人肺扁平上皮癌细胞

MSI1在人小细胞肺癌细胞系中的表达及MSI1低表达细胞模型的构建实验方法与步骤 细胞的复苏 1.复苏前的准备：打开水浴锅，设置温度37℃；紫外线将超净台消毒30 min；配置完全培养基。 2.将要复苏的H69、H446细胞从液氮取出，用一次性PE手套包裹冻存管，迅速放入水浴锅中震荡，使其快速融化。 3.在15 mL离心管中加入5 mL完全培养基及融化的细胞悬液，900 r/min离心8分钟，弃去上清，得到细胞沉淀。 4.在25 cm2的培养瓶中加入5 mL完全培养基，并用1 mL培养基将沉淀的细胞重悬并加入准备好的培养瓶中，放入CO2恒温培养箱中继续培养。 细胞的传代 1.选取在悬浮培养瓶中生长至90%的H69细胞，用移液枪将细胞悬液移入15 mL离心管中，选取在贴壁培养瓶中生长至90%的H446细胞，用PBS溶液将细胞吹至漂浮，并移入15 mL离心管中，两种细胞均900 r/min离心8分钟，弃掉上清。 2.分别在3个25 cm2培养瓶中加入5 mL完全培养基，在细胞沉淀中加入3 mL培养基并充分吹打混匀，将3 mL细胞悬液平均放入3个培养瓶中并混匀，放入培养箱中继续培养。 MSI1低表达细胞模型的构建1.从-80℃冰箱取出慢病毒载体冰上融化，将慢病毒用空白培养基稀释为滴度2×108，充分混匀，准备好病毒感染增强液。2.将25 cm2悬浮培养瓶中H69细胞移入15 mL离心管中并用移液枪充分吹打混匀，取其中500 μL放入细胞计数仪中计数，取出1.2×106个细胞置入新的离心管中，加入空白培养基至6 mL。3.在12孔板中以MOI=10的病毒滴度进行感染，培养16 h。4.16 h后将细胞悬液离心，换成不加双抗的完全培养基继续培养，72 h后观察荧光。5.待细胞生长至状态良好，加入1 μg/mL嘌呤霉素筛选至90%以上细胞均产生荧光。荧光实时定量PCR（Q-PCR）检测MSI1在mRNA水平的表达 总RNA的提取分别将细胞离心，PBS缓冲液清洗2次，900 r/min离心8 min，得到细胞沉淀。分别加入1 mL Trizol，用移液枪吸打至细胞完全破裂，加入200 μL氯仿，震荡30 s，室温静置10 min，以有效分离无机相和有机相，随后4℃，12,000 g/min离心15 min。将上清移至高压过的1.5 mL离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，轻柔颠倒震荡数次，室温静置10 min，随后4℃，12,000 g/min离心10 min。弃去上清，加入75%无水乙醇，4℃，12,000 g/min离心5 min。弃去上清，沉淀置于冰上自然干燥，但不可完全干燥。用30 μL DEPC水溶解总RNA。用NanoDrop One超微量分光光度计进行定量和纯度检测，用1%琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测。 cDNA的合成逆转录体系试剂名称使用量模板RNAMonScriptTM 5*RT111 All-in-One MixMonScriptTM dsDNaseNuclease-Free Water1 μg4 μL1 μLup to 20 μL将混合液轻柔吹打混匀，瞬时离心，37℃ 2 min，55℃ 15 min，85℃ 5 min，得到cDNA。 Q-PCR检测MSI1 mRNA的表达GAPDH引物序列：Forward primer:Reverse primer:5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’MSI1引物序列：Forward primer:Reverse primer:5’-GAACCATCCCGTCCTGTATCA-3’5’-GAAACCATGAAGCCCCAACC-3’Q- PCR反应体系：Q-PCR反应体系试剂名称使用量cDNAForward primerReverse primerMonAmpTM Chemhs qPCR MixLow ROXNuclease-Free Water50 ng0.2 μL0.2 μL5 μL0.1μLup to 10 μLQ-PCR反应程序： Q-PCR反应程序反应步骤反应温度反应时间循环次数预变性95℃10 min1变性95℃10 s40退火55-65℃10 s延伸72℃30 s溶解曲线溶解曲线按仪器默认溶解曲线 结果采用t检验，用Graphpad prism5计算MSI1在mRNA水平的表达量。 Western blot检测MSI1在蛋白水平的表达总蛋白的提取将对数生长期的H69-NC、H69-shMSI1细胞移入15 mL离心管中，900 r/min离心8 min，并用PBS溶液洗涤2次，以去除培养基中血清影响。分别加入含PMSF的蛋白裂解液100 μL，与细胞充分混匀。4℃裂解1小时后，4℃，12000 g/min离心15 min，将上清移至新的离心管中，得到细胞总蛋白。 BCA法测定蛋白浓度 将Solution A和Solution B以50:1的体积比配置BCA工作液，充分混匀。将2 mg/mL蛋白标准品等比稀释，最小浓度为125 μg/mL，并分别与配置好的200 μL BCA工作液混匀，铺入96孔板中。37℃孵育30 min，测定波长562 nm处OD（光密度值）值，并绘制蛋白标准曲线。取适量H69-NC、H69-shMSI1细胞总蛋白，20：1稀释后，与200 μL BCA工作液混合均匀。37℃孵育30 min，用酶标仪测定波长562 nm处OD值，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。Western blot检测MSI1蛋白的表达 分别收集对数生长期的H69-NC、H69-shMSI1细胞总蛋白，加入相应体积4×SDS Loading Buffer，沸水浴煮5 min，分别取40 μg细胞总蛋白，在提前配制的10% SDS-PAGE分离胶电泳。电泳结束后，将蛋白转至PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的封闭液 37℃封闭1.5 h。弃去封闭液，用TBST缓冲液洗3次，每次10 min，加入MSI1兔单克隆抗体（1:1000），并以GAPDH为内参，加入GAPDH鼠单克隆抗体（1:5000）；4℃孵育过夜，次日用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。在敷有MSI1抗体的膜上加入辣根酶标记山羊抗兔IgG（1:5000），在敷有GAPDH抗体的膜上加入辣根酶标记山羊抗鼠IgG（1:5000），37℃敷育1 h，TBST 缓冲液洗膜3次，每次10 min。用增敏化学发光底物试剂检测，暗室曝光显影。在GAPDH表达量相同的情况下比较MSI1的表达情况。多次重复，应用ImageJ计算出各个蛋白条带的灰度对比，结果采用t检验，并应用Graphpad prism5作出柱状图。 MSI1在人小细胞肺癌细胞系中高表达 提取人正常肺上皮细胞BEAS-2B、小细胞肺癌细胞H446、H69的RNA，利用Q-PCR检测MSI1在正常肺上皮及小细胞肺癌细胞系中的表达情况，结果如图2-1显示，MSI1在小细胞肺癌细胞系H446、H69中的表达远远高于正常肺上皮细胞。https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210102201428158_6718_5389809_3.png1 MSI1 mRNA在小细胞肺癌细胞系中的表达（**代表与正常肺上皮细胞相比，小细胞肺癌细胞MSI1表达量增高具有统计学意义，P0.01）。 MSI1低表达细胞模型的构建本实验选取人小细胞肺癌细胞系H69细胞，使用慢病毒感染技术敲低MSI1的表达，同时设置对照组除外病毒本身对细胞产生的影响，待细胞状态良好使用嘌呤霉素筛选，然后在荧光显微镜下观察如图2-2，可见H69-NC、H69-shMSI1细胞均产生绿色荧光，表明人小细胞肺癌H69细胞慢病毒感染成功。https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210102201428036_9359_5389809_3.png MSI1低表达细胞模型的构建。应用shMSI1慢病毒载体感染H69细胞，利用嘌呤霉素筛选，并在荧光显微镜下观察。 荧光实时定量PCR（Q-PCR）检测MSI1的mRNA表达水平提取对数生长期的H69-NC、H69-shMSI1细胞的RNA，并测量RNA浓度及完整性，用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性可见，RNA有三条带，从上到下依次为28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA，且28S rRNA的亮度是18S rRNA的两倍。用NanoDrop One超微量分光光度计测定人总RNA的A260/A280的值为2.00左右，A260/A230的值为2.30左右，说明提取的RNA质量和完整性很好，可以用于后续试验。利用Q-PCR技术检测各细胞内MSI1 mRNA相对表达量，结果如图2-3所示，与对照组相比，H69-shMSI1组MSI1 mRNA表达量明显降低（P0.01），抑制率约为75%。https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210102201434330_8277_5389809_3.png MSI1在RNA水平的表达（***代表与对照组相比，H69-shMSI1组MSI1 mRNA表达量下降具有统计学意义，P0.001）。 Western blot检测MSI1蛋白表达水平将BSA标准品（2 mg/mL）进行等比稀释，最低浓度为125 ug/mL，并应用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定在波长562 nm下的OD值，以OD值为纵坐标，对应蛋白质浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准蛋白曲线如图2-4所示。https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210102201435248_4142_5389809_3.png图2-4 标准蛋白曲线分别提取H69-NC、H69-shMSI1细胞的总蛋白质，利用Western blot技术检测各细胞内MSI1蛋白的表达情况。结果如图2-5所示，与对照组相比，MSI1蛋白表达在H69-shMSI1细胞中明显降低。表明MSI1低表达细胞模型构建成功。ahttps://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210102201437240_855_5389809_3.pngbhttps://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210102201434999_3303_5389809_3.png图2-5 MSI1蛋白水平表达：（a）MSI1蛋白表达条带；（b）MSI1蛋白的相对表达量。（*表示与对照组相比，H69-shMSI1组MSI1蛋白表达下降具有统计学意义，P0.05）。首先验证MSI1在小细胞肺癌细胞系中的表达情况，利用Q-PCR技术检测在RNA水平，MSI1在肺正常上皮细胞及小细胞肺癌细胞系中的表达，结果显示，MSI1在小细胞肺癌细胞中的表达明显高于正常肺上皮细胞。随后以人经典型小细胞肺癌细胞系H69细胞为研究对象，构建MSI1低表达细胞模型，应用shMSI1慢病毒载体感染H69亲本细胞，同时设置对照组除外病毒本身对细胞产生的影响，利用Q-PCR及Western blot验证MSI1在RNA及蛋白水平的表达，结果显示，H69-shMSI1组MSI1的mRNA及蛋白的表达明显降低。表明MSI1低表达细胞模型构建成功，可以用于后续实验。

[font='times new roman'][color=#000007]MSI1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000007] [/color][/font][color=#000007]在人小细胞肺癌细胞系中的表达及[/color][color=#000007] [/color][font='times new roman'][color=#000007]MSI1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000007] [/color][/font][color=#000007]低表达[/color][color=#000000]细胞模型的构建[/color]MSI1 在人小细胞肺癌细胞系中高表达提取人正常肺上皮细胞 BEAS-2B，SCLC-A 型 H69、H209、DMS153 细胞，SCLC-N 型 H446、H82、H2066 细胞，SCLC-P 型 H526、H211 细胞，SCLC-Y 型 H841、DMS114、SW1271 细胞的 RNA，利用 q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] 检测 MSI1 在正常肺上皮及小细胞肺癌细胞系中的表达情况，结果如图 2-1 显示，MSI1 在小细胞肺癌细胞系中的表达远远高于正常肺上皮细胞，综合分析，选取了 H69、H82、H526 及 SW1271 细胞用于后续实验。 [img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211232326443512_4838_5389809_3.png[/img]图 小细胞肺癌细胞系中 MSI1 mRNA 的表达（***P0.001）MSI1 低表达细胞模型的构建本实验选取人小细胞肺癌细胞系 H69、H82、H526、SW1271 细胞，使用慢病毒感染技术敲低 MSI1 的表达，同时设置对照组除外病毒本身对细胞产生的影响，待细胞状态良好使用嘌呤霉素筛选， 然后在荧光显微镜下观察如图 ， 可见 H69-NC 、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2、SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2细胞均产生绿色荧光，表明人小细胞肺癌细胞慢病毒感染成功。 [img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211232326451025_2121_5389809_3.png[/img]图 慢病毒感染后 4X 荧光显微镜下图片（H69、H82、H526、SW1271 明场及荧光照片） 敲低 MSI1 后转录和蛋白水平验证分别提取对数生长期的 H69-NC 、H69-shMSI1-1 、H69-shMSI1-2 、H82-NC 、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2、SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞的 RNA 和蛋白，利用 q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] 技术分别检测各细胞 MSI1 mRNA 相对表达量，结果如图 所示，与对照组相比，H69-shMSI1-1、 H69-shMSI1-2 、 H82-shMSI1-1 、 H82-shMSI1-2 、 H526-shMSI1-1 、 H526-shMSI1-2 、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 组 MSI1 mRNA 表达量明显降低（P0.01）， 抑制率约为 75%。利用 Western blot 技术检测各细胞内 MSI1 蛋白的表达情况。结果如图 2-3 所示，与对照组相比，MSI1 蛋白表达在 H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞中明显降低。表明 MSI1 低表达细胞模型构建成功。[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/11/202211232326454704_2148_5389809_3.png[/img]图 敲低 MSI1 在转录水平和蛋白水平的验证（***P0.001）