小鼠感染的细胞

小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法！海马体主要负责记忆和学习，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起，由细胞体和细胞突起构成。小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。为了更好的服务于广大科研工作者，百欧博伟生物技术人员特提供了海马神经元细胞分离培养方法，技术因人而异仅供参考：1、试验所需仪器设备及试剂（1）仪器生物安全柜CO2细胞培养箱荧光倒置显微镜高速冷冻离心机电热恒温鼓风干燥箱（2）试剂耗材T25细胞培养瓶血球计数板细胞培养孔板红细胞裂解液神经元完全培养基0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）多聚甲醛（PFA）DAPITriton X-100山羊血清NSEGoat anti-Rabbit lgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594Fluoromount-G荧光封片剂2、分离培养方法1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，2) 在冰浴的PBS中分离海马，PBS洗涤3次，剪碎，3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，4) 用FBS终止消化，轻轻吹打，5) 过100 μm 滤网，6) 收集滤液，300 g离心5 min，7) 用完全培养基重悬沉淀，铺瓶。3、免疫荧光3.1.实验步骤（1）细胞爬片取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。（2）固定细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。（3）破膜封闭将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。（4）一抗孵育一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）（5）二抗孵育室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。（6）包埋玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。鉴定细胞为P1代细胞3.2.检测结果（1）细胞免疫荧光鉴定照片阴性100X-DAPINSE100X-DAPI（2）检验基本情况：经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达到90%以上。除了上述的细胞分离方法以外，百欧博伟还有很多关于其他细胞的分离方法，想要学习的小伙伴可以来百欧博伟进行现场学习，如果想要其他原代分离培养方法，可打电话或咨询相关技术人员哦。

NK细胞（自然杀伤细胞）在机体抵御癌症和多种感染性疾病上扮演着重要的角色，近日，一项刊登在国际杂志The Journal of Immunology上的研究报告中，来自瑞典隆德大学等机构的科学家们通过研究绘制出了这些来自于骨髓造血干细胞中的超级细胞成熟过程的不同阶段以及其被调节的分子机制，相关研究对于开发抵御癌症的新型免疫疗法至关重要。在机体免疫系统中，NK细胞是机体防御机能的前线细胞，其能够识别并且杀死癌细胞及被病毒所感染的细胞；由于其具有重要的功能，目前很多研究都重点调查如何利用NK细胞来开发抵御癌症的新型免疫疗法；机体免疫系统中的两个主要角色：T淋巴细胞和B淋巴细胞都来自造血干细胞，而且科学家们对其也进行了大量研究，而对于NK细胞的成熟过程却研究甚少。研究者Ewa Sitnicka教授说道，为了能够在细胞疗法中充分利用NK细胞的特性，我们首先就需要理解NK细胞产生的机制，通过绘制出其从造血干细胞开始产生成熟的不同过程以及调节机制，或许就能帮助研究人员更好地控制NK细胞的发育以及功能，这项研究中，研究人员还阐明了干细胞分化以及产生不同类型淋巴细胞的机制。对于NK细胞功能和成熟至关重要的信号通路Notch蛋白属于高度保守的信号沟通系统中的一类受体家族，Notch信号能够控制动物和人类机体中细胞的发育工程。文章中，研究热源调查了当通过Notch蛋白激活产生的信号通路被关闭后所发生的状况，研究者指出，Notch信号通路对于NK细胞的发育以及正常功能的维持至关重要，当研究人员对小鼠机体血细胞中处于失活状态的Notch功能进行研究时，他们发现，NK细胞的数量和功能都会被影响。研究者Ewa Sitnicka解释道，如果没有Notch信号通路，NK细胞就不会正常成熟，而且其数量也会下降，这对于NK细胞有效抵御癌症和感染性疾病具有重要的意义；后期研究人员还将通过更为深入的研究来理解如何产生正常功能的NK细胞来用作癌症免疫治疗。

2022年5月4日，北京大学生命科学学院、生命联合中心邓宏魁课题组与李程课题组、北京大学医学部基础医学院徐君课题组在Cell Research杂志上发表了题为“Derivation of totipotent-like stem cells with blastocyst-like structure forming potential”的研究论文。该研究通过化学小分子筛选组合，建立了一个新的全能性干细胞培养条件，可以支持从小鼠二细胞胚胎及扩展型多能干细胞（EPS细胞）建立全能性干细胞系。这种新型全能性干细胞可在体外长期稳定培养，在分子特征和发育潜能上与小鼠二细胞胚胎高度相似，并且可以在体外被诱导形成在转录组水平上类似于体内囊胚的类囊胚结构。从左到右分别是李程、邓宏魁和徐君（来源：北京大学官网）如何在体外制备全能性干细胞，长期以来一直是干细胞领域的重要科学问题。在小鼠中，只有受精卵及二细胞胚胎具有全能性：单个细胞能够形成一个完整生命个体。随后发育形成的囊胚细胞可以被用于建立多潜能干细胞，滋养层干细胞及原始内胚层干细胞。然而，这些干细胞的发育潜能是受限的，无法同时发育到胚内和胚外组织。近年的研究发现：在小鼠多能干细胞群中存在极少量的表达小鼠二细胞胚胎分子标记MERVL的细胞，被称为二细胞样细胞（2-cell like cells），具有二细胞胚胎的部分分子特征(1)。然而，这种细胞无法在体外进行稳定的培养。此外，最近的研究发现，二细胞样细胞与体内二细胞胚胎仍存在较大差异，作为体外研究全能性的模型仍存在较大局限性（2）。北京大学邓宏魁团队长期以来致力于采用化学小分子调控的手段来建立调控干细胞的发育潜能的新方法（3-6）。2017年邓宏魁团队报道了一个新的小分子组合（LCDM），可以在人和小鼠中建立扩展型多能干细胞（EPS细胞）（4）。EPS细胞具有胚内胚外发育潜能，并且可以被诱导形成类囊胚（Blastoid）结构（7）。然而，与小鼠二细胞胚胎相比，这种细胞的分子特征与二细胞胚胎还有较大差异，细胞的胚外分化潜能也存在局限性，诱导获得的类囊胚结构中存在较高比例的中间态和中胚层样细胞（8）。最近北京大学杜鹏团队、中山大学王继厂团队等报道了全能性干细胞的诱导条件（9-10）。当前，如何直接自小鼠全能性胚胎建立全能性干细胞，仍是全能性干细胞研究的“金标准”。在本研究中，团队通过化学小分子高通量筛选，鉴定了能够在EPS细胞中诱导提高MERVL及Zscan4阳性细胞比例的化学小分子。通过进一步的组合优化，发现了一个可以将EPS细胞诱导为全能性干细胞的小分子组合CD1530，VPA，EPZ004777，CHIR 99021 (CPEC组合)，诱导获得的全能性干细胞能长期稳定地在体外培养。更为重要的是，CPEC组合可以在体外支持从小鼠二细胞胚胎直接建立全能性干细胞系。研究者将由CPEC组合支持建立的全能性干细胞命名为全能潜能干细胞（totipotent potential stem cells, TPS细胞）。研究者进一步从转录组、表观特征、嵌合能力等多个方面深入分析了TPS细胞的分子特征和发育潜能。他们发现TPS细胞在单细胞水平上表达大量的全能性特征基因，并且下调了多能性的分子标记。进一步的单细胞转录组分析发现，TPS细胞群中存在一个在转录组水平与中期二细胞胚胎高度相似的细胞亚群（约10%）。他们定量分析了TPS细胞、杜鹏团队报道的TBLC中的全能干细胞亚群、二细胞样细胞与二细胞胚胎的转录组相似度，发现TPS细胞中的全能干细胞亚群与二细胞胚胎的相似程度是最高的。ATAC-seq和全基因组甲基化分析也表明：TPS细胞具备了二细胞胚胎的表观修饰特征。在发育潜能分析方面，他们通过在不同发育阶段的单细胞嵌合实验证明了：单个TPS细胞具备了同时向胚内和胚外发育的能力。为了严格证明TPS细胞在体内的胚外发育潜能，他们对E17.5的嵌合胎盘进行了单细胞转录组分析，结果表明TPS来源的细胞可以分化形成多种胚外滋养层细胞类型。并且，他们发现tdTomato标记的TPS细胞与有GFP标记的受体胚胎形成的嵌合胎盘中，存在大量的tdTomato单阳性嵌合细胞，高表达滋养层细胞的分子标记，排除了由细胞融合导致的假阳性可能。这些结果表明了TPS细胞具备了与二细胞胚胎相似的分子特征和发育潜能。自组装形成类囊胚结构的能力是评估细胞全能性最为关键的功能性标准之一。研究者证明了通过调控早期胚胎发育的信号通路，可诱导TPS细胞高效形成类囊胚结构。单细胞转录组分析表明，TPS诱导的类囊胚结构中存在与小鼠E4.5囊胚中类似的上胚层、滋养外胚层、原始内胚层细胞，并且在转录组水平上高度相似。通过转录组数据的定量分析，研究者进一步比较了TPS-类囊胚结构中的滋养层细胞、小鼠滋养层干细胞/多能干细胞组合诱导类囊胚中的滋养层细胞，发现TPS-类囊胚结构中的滋养层细胞更类似于着床前囊胚中的小鼠滋养外胚层细胞。并且，不同于EPS细胞诱导的类囊胚结构，TPS-类囊胚结构中并不存在大量的中间态细胞及中胚层样细胞。将TPS来源的类囊胚结构植入体内后，可以诱导蜕膜化反应，但是仍无法像正常囊胚那样发育成个体，提示诱导类囊胚的方案仍需优化。最后，研究者分析了CPEC组合在TPS细胞中诱导和调控全能性的分子机制。他们发现抑制HDAC1/2和Dot1L的活性、以及特异激活RARγ通路，对TPS细胞的诱导和维持具有重要作用。有趣的是，当用CPEC组合的小分子联合处理小鼠二细胞胚胎时，他们发现这些小分子处理能在一定程度上帮助维持小鼠胚胎中的全能性分子标记的表达。这些结果表明HDAC1/2、Dot1L、RARγ通路的协同调控对于小鼠全能性调控的重要作用。综上所述，该研究利用化学调控的方法从小鼠二细胞胚胎中建立了新型的全能性干细胞，该细胞具有与二细胞胚胎相似的分子特征及双向发育潜能，能够形成与体内着床前囊胚更相似的类囊胚结构。这一工作不仅为体外研究全能性提供了更为合适和可靠的模型，而且朝着在不同哺乳动物物种中利用全能性胚胎捕捉、维持全能性干细胞的目标迈出了重要的一步。邓宏魁教授，李程研究员，徐君研究员是这一研究成果的共同通讯作者。北京大学徐亚星，赵晶薷，任奕璇，王旭阳和吕钰麟为该研究成果的第一作者。本工作获得了生命科学联合中心、国家重点研发计划项目、国家自然科学基金等支持。