷具有更显著的疗效。研究人员使用NGS与ddPCR的方法量化MRD来分析缓解深度。Sallman博士说到“在我们的试验中，我们发现ddPCR在定量患者特异性缓解深度方面具有显著的效果”。 /p p 　　Sallman博士指出， strong 该临床试验的第2阶段将继续使用ddPCR作为确定缓解深度的方法之一 /strong ，也将会用于阿扎胞苷与APR-246联合治疗患者的预后评估。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/0b86573c-150f-4e86-891e-f3a3d57daf79.jpg" title=" 0001.jpg" alt=" 0001.jpg" width=" 600" height=" 400" border=" 0" vspace=" 0" style=" width: 600px height: 400px " / /p p 　　 span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 02 /strong /span /p p 　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 　ddPCR有助于预测AML患者的缓解 /span /strong /p p 　　同种异体造血干细胞移植(HSCT)是AML等血液系统恶性肿瘤的治愈方法之一。但是在移植后，许多患者会出现复发。科罗拉多大学和科罗拉多儿童医学的Amanda Winters博士和她团队利用ddPCR检测MRD以预测哪些患者可能在HSCT后会产生复发。虽然先前的实验已经证实MRD对化疗后的患者复发具有高度预测性，但很少有研究评估MRD在患者HSCT后复发的预测能力。 /p p 　　该团队使用ddPCR跟踪检测36名患者的21种AML相关突变，36名患者均接受了骨髓移植并同意组织样本库协议，在诊断时至少被检出具有21个突变中的一个。研究发现，基于ddPCR的MRD评估可预测AML患者HSCT后的复发和存活。移植后1个月时，MRD的存在与复发率和死亡率显著相关。基于这些发现，Winters博士和她的团队认为骨髓移植后利用ddPCR检测AML的相关突变可以帮助医生更早地发现疾病的复发。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/e7139e0a-eee4-4f70-80af-7eb27e207ab1.jpg" title=" 0002.jpg" alt=" 0002.jpg" / /p p 　　 span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 03 /strong /span /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong ddPCR定量MLL融合转录本监测MLL-r AML的MRD /strong /span /p p 　　 strong 目前实时定量PCR(RQ-PCR)是MLL重排(MLL-r)白血病患者MRD监测的标准方法 /strong 。然而，当 strong 只存在少量白血病细胞时，这种方法就显得不够精确了 /strong 。来自澳大利亚昆士兰大学的Sadia Afrin博士及其团队评估了使用 strong ddPCR定量MLL融合转录水平是否可以提高MLL-r白血病患者MRD检测的灵敏度。 /strong /p p 　　首先对44名MLL-r AML与ALL患者进行测序，确定每个患者特异性的融合序列，然后设计对应的融合检测探针用ddPCR进行MRD的评估，样本同时采用RQ-PCR的方法进行平行检测。将ddPCR与RQ-PCR检测的结果进行比较，遵循EuroMRD的指南。 /p p 　　结果显示ddPCR法表现出更高的检测灵敏度与可靠性，其中4个低于EuroMRD指南RQ-PCR检出阴性的样本均可用ddPCR检出，显示出ddPCR比标准的RQ-PCR法可提供更稳定且更高灵敏度的MRD分析结果。 /p p 　　Afrin博士认为ddPCR是一种很有前景的技术，可以准确、灵敏地定量MLL融合转录本，监测MLL-r白血病的MRD。ddPCR的高灵敏度和高稳定性可以改善基于反应的治疗分层以及预测复发。 /p

p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 数字PCR是一种用于绝对核酸定量检测方法，具有前所未有的准确度和精确度，是继实时荧光定量PCR技术之后的第三代核酸定量扩增检测技术，在液体活检、肿瘤伴随诊断、无创产前筛查、病原载量监测等方面具有重要应用前景，是科研和临床领域的平台级新技术。数字PCR市场主流产品主要为欧美跨国公司的高端仪器，在科研和临床的应用还比较初步。数字PCR的更广泛使用和临床应用，仍然存在几个主要挑战，包括降低成本，集成仪器平台和简化实验操作。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室杜文斌团队最近报道了一种可重复使用的微流体芯片，该芯片基于阶梯乳化（Step Emulsification）产生纳升液滴阵列，用于同时对8个样品进行片上多重荧光数字PCR。装置包含两块玻璃板，可实现预先填充矿物油的快速组装。通过由单个压力泵同时驱动8个样品通道的阶梯乳化，利用喷嘴阵列快速产生液滴，生成的液滴在U形腔室中可自组装成单层液滴阵列，每个腔室可容纳约10000个0.35 nL体积的微滴。系统采用的油相配方有效避免和消除了数字PCR温控过程中气泡的产生，在热循环期间不需要采用过压控制。团队将该芯片应用于临床样本HER2拷贝数变异的定量评估，验证了多重数字PCR性能，平行检测结果与美国赛默飞公司的QuantStudio 3D数字PCR仪一致，这对于乳腺癌的靶向治疗和预后具有重要临床应用价值。这种低成本、可重复使用且用户友好的设备可广泛应用于各种应用，在普通实验室仅需一台平板PCR仪和小型气压泵即可开展数字PCR扩增。芯片可在拆卸和简单清洁程序后重复使用50次以上，显著降低了单次数字PCR检测的耗材成本。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 上述研究结果于2019年1月4日在线发表于国际学术期刊Analytical Chemistry。博士生聂梦月为第一作者。该工作得到国家重点研发计划“战略性国际科技创新合作重点专项——人、畜传染性疾病预防监控技术”等项目的支持。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 杜文斌团队一直致力于国产化数字PCR技术的研制，探索低成本差异化创新策略。其主持的国家重点研发计划“新一代高通量数字PCR关键技术及应用研究”项目自2016年立项以来，自主开发了低成本界面振动乳化（Interfacial Emulsification）技术（Analytical Chemistry, 2017, 89, 745-750 & nbsp Analytical Chemistry, 2016, 88, 3171-3177），完成了一体化全自动数字PCR原理样机研发，取得了阶段性进展。所研发的样机可同时进行24个样品分析，纳升液滴制备、温控扩增及多通道荧光检测全自动完成，检测时间缩短至3小时。这一拥有自主知识产权的创新数字PCR系统，突破了现有仿制设备的局限，有望为低成本、高通量、易用型数字PCR技术的普及打开新的局面。 /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/c9d3bd3d-9003-4ffe-bfa9-fff1170094a4.jpg" title=" 1.jpg" / /p p style=" text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/87d41694-71f1-4ba6-ad0e-bcfddaf15107.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p

p 　　武汉大学中南医院的研究人员近日利用微滴式数字PCR（ddPCR）技术，开发出一种新型的HBV检测方法。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201804/insimg/2671838e-10bb-450d-a414-b1887c064247.jpg" title=" NewsDataAction-6.png" / /p p /p p 　　根据世界卫生组织的最新统计，全球约有2.57亿人感染乙型肝炎病毒（HBV）。慢性HBV感染会造成肝硬化和肝细胞癌（HCC）等严重健康问题。2015年，全球大约有88.7万人死于HBV感染所致的并发症。 /p p 　　大量研究表明，共价闭合环状DNA（cccDNA）是慢性乙肝持续感染的元凶。作为病毒复制的中介，其在宿主肝细胞内以微染色体的形式存在。不过，由于cccDNA在患者肝脏中的水平极低，传统的分子生物学方法（如Southern blot）很难检测。因此，目前急需一种更灵敏的检测手段。 /p p 　　武汉大学中南医院的研究人员近日利用微滴式数字PCR（ddPCR）技术，开发出一种新型的HBV检测方法。它的优势在于能够检测血清、单细胞和组织样本中的cccDNA。这项成果于4月12日发表在《The Journal of Molecular Diagnostics》上。 /p p 　　这项研究的负责人、武汉大学中南医院基因诊断中心主任刘松梅博士谈道：“肝细胞癌的发展与HBV密切相关。开发准确而灵敏的cccDNA检测方法具有重大的临床意义。通过这种方法，越来越多的慢性乙肝患者将有望采用精确的治疗方法来预防或延迟肝细胞癌的发生，而且可以在早期诊断癌症。” /p p 　　这种新型的检测方法使用了Bio-Rad的微滴式数字PCR技术。利用ddPCR方法，研究人员能够检测到血清、单细胞和FFPE肿瘤组织中的cccDNA。与Southern blot及其他方法相比，检测cccDNA的灵敏性提高。此外，传统方法通常需要侵入性检查，比如通过活检获取肝脏组织。 /p p 　　“与肝脏活检相比，血清可以通过非侵入性的方式获得，已经被广泛用于临床诊断。并且，血清中有着均匀的cccDNA分布，”刘松梅博士指出。“这种新的检测方法也提高了cccDNA的检测极限。” /p p 　　研究人员发现，68例HCC患者中近90%为cccDNA阳性，而79例非HCC患者中只有53%为cccDNA阳性。HCC患者血清中的cccDNA拷贝数也高于非HCC患者。 /p p 　　cccDNA和HBV DNA的联合分析能够将HCC患者与非患者区分开。“这暗示cccDNA是HCC的风险因素，”刘博士谈道。 /p p 　　此外，研究人员能够证实血清cccDNA水平与肝脏样本中测得的cccDNA水平呈正相关。 “血清cccDNA确实是一种比肝内cccDNA更好、更有用的诊断标记，”刘博士总结说。 /p p 　　最近，一些靶向cccDNA的新型抗病毒策略可以改善HBV清除率。 因此，准确而灵敏的cccDNA检测方法对肝细胞癌的预测和早期诊断，靶向治疗以及治疗效果的评估有重要的临床意义。 /p

导读Dravet综合征（Dravet）是一种严重的先天性发育遗传性癫痫，由SCN1A基因的新生突变引起。在约20%的患者中发现了SCN1A无义突变，并且在多个患者中鉴定出SCN1A R613X突变。以色列特拉维夫大学Sagol神经科学学院、赛克勒医学院人类分子遗传学和生物化学系、Goldschleger眼科研究所研究者在bioRxiv平台发表了题为《Heat-induced seizures, premature mortality, and hyperactivity in a novel Scn1a nonsense model for Dravet syndrome》的文章。作者构建了含有无义Scn1a突变的Dravet小鼠模型，该模型中杂合Scn1a R613X突变表现出自发性癫痫发作、对热诱导癫痫发作的易感性和过早死亡，概括了Dravet的核心癫痫表型。在该研究中，作者使用naica® 微滴芯片数字PCR系统进行了WT Scn1a和R613X mRNA等位基因特异性定量。应用亮点：▶ naica® 微滴芯片数字PCR系统精确量化了Dravet小鼠模型中WT Scn1a和R613X mRNA等位基因的含量。▶ 在杂合子动物中，naica® 微滴芯片数字PCR系统精准定量到稳定R613X转录水平为野生型的8.9±0.9%，表明突变等位基因的转录物在皮质组织中经历了无意义介导的RNA衰变(nonsense -mediated RNA decay, NMD)。这项研究为了定量评估皮质中R613X转录物的水平，使用naica® 微滴芯片数字PCR系统对WT Scn1a和R613X等位基因进行了特异性检测。研究结果：naica® 微滴芯片数字PCR系统在WT小鼠的皮质组织中未检测到R613X等位基因，证实了该方法的特异性（图A）。与WT皮质相比，在Scn1aWT/R613X组织中检测到WT等位基因的水平约为一半，这与杂合子动物的预期一致(图B)。在杂合子动物中，稳定的突变体R613X转录为8.9±0.9% (图C)，比预期的50%水平低得多，这表明突变等位基因的转录物在皮质组织中经历了强烈的无义介导的衰变(NMD)。▲图.Scn1aWT/R613X小鼠皮质中Scn1a mRNA表达降低。A. 来自WT小鼠的皮质组织显示没有可检测到的R613X等位基因转录物，证明该等位基因检测的特异性。B. 在Scn1aWT/R613X小鼠的皮质组织中，WT Scn1a等位基因为WT皮质中的48.8%。C. R613X与WT等位基因的比值显示Scn1aWT/R613X动物中Scn1a R613X等位基因的平均稳态水平为WT等位基因的8.9±0.9%。naica® 六通道数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

随着针对PI3K通路的新疗法的批准，PIK3CA突变的检测已成为HR+/HER2- 转移性乳腺癌 (MBC) 治疗管理的关键因素。法国雷恩第一大学尤金马奎斯癌症中心在《Scientific Reports》上发表了一篇文章，该文章采用naica® 微滴芯片数字PCR系统开发了多重PIK3CA突变检测技术。该技术可同时检测21种PIK3CA突变，并进行绝对定量，解决了当前对乳腺癌患者的21种PIK3CA致病突变进行快速、高灵敏、有效检测的难题。亮点1.在naica® 微滴芯片数字PCR平台，使用液体活检技术对21种PIK3CA突变进行定量检测。2. 通过对大量的肿瘤实体样本和cfDNA样本进行检测验证，获得了83.1%的一致性，确定了此方案的临床有效性。3.naica® 微滴芯片数字PCR系统检测方法的高灵敏度和稳定性，能够快速、经济、有效地对乳腺癌中最常见的PIK3CA致病突变进行绝对定量，覆盖率达90%。检测方式利用naica® 微滴芯片数字PCR系统(Stilla Technologies)，结合Drop-off检测方法，设计了一种可以同时检测21个PIK3CA突变的方法。在阳性分析案例中可精确识别PIK3CA突变。通过分析来自213个 HR+/HER2- MBC样本的血浆循环游离DNA (cfDNA) 以及从89名患者的97个可用匹配肿瘤中提取的DNA，确定了此方案的临床有效性，并在cfDNA分析和相应肿瘤样本分析之间获得了83.1% 的一致性。该技术采用两种Assay配合三步诊断策略（图1，图2），首先进行PIK3CA突变初步筛选，如果没有PIK3CA突变，则认为标本为阴性。在阳性结果的情况下，进行第二步检测集中于四种最常见的PIK3CA突变，并进行WT-MUT Duplex联合分析确定阳性突变位点。图1左：PIK3CA突变检测的两种多重检测方法设计图。(a) PIK3CA Assay n°1设计图:使用四对引物(灰色箭头)同时扩增N345K、C420R、 H1047L和H1047R。使用Drop-off方法检测542-546突变。(b) Drop-Off 542-546检测原理: WT序列由HEX标记的Drop-off探针和cy5标记的reference探针检测，产生一簇HEX-Cy5双阳性微滴(2D点图上为黄色簇) 而542 - 546密码子上带有突变(MUT，红色叉)的序列则无法与Drop-off探针结合，只和reference探针结合，生成单阳性微滴(2D点图上的红色簇) (c)PIK3CA Assay n°2设计图:使用两对引物同时扩增两个序列，使用FAM探针标记野生型(WT)序列，使用HEX探针标记E542K和E545K突变，使用FAM和Cy5探针标记H1047L突变，使用Cy5探针标记H1047R突变；图一右：三步诊断策略。图2：使用PIK3CA检测在患者cfDNA样本上鉴定PIK3CA突变示例。(a)四种最常见的PIK3CA 突变（E542K、E545K、H1047L和H1047R）的2D图结果，首先使用PIK3CA Assay n°1检测，各自的MAF为16.86%、4.17%、17.13%和1.97%。并使用PIK3CA Assay n°2确认，各自的MAF分别为17.40%、5.25%、19.55%和1.97%。(b)其他突变（N345K、C420R、Q546K、Q546P和Q546R）的2D图结果，首先使用PIK3CA Assay n°1检测，各自的MAF为4.00%、3.83%、35.02%、1.16%和39.2%，并使用WT-MUT Duplex方法确认，各自的MAF分别为6.99%、6.50%、36.84%、0.71%和43.89%。结果分析结果显示，213份血浆中68名患者(32%)至少有一种突变，这与文献中普遍报道的结果一致。有6例患者每个样本有2个突变，共发现74个突变。在本文的检测方法可能检测到的21个突变中，有9个在血浆样本中检测到（图3a、b）。此外,本方法检测的相对频率与COSMIC数据库中列出的频率相当一致，该方法能够快速、经济、有效地对乳腺癌中最常见的PIK3CA致病突变进行绝对定量，覆盖率达90%图3：213例HR + /HER2−转移性乳腺癌患者血浆中PIK3CA突变检测(a)在213例HR + /HER2−转移性乳腺癌患者中，PIK3CA检测发现9个PIK3CA突变阳性病例数。(b)确定的9个PIK3CA突变的相对频率。(c)突变在血浆中浓度（copies/ml）和MAF(%)分布 (5例以上的突变用箱线图表示，5例以下的突变用点表示，2例以上的突变用中位数线表示)。原文：https://doi.org/10.1038/s41598-021-96644-6｜欢迎试用｜naica️® 六色微滴芯片数字PCR系统开放试用，大家可以拨打电话010-57256059或者官网官微申请，诚挚邀请您到Stilla数字PCR中国技术示范与服务中心参观，期待与您相见。naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司naica® 六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

荷兰乌得勒支大学，荷兰鹿特丹伊拉斯谟癌症研究院，荷兰癌症研究院等科学家团队在《Genome Medicine》（2021年影响因子11.117）杂志上发表文章“Optimizing Nanopore sequencing-based detection of structural variants enables individualized circulating tumor DNA-based disease monitoring in cancer patients”，提供了一种即时的、高灵敏的个体化疾病监测解决方案，基于癌症基因组三代测序技术实现潜在SV标志物筛选，随后通过naica® 微滴芯片数字PCR系统绝对定量检测转移性前列腺癌患者血浆中ctDNA（循环肿瘤DNA）的SV标志物，并实现持续监测。通过实时监控SV的变化，来评价肿瘤治疗的动态反应。通过四个病例的特异性SV的数字PCR监测，表明SV动态变化与已有的肿瘤治疗反应标志物如PSA具相关性并能更早发现复发。应用亮点1.naica® 微滴芯片数字PCR系统能够用于血浆ctDNA中的特异性SV生物标志物的检测。2. naica® 微滴芯片数字PCR系统三色荧光通道同时检测SV结构变异，上游野生型和下游野生型三个靶标位点。3.naica® 微滴芯片数字PCR绝对定量患者SV标志物，适用于肿瘤治疗反应监测，更早提示复发。三通道数字PCR绝对定量检测血浆cfDNA中肿瘤特异性SV实验设计A、血浆cfDNA中肿瘤特异性SV的数字PCR绝对定量检测路线。B、三通道数字PCR的引物和探针设计检测。野生型上游和野生型下游等位基因与变异等位基因。设计了三个标记不同荧光染料的探针，特异性检测变异等位基因或野生型上游和下游等位基因。循环肿瘤DNA循环肿瘤DNA（ctDNA）：肿瘤细胞释放入血的游离DNA（cfDNA），大小约为160-180 bp。与正常的游离DNA（cfDNA）相比，ctDNA的不同之处在于携带肿瘤特异性的遗传学改变（SNV,CNV,Indel,SV），约占0.1-1%，ctDNA已被证明与肿瘤负荷呈正线性相关性。有多例病例报道，ctDNA在临床症状出现前几个月发现癌症复发，通过ctDNA的液体活检，有望监控肿瘤负荷，确定疗效和耐药性，检测微小残留病，并了解肿瘤异质性和克隆进化。结果与结论利用naica® 微滴芯片数字PCR系统进行4例前列腺癌患者两个时间点，即基线期和进展期时，血浆cfDNA中两个肿瘤特异性结构变异位点SV-A和SV-B的检测，VAF变异等位基因频率如图C，每mL血浆中变异等位基因拷贝数如图D。C、显示四例前列腺癌患者血浆ctDNA中SV-A和SV-B的VAF变异等位基因频率。D、显示四例前列腺癌患者每毫升血浆中SV-A和SV-B变异等位基因拷贝数。监测4名前列腺癌患者的血浆ctDNA中特异性SV变异水平，每个患者有两个SV，并与PSA和ALP等临床生物标志物进行比较。患者Pros1和Pros5的SV-A和SV-B的VAF监测结果显示与肿瘤负荷相关，患者Pros1和Pros4比PSA更早地提示疾病的进展。下图为患者Pros1血浆ctDNA中的SV持续监测结果。E、患者Pros1两种SV的VAF、治疗、实验室指标（前列腺特异性膜抗原（PSA）、碱性磷酸酶（ALP））和临床疾病进展（PD）。* Cabazitaxel：卡巴他赛，是一种紫杉烷类化疗药物，主要用于治疗激素难治性转移性前列腺癌。展望作者在文中表明：临床医生非常清楚癌症治疗方案动态监测的重要性，但缺乏即时监测肿瘤治疗反应的有效工具，因此尽管医生能够及时发现了病情变化并做出反应，但却为时已晚。本文提出了一种克服这些限制因素的新方法，并为即时个性化疾病监测提供解决方案。每个患者持续监测了两个SV，结果表明使用SV量化ctDNA以监测治疗反应具备潜在临床效用。这种方法可以提高疾病监测的敏感性，使其满足更智能治疗方法的要求。更多详情查看原文：DOI:10.1186/s13073-021-00899-7法国Stilla Technologies公司naica® 微滴芯片数字PCR系统，六色荧光通道，少量样本中获得更多生物信息，了解详情请点击：https://mp.weixin.qq.com/s/rVt1F50ILi3wFY9FdndyBwGenome Medicine影响因子：影响因子查询网址：https://www.iikx.com/sci/biology/18358.html

8月30日，罗氏诊断中国宣布，旗下新品Digital LightCycler数字PCR系统（以下简称“Digital LightCycler System”）正式在中国上市，实现了与全球同步首发。作为罗氏诊断分子检测领域的又一重磅产品，Digital LightCycler System作为新一代数字PCR系统，具有操作简便、通量高、速度快、通道全等特点，在肿瘤、感染性疾病、遗传性疾病等领域拥有广阔的应用前景。据悉，罗氏全球于8月23日正式推出Digital LightCycler System，并将于今年在全球15个国家和地区陆续推出，中国是首发市场之一。罗氏诊断中国副总裁-生命科学部袁健中先生罗氏诊断中国副总裁-生命科学部袁健中先生表示：“作为全球体外诊断领域的领导者，罗氏诊断始终致力于以创新和研发推动行业发展。在分子检测领域，我们积极推动布局，为生命科学研究、临床转化、分子诊断的发展提供强有力支持。希望随着Digital LightCycler System的推出，能进一步助力数字PCR技术在中国的临床应用，更好地满足临床和患者需求。”“新益求新”新一代PCR技术价值凸显聚合酶链式反应（PCR）自20世纪80年代问世至今，已成为生命科学领域最基础的分子生物学技术。作为突破性的“第三代PCR技术”，数字PCR凭借绝对定量、高灵敏度、高精准度，以及高效、方便等优势，被认为是撬动精准医学发展的新支点。尤其在临床检测方面，数字PCR在肿瘤个体化诊疗、感染性疾病等众多领域展现出丰富的应用前景。在肿瘤领域，以女性最常见的恶性肿瘤——乳腺癌为例，乳腺癌患者中20%-30%人表皮生长因子受体2（HER2）阳性，该类型乳腺癌具有恶性程度高、侵袭性强、预后差等特点。HER2状态是乳腺癌重要的预后评估指标和抗HER2治疗选择的主要预测指标。目前，HER2扩增检测方法对于乳腺癌初诊阴性，复发转移HER2阳性的患者，容易产生漏检，导致患者错过靶向治疗的最佳时机。而外周血HER2基因检测（dPCR法）作为一种辅助诊断方法，具有较高的检测准确度和精密度，其检测结果能准确地反映HER2状态，有效避免由于肿瘤异质性造成的组织漏检，可成为复发转移乳腺癌组织HER2检测的补充手段，以提高HER2状态检测的准确性，适用于乳腺癌患者的伴随诊断和动态监测。[1]在感染性疾病早期检测领域，数字PCR的技术优势也日益凸显。许多种类的细菌包括霍乱弧菌（引起霍乱的病原体），当暴露于不利环境时，会进入存活但不可培养（VBNC）状态。VBNC细胞的鉴定、检测，对于微生物学研究和疾病监测及控制都是非常重要的。微菌体系dPCR检测下限是qPCR的10倍，具有更高的准确性和灵敏度，还可适用于其他环境样本、临床样本以及耐药菌等领域 VBNC 的研究。同样在食源性致病微生物检测中，如引起胃肠炎疾病重要的致病菌副溶血性弧菌，dPCR技术也同样具有快速、精准度高以及特异性好等诸多优点。“利刃出鞘”助力数字PCR技术临床应用早在上世纪90年代，数字PCR检测及分析原理已经被提出。但受限于技术复杂、步骤繁琐、人工干扰等原因，数字PCR技术在很长一段时间发展停滞不前。随着近年来技术和工艺的积累发展，数字PCR才开始初露锋芒。然而当前大部分数字PCR产品仍停留在半自动化阶段，存在着成本高、通量有限、操作繁琐等不足，极大地限制了数字PCR技术的普及与应用。此次罗氏诊断推出的Digital LightCycler System在实验流程上具备高自动化的硬件设计，拥有6色荧光检测通道以及1通道的参比通道，针对通用检测、高灵敏度及高分辨率三种不同的应用需求，提供不同的纳米孔芯片选择，可将多至96个样本的实验速度提高至常规数字PCR的2倍。此外，该系统还具备绝对定量、插入或缺失、拷贝数变异等多种分析模式，可通过实验室信息系统（LIS），对样本进行信息自动化溯源，能够帮助实验室提升检测质量与效率。根据在肿瘤、感染性疾病等不同领域的应用场景，Digital LightCycler System可灵活切换不同灵敏度或分辨率方案，充分满足科研应用需求。创新驱动，卓引未来。Digital LightCycler System的上市，实现了中国与全球同步首发，这将进一步完善罗氏诊断在分子检测领域的布局，有望赋能科学研究及药物研发生产，加速数字PCR技术在更多应用场景的落地。未来，罗氏诊断也将持续推进前沿技术的探索和创新，助力分子检测领域的高质量发展，造福更多中国患者。*仅用于科学研究，不用于临床诊断*仅用于新品发布会宣传参考文献：[1] 卢仁泉等. 外周血HER2基因扩增检测（数字PCR法）在抗HER2治疗中的应用共识[J]. 中国癌症杂志, 2022, 32(1): 90-96.

2021年7月15日星期四（北京时间：11:00PM），德国莱布尼茨植物遗传与作物研究所(IPK)的Stefan Heckmann教授和Yun-Jae Ahn博士将在线分享：基于naica® 六色微滴芯片数字PCR系统无需全基因组扩增 (WGA)，高通量绝对定量检测大麦单花粉核减数分裂重组率”的研究。本次网络研讨会将讨论关于开发单个花粉核基因分型，实现数字PCR高通量绝对定量检测四个特定染色体间隔内的减数分裂重组率。主题：naica® 六色微滴芯片数字PCR系统高通量绝对定量检测大麦单花粉中核减数分裂重组率日期：2021年7月15日（周四）时间：北京时间11:00PM内容简介：植物育种利用减数分裂重组产生的新等位基因组合。在受精前直接测量配子中的减数分裂重组率，从单个个体中筛选出大量的样本，无需隔离种群分子标记分析，无需费时的细胞学观察的交叉互换（Cross Over）检测。目前由于花粉核DNA含量有限(～5 pg/单倍体细胞核），大麦花粉单核基因分型方案需要先进行全基因组扩增（WGA），再进行PCR分型或单细胞测序，从而限制了分析样本的数量。德国莱布尼茨植物遗传与作物研究所(IPK)科学家，基于Stilla® Technologies 公司的naica® 六色微滴芯片数字PCR系统，开发了一种单花粉核基因分型检测方法，在不进行WGA的情况下，以高通量测定四个特定染色体间隔内（两个着丝粒和两个远端）的减数分裂重组率。通过对花粉核的热稳定性限制性酶消化提高了基因分型检测的效率，完成了42,000多个花粉核进行了基因分型。杂交花粉核中测得的减数分裂重组率与隔离种群测得的重组率一致。基于naica® 六色微滴芯片数字PCR系统，通过多重分析可在两个染色体间隔同时检测，进一步提高了样本通量。该系统同时兼容基于多种不同核大小和DNA数量的农作物细胞核，证明基于naica® 六色微滴芯片数字PCR系统的单核基因分型检测方法具有广泛适用性。该成果“High-throughput measuring of meiotic recombination rates in barley pollen nuclei using Crystal Digital PCR™ ”已发表于The Plant Journal ( IF 6.417 ) PubDate : 2021-05-05 ,DOI: 10.1111/tpj.15305主讲人：Evi Lianidou博士（雅典大学分析化学和临床化学）德国莱布尼茨植物遗传与作物研究所(IPK)，隶属于德国莱布尼茨科学联合会，坐落于德国Gatersleben，研究定位以作物为主要对象，研究野生和栽培植物的遗传多样性，并利用这些材料，开展具有原创性的科学发现和技术创新，并实现农作物的分子改良。经过长达70多年的收集，保存了151,000多份不同作物的种质资源，是欧洲最大的种质资源收集与保藏中心，为IPK和世界相关研究人员研究作物基因和基因组演变、发展和表达规律提供了独一无二的研究材料。注册页面：注册链接：https://u9cm7yjb.pages.infusionsoft.net/