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1、材料与仪器罗汉果皂苷V对照品(来源:中国检验检疫局;批号:111754-200601;纯度:100%);乙腈(色谱纯,上海安普实验科技股份有限公司);一级水;磷酸(分析纯,广州化学试剂厂)、清咽含片(汤臣倍健股份有限公司)。超声波清洗器(EQ-500,昆山市超声仪器有限公司);waters超高效液相色谱仪(沃特世科技(上海)有限公司); 电子天平(感量0.1mg, [color=#333333]梅特勒[/color][color=#333333]-[/color][color=#333333]托利多[/color]科学仪器有限公司);色谱柱(C18,XSELECT HSS T3 2.5μm 2.1×100mm,沃特世科技(上海)有限公司)。2、色谱条件色谱柱(C18,XSELECT HSS T3 2.5μm 2.1×100mm);流速:0.4mL/min;柱温:40℃;进样量:5μL;检测波长:203nm,流动相:乙腈: 0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱,如下表:[table=411][tr][td] [align=center]时间(min)[/align] [/td][td] [align=center]乙腈(%)[/align] [/td][td] [align=center]0.1%磷酸水(%)[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]0[/align] [/td][td] [align=center]18[/align] [/td][td] [align=center]82[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]18[/align] [/td][td] [align=center]82[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]27[/align] [/td][td] [align=center]73[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7.5[/align] [/td][td] [align=center]27[/align] [/td][td] [align=center]73[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7.6[/align] [/td][td] [align=center]18[/align] [/td][td] [align=center]82[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]10[/align] [/td][td] [align=center]18[/align] [/td][td] [align=center]82[/align] [/td][/tr][/table]3、标准品溶液的配制精密称取罗汉果皂苷V对照品20.00 mg,置于25 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得罗汉果皂苷V对照品溶液,为储备液。分别精密吸取罗汉果皂苷V标准贮备液稀释成5个罗汉果皂苷V标准梯度使用液,浓度分别为0.033mg/mL、0.0504mg/mL、0.083mg/mL、0.166mg/mL、0.333mg/mL。4、供试品溶液的配制精密称取样品0.29g,置于25 mL棕色容量瓶中,加甲醇适量,于45℃超声30min,并不时振摇样品,放冷,用甲醇定容至刻度,摇匀,即得。5、标准曲线的绘制将标准系列溶液浓度为0.033mg/mL、0.0504mg/mL、0.083mg/mL、0.166mg/mL、0.333mg/mL的罗汉果皂苷V标准液进行UPLC分析,记录色谱图,以标准品的浓度为横坐标,标准品的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,求得回归方程。6、检出限实验将浓度为0.77 μg/mL的对照溶液进样测定,通过工作软件的计算得S/N=3。按实际样品的处理过程计算。7、精密度实验精密称取样品6份,按2.4供试品制备方法处理样品,检测样品含量,计算其RSD(%)。8、回收率实验精密称取约0.29g样品9份,置于25mL容量中,分成3组,每组3份,于每一组中分别精密加入罗汉果皂苷V标准使用液(浓度为0.8324 mg/mL) 1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL,加入适量的甲醇,45℃超声30min使溶解并定容至刻度,摇匀,经0.45μm的微孔滤膜过滤,即可。9、 结果与讨论9.1 标准曲线确证结果测定罗汉果皂苷V的标准曲线见图1,其标准方程为Y= 2877896.2267X+2312.4018(r=1.0000),线性范围为0.033-0.333mg/mL。[img=,690,282]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111541347430_3462_3237657_3.png!w690x282.jpg[/img]9.2 检出限和定量限分析方法的检出限和定量限由信噪比([i]S/N[/i])计算。检出限定义为S/N=3时对应的待分析浓度,定量限定义为[i]S/N[/i]=10时对应的待分析浓度。9.2.1 检出限 将浓度为0.77 μg/mL的对照溶液进样,通过工作软件的计算得S/N=3。按实际样品的处理过程计算,方法的检出限为:0.77μg/mL×25mL/0.29g= 66.4μg/g。9.2.2 定量限 取信噪比=10:1定为检测浓度,DL=2.57 μg/mL,按照实际样品的处理过程计算,方法的定量限为: 2.57μg/mL×25mL/0.29g = 221.6μg/g。9.3 精密度实验结果罗汉果皂苷V的精密度结果见下表,6个样品的含量范围为0.4325~0.4471g/100g,平均含量0.44g/100g,相对标准偏差(RSD)为1.5%,表明该方法有良好的精密度。[table=565][tr][td=1,2] [align=center]序号[/align] [/td][td=1,2] [align=center]称样量(g)[/align] [/td][td] [align=center]浓度[/align] [/td][td=1,2] [align=center]含量(g/100g)[/align] [/td][td=1,2] [align=center]平均含量(g/100g)[/align] [/td][td=1,2] [align=center]RSD(%)[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center](mg/mL)[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]0.29263[/align] [/td][td] [align=center]0.05203[/align] [/td][td] [align=center]0.4445[/align] [/td][td=1,6] [align=center]0.44[/align] [/td][td=1,6] [align=center]1.5[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]0.29711[/align] [/td][td] [align=center]0.0516[/align] [/td][td] [align=center]0.4341[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]0.29574[/align] [/td][td] [align=center]0.05156[/align] [/td][td] [align=center]0.4358[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]0.29017[/align] [/td][td] [align=center]0.05021[/align] [/td][td] [align=center]0.4325[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]0.28762[/align] [/td][td] [align=center]0.05107[/align] [/td][td] [align=center]0.4439[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]0.28839[/align] [/td][td] [align=center]0.05158[/align] [/td][td] [align=center]0.4471[/align] [/td][/tr][/table]9.4 回收率实验结果罗汉果皂苷V在3个不同添加水平下浓度的回收率结果见下表,3个浓度下样品中的罗汉果皂苷V的提取回收率范围是94.98%~100.83%,平均回收率为:97.6%,相对标准偏差(RSD)为1.8%。[table=452][tr][td=1,2] [align=center]序号[/align] [/td][td] [align=center]理论加[/align] [/td][td] [align=center]实测加标[/align] [/td][td] [align=center]回收率[/align] [/td][td] [align=center]平均[/align] [/td][td] [align=center]RSD[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]标量(mg)[/align] [/td][td] [align=center]量(mg)[/align] [/td][td] [align=center](%)[/align] [/td][td] [align=center]回收率(%)[/align] [/td][td] [align=center](%)[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center]1.33184[/align] [/td][td] [align=center]1.30079[/align] [/td][td] [align=center]97.668[/align] [/td][td=1,9] [align=center]97.58[/align] [/td][td=1,9] [align=center]1.8[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]1.33184[/align] [/td][td] [align=center]1.30239[/align] [/td][td] [align=center]97.788[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]1.33184[/align] [/td][td] [align=center]1.34284[/align] [/td][td] [align=center]100.826[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]1.6648[/align] [/td][td] [align=center]1.59282[/align] [/td][td] [align=center]95.676[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]1.6648[/align] [/td][td] [align=center]1.58125[/align] [/td][td] [align=center]94.981[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]1.6648[/align] [/td][td] [align=center]1.60273[/align] [/td][td] [align=center]96.271[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7[/align] [/td][td] [align=center]1.99776[/align] [/td][td] [align=center]1.95674[/align] [/td][td] [align=center]97.947[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]8[/align] [/td][td] [align=center]1.99776[/align] [/td][td] [align=center]1.96715[/align] [/td][td] [align=center]98.467[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]9[/align] [/td][td] [align=center]1.99776[/align] [/td][td] [align=center]1.97061[/align] [/td][td] [align=center]98.641[/align] [/td][/tr][/table]9.5 测定条件讨论 经紫外扫描,罗汉果皂苷V在203nm处有最大的吸收,分析结果显示色谱图基线平稳,且各色谱峰峰形、分离度较好,所以选择了203nm作为检测波长。由于制剂配方成分的复杂,采用等度并不能很好的得到分离,因此试验所用的流动相是经过筛选得来,罗汉果皂苷V测定所用流动相是在普通液相色谱条件的基础上进行梯度洗脱优化,经多次试验达到了良好的分离效果,且基线比较平稳,同时配合超高效色谱柱,检测时间短,适合本品的含量测定。
罗汉果皂苷V25%,40%和50%(罗汉果总甙80%)这三个含量是怎么做到的,确定的?各位前辈有知道的吗,能否解惑一下,小弟感激不尽。
[size=20px][color=#93c6bc][b]鉴别[/b][/color][/size][size=16px][color=#e2a4a4]|[/color][/size] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体](1)本品粉末棕褐色。果皮石细胞大多成群,黄色,方形或卵圆形,直径7~38[/font][font=宋体]μ[/font][font=宋体]m[/font][font=宋体],壁厚,孔沟明显。种皮石细胞类长方形或不规则形,壁薄,具纹孔。纤维长梭形,直径16~42[/font][font=宋体]μ[/font][font=宋体]m[/font][font=宋体],胞腔较大,壁孔明显。可见梯纹导管和螺纹导管。薄壁细胞不规则形,具纹孔。[/font] [font=宋体](2)取本品粉末1g,加水50ml,超声处理30分钟,滤过,取滤液20ml,加正丁醇振摇提取2次,每次20ml,合并正丁醇液,减压蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。另取罗汉果对照药材1g,同法制成对照药材溶液。再取罗汉果皂苷V对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述三种溶液各5[/font][font=宋体]μ[/font][font=宋体]l[/font][font=宋体],分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-乙醇-水(8:2:3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以2%香草醛的10%硫酸乙醇溶液,加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。[/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [size=20px][color=#93c6bc][b]检查[/b][/color][/size][size=16px][color=#e2a4a4]|[/color][/size] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [b][font=宋体][/font][/b] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][b]水分[/b] 不得过15.0%(通则0832第二法)。 [/font] [b][font=宋体]总灰分[/font][/b][font=宋体] 不得过5.0%(通则2302)。[/font] [b][font=宋体]【[color=var(--weui-LINK)]浸出物[i][/i][/color]】[/font][/b][font=宋体] 照水溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定,不得少于30.0%。[/font] [b][font=宋体]【含量测定】[/font][/b][font=宋体] 照高效液相色谱法(通则0512)测定。[/font] [b][font=宋体]色谱条件与系统适用性试验[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-水(23:77)为[color=var(--weui-LINK)]流动相[i][/i][/color];检测波长为203nm。理论板数按罗汉果皂苷V峰计算应不低于3000。[/font] [b][font=宋体]对照品溶液的制备[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]取罗汉果皂苷V对照品适量,精密称定,加流动相制成每1ml含0.2mg的溶液,即得。[/font] [b][font=宋体]供试品溶液的制备[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]取本品粉末(过四号筛)约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,密塞,称定重量,加热回流2小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液20ml,回收溶剂至干,加水10ml溶解,通过大孔吸附树脂柱AB-8(内径为1cm,柱高为10cm),以水100ml洗脱,弃去水液,再用20%乙醇100ml洗脱,弃去洗脱液,继用稀乙醇100ml洗脱,收集洗脱液,回收溶剂至干,残渣加流动相溶解,转移至10ml量瓶中,加流动相至刻度,摇匀,即得。[/font] [b][font=宋体]测定法[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10[/font][font=宋体]μ[/font][font=宋体]l[/font][font=宋体],注入液相色谱仪,测定,即得。[/font] [font=宋体]本品按干燥品计算,含罗汉果皂苷V (C[sub]60[/sub]H[sub]102[/sub]O[sub]29[/sub])不得少于0.50%。[/font] [font=宋体] [/font]