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一、金黄色葡萄球菌及其肠毒素 葡萄球菌属(Staphylococcus)至少包括有20个种。其中金黄色葡萄球菌是一种引起人类和动物化脓感染的重要致病菌,也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一,可引起许多严重感染。本菌广泛分布于自然界,如空气、土壤、水及其它环境中。在人类和动物的皮肤及外界相通的腔道中也存在次菌。1.病原学特征 革兰氏阳性球菌,直径为0.8-1.0μm,成对或成短链状排列,或呈葡萄状聚集,无芽孢,无鞭毛(见图6-6)。 图6-6 金黄色葡萄球菌显微形态结构 file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps_clip_image-28057.png file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps_clip_image-27880.png 不能运动,一般不形成荚膜,但在少数菌株的外层可见有荚膜样的粘液物质。需氧或兼性厌氧菌,营养要求不高,于普通培养基上生长良好,37℃孵育24~48h形成直径1~2mm圆形、隆起、表面光滑、湿润、有光泽、不透明、边缘整齐的菌落。在室温下长时间培养产生脂溶性色素,使菌落呈金黄色。于血液琼脂平板上培养,金黄色葡萄菌菌落周围可形成完全透明溶血环(β溶血)。在液体培养基中呈混浊生长。生长温度在6.5-46℃之间,最适温度为30-37℃,能在冰冻环境下生存,能在质量分数为15%NaCl和40%胆汁中生长。在水分活度为0.87的条件下仍能存活。分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖,产酸不产气。分解甘露醇产酸在鉴定致病性方面有一定意义。 在不形成芽胞的细菌中金黄色葡萄球菌抵抗力最强。于干燥的脓汁或痰液中可存活2~3个月;加热60℃1h或80℃30min才能将其杀死。在2%石炭酸中15min或在0.1%升汞中10-15min死亡。耐盐,在含有10%~15%NaCl的培养基中仍能繁殖。对某些染料较敏感。如1︰10-20万倍稀释的龙胆紫溶液能抑制其生长。对青霉素、金霉素、红霉素和庆大霉素高度敏感,对链霉素中度敏感,对万古霉素也敏感;但对磺胺、氯霉素敏感性差。近年来由于抗生素的选择作用,耐药菌株逐年增多,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)已成为医院内感染最常见的致病菌。 金黄色葡萄球菌可通过化脓性炎症的病人或带菌者在接触食品后,使食品污染。金黄色葡萄球菌在20~37℃及适宜的pH和合适的食品条件下能产生肠毒素,如被金黄色葡萄球菌污染的食物,通常在21~30℃下,放置3~5h,就能产生足以引起中毒的肠毒素。50%以上的金黄色葡萄球菌可产生肠毒素,并且一个菌株能产生两种以上的肠毒素,引起食物中毒的肠毒素是一组对热稳定的低分子量可溶性蛋白质,分子量为26000-30000。 常用噬菌体分型。目前国际上将金黄色葡萄球菌分为4个噬菌体群、23个噬菌体型。噬菌体分型可用于流行病学调查按抗原性可分为A、B、C1、C2、C3、D、E、F共8个血清型且均能引起食物中毒,尤以[font=Ti
高效液相色谱法对金黄色葡萄球菌肠毒素B的快速分离纯化与检测 以金黄色葡萄球菌肠毒素为代表的一类蛋白质可以导致人类及其他灵长类动物的呕吐和腹泻,本实验开发了一种两步高效液相色谱法快速纯化金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的方法,首先将无菌的滤液通过反相色谱柱进行吸附,通过一个梯度洗脱的溶剂系统获得SEB,首先采用含有醋酸铵的乙腈水溶液洗脱,然后再用三氟乙酸(TFA)水溶液洗脱,以除去其他杂质。随后用含有TFA的乙腈水溶液将吸附的SEB洗脱下来。样品再经过阳离子交换色谱柱进行纯化。本方法可以得到初始滤液中40%-50%的SEB,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离免疫印迹法分析表明,经HPLC纯化的SBE免疫性质和生化性质同标准的SEB相似。 金黄色葡萄球菌肠毒素为金黄色葡萄球菌的某些菌株产生的一类蛋白质,能引起人类及其他灵长类动物的食物中毒反应,症状以呕吐和腹泻为主。根据血清特异性抗体反应将他们分为几类:金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA),SEB,SEC,SED,SEE等9个型。除了能引起食物中毒,还有超抗原作用,能够提高内毒素休克的风险。SEA,SEB,SEC这三种毒素的理化性质(包括分子大小,碱基序列,基本结构)已经被广泛研究。金黄色葡萄球菌肠毒素具有相似的结构,具有单个多肽链和一个二硫键。 文献中金黄色葡萄球菌肠毒素的纯化一般是阳离子交换色谱与凝胶色谱交替使用的多步骤过程。这些步骤主要用于色谱或电泳中纯毒素单个蛋白质分析,对于金黄色葡萄球菌肠毒素分子模式的了解对于我们了解其在发病中的作用非常重要。这些结构与功能的研究也为我们更加简单和快速的纯化和分析毒素提供了参考。材料和方法:金黄色葡萄球菌株S6的培养粗滤液作为SEB的初始来源,菌株S6是SEB的高产菌株。菌株在1L的培养液(包含有1%的蛋白胨,0.5%的酵母提取物,0.5%的NaCI)中培养,并于37℃条件下摇床培养24小时。通过离心(6000转/min,30min)获得除菌后的培养液,然后经过0.45um滤膜过滤得到滤液。色谱条件:分析性高效液相:安捷伦液相1200,菲罗门液相色谱柱4.6﹡150﹡5u,流速:0.8ml/min,进样量1ml,http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409301407_516501_2206222_3.png制备型高效液相:大连依利特,色谱柱SinoChrom ODS-AP ,10μm20*250mm;流速:20ml/min;制备型阳离子色谱柱为TSK-GELG3000SWXL5μm,7.8×300m流动相A:0.01 M醋酸铵pH值=5.5;;流动相B为乙腈;流动相C为0.1%三氟乙酸(TFA);流动相D为乙腈含有0.1%TFA。试剂均为色谱纯。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409301408_516502_2206222_3.png制备色谱图如下:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409301409_516503_2206222_3.jpg制备第二步:制备型阳离子色谱柱为TSK-GELG3000SWXL5μm,7.8×300mhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409301410_516505_2206222_3.png制备色谱图如下:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409301409_516504_2206222_3.jpg纯化后的样品于12%聚丙烯酰胺-SDS凝胶中进行电泳,电泳后进行染色或蛋白质印迹分析结果与讨论:本试验探索出一条高效液相色谱法对金黄色葡萄球菌肠毒素B的分离纯化方法,效果明显。
01糖发酵管:包括蔗糖发酵管,乳糖发酵管,水杨苷发酵管等等02 ONPG培养基:现常配制成现成的生化管03西蒙氏柠檬酸盐培养基 04缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用) 05克氏柠檬酸盐培养基 06丙二酸钠培养基 07葡葡糖铵培养基 08 Hugh-Leifson培养基(O/F试验用) 09 马尿酸钠培养基 10营养明胶 11苯丙氨酸培养基 12 氨基酸脱羧酶试验培养基 13蛋白胨水(靛基质试验用) 14 硫酸亚铁琼脂(硫化氢试验用) 15 尿素琼脂 16 氰化钾(KCN)培养基 17 氧化酶试验 18 硝酸盐培养基 19 细胞色素氧化酶试验 20 过氧化氢酶试验 21 过氧化物酶试验 22 磷酸盐缓冲液 23明胶磷酸盐缓冲液 24 乳酸-苯酚溶液 25 肉浸液肉汤 26肉浸液琼脂 27牛肉(或牛心)消化汤 28血消化汤 29豆粉琼脂 30血琼脂 31营养琼脂 32营养肉汤 33 乳糖胆盐发酵管 34乳糖发酵管 35 EC肉汤 36 缓冲蛋白胨水(BP) 37 氯化镁孔雀绿增菌液(MM) 38 四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB) 39 四硫磺酸钠煌绿增菌液(换用方法) 40 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC) 41 GN增菌液 42 肠道菌增菌肉汤 43 亚硫酸铋琼脂(BS) 44 DHL琼脂 45 HE琼脂 46 SS琼脂 47 WS琼脂 48 麦康凯琼脂 49 伊红美蓝琼脂(EMB) 50三糖铁琼脂(TSI) 51 三糖铁琼脂(换用方法) 52 克氏双糖铁琼脂(KI) 53 克氏双糖铁琼脂(换用方法) 54 葡萄糖半固体发酵管 55 5%乳糖发酵管 56 CAYE培养基 57 Honda氏产毒肉汤 58 Elek氏培养基(毒素测定用) 59 氯化镁孔雀绿羧苄青霉素培养基 60 胰蛋白胨水 61 Rustigian氏尿素培养液 62 氯化钠结晶紫增菌液 63 氯化钠蔗糖琼脂 64 嗜盐菌选择性琼脂 65 3.5%氯化钠三糖铁琼脂 66 氯化钠血琼脂 67 3.5%氯化钠生化试验培养基 68 改良磷酸盐缓冲液(小肠结肠炎耶尔森氏菌专用) 69 CIN-1培养基 70 嗜盐性试验培养基