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293T/17(人胚肾细胞)293T/17(人胚肾细胞)培养条件:DMEM(PM150210)+10% FBS (164210-500)+1% P/S (PB180120)由衷地感谢您对我们公司的信任与支持! [img=,557,423]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707311556_01_3250905_3.png[/img]注意事项:1、首先,观察细胞培养瓶是否完好,培养液是否有漏液、浑浊等现象。若有,请拍照,并及时与技术支持联系(所拍照片将作为后续服务依据)。2、用75%酒精擦拭细胞培养瓶表面,显微镜下观察细胞状态。因运输问题,部分贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落;先不要打开培养瓶盖,将细胞置于细胞培养箱内静置培养2-4小时,以便稳定细胞状态。3、仔细阅读细胞说明书,了解细胞相关信息,如贴壁特性(贴壁/悬浮)、细胞形态、所用基础培养基、血清比例、所需细胞因子、传代比例、换液频率等。4、静置完成后,取出细胞培养瓶,镜检、拍照,记录细胞状态(所拍照片将作为后续服务依据);建议细胞传代培养后,定期拍照、记录细胞生长状态。5、贴壁细胞:若细胞生长密度超过80%,可正常传代;若未超过80%,移除细胞培养瓶内培养基,预留5ml左右继续培养,直至细胞密度达80%左右再进行传代操作,瓶盖可稍微拧松。6、悬浮细胞:将细胞培养瓶内液体全部转移至50ml无菌离心管内,1200rpm离心5min,离心后上清培养基可收集备用,管底细胞沉淀加入5ml培养基吹打、重悬。镜检时,若细胞密度超过80%,可将细胞悬液分至2个细胞培养瓶内培养,补加培养基至5ml;若细胞密度未超过80%,将细胞悬液移至原瓶继续培养,直至细胞密度达80%左右时再进行传代操作。 [img=,557,425]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707311556_02_3250905_3.png[/img]温馨提醒:1、可将培养瓶内多余的培养基转移至50ml无菌离心管中,备用;细胞首次传代时,可以将该培养基按照一定比例和客户自备的培养基混合使用,让细胞逐渐适应培养条件。2、确认细胞状态良好后,应及时将部分细胞冻存,再进行后续的实验,避免后期实验失误可能发生细胞污染或死亡而导致的细胞丢失,影响后续实验。3、建议客户收到细胞后前3天,100X、200X、400X各拍3张细胞照片,记录细胞状态,便于后续和技术支持沟通交流。 更多咨询中国微生物菌种查询网 网址:www.biobw.org
TAG: ips 冈野荣之 干细胞 绒猴 http://img.antpedia.com/attachments/2010/12/27501_201012101146281.jpg 据物理学家组织网12月8日报道,日本研究人员称,他们利用诱导多功能干细胞(iPS)使一只瘫痪小猴的运动能力恢复到接近正常水平,这只小猴因为脖子以下脊椎受伤而不能正常运动。 日本东京庆应义塾大学冈野荣之教授称,这是世界上第一个在小型灵长类动物身上用干细胞修复脊椎损伤的例子。此前,他和研究小组曾用相似方法,帮一只小鼠恢复了运动能力。 研究人员移植了四种基因到人体皮肤细胞,生成诱导多功能干细胞,然后再把诱导多功能干细胞注射到一只瘫痪的绒猴(美洲产小型长尾猴)体内。冈野荣之说,考虑到治疗最佳时机,研究人员在绒猴受伤后第九天进行了注射,这是最有效的时机。在随后的两到三周内,绒猴开始活动它的四肢。“6周以后,它恢复到了又能到处蹦跳的水平,这已经非常接近于正常水平。它用前肢抓住物体的力量也恢复到了80%。” 但冈野荣之说,虽然用人类胚胎干细胞作为治疗癌症和其他疾病具有很大潜力,但要取得能发育成几乎所有组织的细胞,就要破坏人类胚胎,因此胚胎干细胞研究面临诸多争议,并受到宗教保守人士的反对。而日本研究人员的新研究为在人类身上使用类似医疗技术开拓了道路。
虽然经过几个世纪的研究,人类的生长于发育过程中仍遗留有很多的未解之谜。人类胚胎发育的研究始于20世纪,一般以观察胚胎的组织图像的方式来研究如器官发生的机制等,传统的方式如切片一直使用至今。现今,对于胚胎3D图像的数字化构建也已经开始,使用核磁共振、X光摄影等方法均可获得胚胎的3D图像,但分辨率仍无法达到细胞水平。本研究使用了妊娠期6-14周的胚胎和胎儿共36个,结合免疫染色、3DISCO组织透明技术和光片照明技术,获得了人类胚胎细胞级分辨率的3D图像,清晰地显示了胚胎的外周神经、肌肉、血管、心、肺和泌尿系统。通过这种方法,我们可以建立人类生长发育的图库,研究人类胚胎发育的分子机制。[b]3D图像示例:1) 周围神经系统3D成像(使用中间纤维外周蛋白(Prph)的抗体标记Prph): [/b][align=center][img=,450,317]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/2.jpg[/img] [/align][align=center](A)7周龄胚胎的表面造影图像(左);对Prph进行标记所得图像。[/align][align=center](B)8周龄胚胎的表面造影图像(灰色)和标记Prph所得图像(绿色)的叠加图像。[/align][align=center](C)8周龄胚胎的面部神经分布。表面造影图像和标记Prph所得图像的叠加(中)(右)。 [/align][align=center]感觉神经轴突和运动神经轴突在手脚的分布:分别使用胆碱乙酰转移酶(ChAT)和瞬态粘附糖蛋白-1(Tag-1)的抗体来标记。[/align][align=center](D)在外周神经,染色产生重叠现象,但在末端Tag-1(绿色)更为明显。(D-F)ChAT染色与Prph和Tag-1均无重叠。 [/align][align=center][img=,550,177]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/3.jpg[/img] [/align][align=center](D)9.5周龄的拇指,标记Prph和Tag-1。染色发生重叠,但在末端区域Tag-1更显著。[/align][align=center](E)9.5周龄的左手,ChAT与Prph表达区域不同。[/align][align=center](F)9周龄的右脚,ChAT与Tag-1表达区域不同。 [/align][align=center] [img=,550,177]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/4.jpg[/img][/align][align=center](G)7周龄的头部,标记Prph显示颅神经。(右)对颅神经分布使用Imaris软件进行3D虚拟解剖、区分并着色。 [/align][b]2) 手足的神经分布的3D成像:对Prph和Tag-1进行免疫染色以建立胚胎和胎儿手部的感觉神经及其分支的3D图像,并可观察感觉神经随时间推移的发育情况。 [/b] [align=center] [img=,450,362]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/5-1.jpg[/img][/align][align=center](A)8周龄标记Prph的右手,感觉神经分为尺骨神经、正中神经和桡神经。[/align][align=center](B)右手从7周龄到11周龄的神经分布随时间的变化。肌皮神经(指针处)很快便延长深入手部。 [/align][align=center] 之后分别对ChAT和Tag-1标记,建立了运动和感觉神经的分布的图像,以确定两种神经在何处以何种方式分离。 [/align][align=center][img=,550,286]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/5-2.jpg[/img] [/align][align=center](C)(D)9周龄的右脚和8周龄的左手的感觉神经和运动神经的3D图像。 [/align][b]3) 对肌肉生长进行3D成像分析:[/b]转录因子Pax7是有颌下门动物的肌肉干细胞标记物,是肌肉生成的关键启动因子。在肌肉的生长中,表达Pax7的细胞均匀分布于生长中的肌肉,表达肌细胞生成素(Myog)的细胞成簇分布于运动神经末端。生长中的肌肉表达了双皮质素(Dcx),可能影响神经肌肉接点的发育。 [align=center][img=,550,259]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/7-1.jpg[/img] [/align][align=center](A)9.5周龄标记Pax7的右脚和右手。[/align][align=center](B)10.5周龄标记Pax7与ChAT的右脚。[/align][align=center](C)9周龄标记Myog、ChAT和Tag-1的右脚。[/align][align=center]表达Myog的细胞成簇分布于运动神经分支末端。[/align][align=center](D)9.5周龄的左脚标记Dcx与ChAT。[/align][align=center]Dcx在肌肉(*号)和感觉神经中检测到,但在运动神经轴突中未检测到。 [/align][align=center] [img=,450,334]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/7-2.jpg[/img][/align][align=center](E)8周龄标记MHC与Tag-1的胚胎。[/align][align=center](中上)动眼肌肉的图像。[/align][align=center]点状线标示出了肌肉的分界线,此处照明被色素上皮所减弱。[/align][align=center](中下)肌肉与感觉神经。(右)左臂的肌肉与感觉神经。[/align][align=center](F)9.5周龄标记MHC与ChAT的左手,显示了肌肉与运动神经。[/align][align=center]使用不同颜色对肌肉进行了区分,同时能够观察到正在发育的骨骼。 [/align][b]4) 人类胚胎脉管系统的3D成像分析:[/b]质膜膜泡关联蛋白(Plvap)是一种由网状微血管内皮细胞表达的跨膜糖蛋白。对整个胚胎标记Plvap并成像,可以观察到致密的血管网络。对平滑肌表达的α肌动蛋白(SMA)进行免疫染色可以观察到生长中的动脉的3D结构。 [align=center][img=,450,414]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/9.jpg[/img] [/align][align=center](A)(B)8周龄标记Plvap的胚胎。[/align][align=center]Plvap在整个胚胎中形成了致密的网络。[/align][align=center](A中、右)右臂与右手。(B左)左腿的Z轴投射图像。[/align][align=center](*号)血管网络穿过了除了骨骼的所有组织。[/align][align=center](B右)面部图像。(箭头)角膜处没有血管。[/align][align=center](C)11周龄胎儿,标记胶原IV的肋骨表面。[/align][align=center](D左)11.5周龄胎儿的右腿和右膝,标记MyoSM的动脉。[/align][align=center](D右)11.5周龄胎儿的右脚,标记SMA的动脉。[/align][align=center] 对胃肠道的淋巴细胞表达的Podoplanin进行标记以研究淋巴管形成,表达Podoplanin的细胞覆盖了肠胃,[/align][align=center]而含Podoplanin的微管数量较少,说明人类淋巴系统成熟可能晚于血管系统。[img=,550,181]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/10.jpg[/img][/align][align=center](E)14周龄标记Podoplanin的消化道。表达Podoplanin的细胞位于肠胃上方。 [/align][align=center](右)表达Podoplanin的细胞尚未发育形成淋巴管。[/align][b]5) 肺的生长发育的3D分析:[/b]标记鼠的性别决定基因Sox9转录因子和Dcx,观察到Sox9在人的末端支气管芽处表达,Dcx在每个气道的近端上皮部分表达。用Plvap标记肺部的血管,发现肺间质内微血管和大血管形成了连续的网络。肺部气道的分支方式是高度保守的,包括域分支、水平分支和垂直分支,使用Sox9/Dcx标记小支气管,可以观察到3种分支方式,并发现了不对称分支现象。 [align=center][img=,550,329]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/11.jpg[/img] [/align][align=center](A)9.5周龄标记Sox9、Dcx和Plvap的胎儿的肺部。Sox9在上皮小管的末端表达,Dcx在近端表达。Plvap在整个肺的血管中表达。[/align][align=center](B)肺上皮小管Z轴光学切面。[/align][align=center](C)末端的微血管网络。[/align][align=center](D)气道分支的3D图像。肺叶(蓝绿),支气管(红)。[/align][align=center](E)支气管的3D图像。(右)三种分支方式。[/align][align=center] 标记SMA和平滑肌肌凝蛋白(MyoSM),两者均于围绕支气管和气道上皮小管的平滑肌处表达。标记Sox9显示出末端没有平滑肌。[/align][align=center]对平滑肌进行染色同时可以显示动脉和微动脉。可以使用SMA和酪氨酸羟化酶(TH)标记心脏来观察血管和神经分布。 [/align][align=center][img=,550,289]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/12.jpg[/img] [/align][align=center](F)9.5周龄的标记MyoSM的肌凝蛋白平滑肌的染色。(箭头)支气管及分支。[/align][align=center](G)11.5周龄的左肺标记SMA显示出气道平滑肌的分支方式。(箭头)动脉周围肌肉和(指针)近端气道周围肌肉。[/align][align=center](H)10周龄的肺的分支图像。末端芽部用Sox9标记。表达SMA的平滑肌分布于不表达Sox9的近端区域。[/align][align=center](I-K)心脏的光片显微图像。 [/align][b]6) 泌尿生殖系统发育的3D分析:[/b]人类生殖道分为两种结构:由中肾分化而来的中肾管(WD)和由中肾管诱导分化而来的副中肾管(MD)。性别决定伴随着生殖道的重构。Pax2转录因子可用于标记中肾和WD。8周龄的雄性胚胎中,MD尖端与WD紧密接触但并未完全生长。肾处于腹侧位置邻接生殖嵴。9.5周龄时MD继续沿WD延伸但并未连接。10周龄时两条MD连接,从两侧WD的中间延伸至泌尿生殖窦,同时开始降解,融合的剩余MD分化为前列腺囊。14周龄时,WD的中肾肾小管退化,附睾与输精管出现。Sox9是睾丸分化的必需因子,在睾丸索中表达,对Sox9使用免疫染色可以观察到睾丸索。[align=center][img=,350,415]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/13.jpg[/img][/align][align=center](A)8周龄标记Pax2的胚胎。[/align][align=center](B)(箭头)MD/WD连接。[/align][align=center](C)(D)9.5周龄的泌尿生殖系统。(箭头)MD尾端沿WD延长但仍未融合。[/align][align=center](E)10周龄的泌尿生殖系统。MD在底端融合(指针)并开始降解(箭头)。[/align][align=center](F)降解的继续。[/align][align=center](G)14周龄的泌尿生殖系统。输精管进一步发育(指针)。[/align][align=center](H)10周龄标记Pax2和Sox9的睾丸。[/align][align=center](I)10周龄标记Pax2的睾丸。[/align][align=center](J)14周龄的睾丸。[/align][align=center][img=,350,452]http://www.qd-china.com/uploads/Mandy/LaVision%20Application/14.jpg[/img][/align][align=center](A)10.5周龄标记Pax2的泌尿生殖系统。WD连续,MD已融合。(B)11.5周龄标记Pax2的生殖系统。(箭头)WD开始降解。(C)13周龄,标记Pax2的生殖系统。(箭头)子宫大小增加,WD显著降解。(右)MD顶端发育中的输卵管纤毛。(D)8周龄标记Pax2和Plvap的睾丸。(指针)微血管覆盖了睾丸和WD。而MD却没有血管形成。(E)10周龄的雄性胎儿中,MD没有微血管形成。(F)(G)10.5和13周龄标记Pax2和Plvap的卵巢。WD和MD均有致密的血管覆盖。 [/align][align=center][/align][b]总结:[/b]将免疫标记与3D成像技术结合,能够完好地保存器官的3D结构并使分辨率达到细胞水平,简单、快速、稳定、可重复,以上这些优势适合其应用于胚胎学,可用于研究遗传疾病或畸胎。此方法的限制条件主要在材料的获得,同时使用得抗体最大数量,抗体与实验方法的兼容性和大容量数据的存储。然而其应用的广泛程度依然不可限量。以后甚至可用于建立人类生长发育的3D图库。