牛血清白蛋白对照品

Ian Edwards、JayneKirk和Joanne Williams沃特世公司(英国曼彻斯特)应用优势■ 简化了工作流程、验证和数据解析 ■ 设计用于大规模代谢组学和蛋白质组学数据集■ 集成式组学平台可用于各种各样的全面定性和定量分析沃特世解决方案包括TransOmics信息学软件的组学研究平台解决方案ACQUITY UPLC I-Class 系统nanoACQUITY UPLC 系统Xevo G2-S QTofTransOmics 信息学软件MassPREP 蛋白质酶解标准品 关键词组学，代谢组学，脂类组学，蛋白质组学，MSE，主成分分析，无标记LC/MS 简介近年来，包括基于LC-MS的代谢组学、脂质组学和蛋白质组学仪器等组学技术的进步实现了以高通量的方式对多种生物分子的丰度进行定量监测，从而测定它们在不同生物状态下的变化。我们的最终目标是增进对生物过程的理解，从而改善对于疾病的疗效，更有效地开发药物或维持作物生长的最佳农业环境，同时最大程度地减少传染和其它副作用。就此而言，不同分析学科的研究结果可提供正交的观点，通常可以互相作为补充。开发和应用能够将多个研究领域的结果进行整合的灵活信息学解决方案具有重大意义。本研究介绍了一种多组学解决方案，可用于对代谢组学和蛋白质组学数据集中的MS数据进行大规模分析。其中采用了包括TransOmics信息学软件的沃特世(Waters?)组学研究平台解决方案，并结合Xevo G2-S QTof系统进行技术和生物学重复分析。 结果与讨论执行的代谢组学实验包括相对于对照/质控样品，鉴定低剂量和高剂量样品。根据实验设计，样品应当划分为3个不同的组，并使用标记离子进行不同组的识别。用于代谢组学和脂类组学的TransOmics(TOIML)流程包括以下步骤： 1. 导入原始的MSE连续数据集(六个技术重复样/组)2. 峰对齐，纠正不同分析运行间的保留时间偏移3. 色谱峰归一化，以便在不同样品运行间进行比较4. 色谱峰检测(峰选择)5. 离子去卷积，按化合物将离子分组6. 利用已有的定制数据库进行化合物鉴定7. 执行数据分析，找出用以将化合物分为QC(质控)、空白(基质)和分析物(高剂量)的离子(特征) 基质背景包括系统评估基质，其中加入了不同的镇痛标准品混合物A，从而得到低剂量(QC和高剂量(空白)样品。质控样品(QC)通过混合等量的低剂量和高剂量样品而制成。 采用ACQUITY UPLC I-Class系统结合Xevo G2-S QTof，在正电喷雾模式下以大于30k FWHM的质量分辨率，分离和分析代谢物。在UPLC/MSE模式下采集数据，该模式是一种无监督的采集方法，其中当进行交替扫描时质谱仪在低能量和高能量之间切换。使用TOIML和专业化合物数据库进行处理、搜索和定量。 其中TOIML流程的步骤1，2和3在别处有详细描述(TransOmics信息学软件由Nonlinear Dynamics提供技术支持)。鉴定前，通过主成分分析对所检测离子进行分组，如图1所示，显示了综合得分图和载荷图。从中可知，离子主要聚集在技术重复水平，并且样品实现了清晰分离。 图1. 分析物(镇痛标准品混合物A高剂量；紫色)，空白(系统评估基质；浅蓝色)和QC(质控样品；深蓝色)的主成分分析接着，采用集成式搜索工具进行化合物鉴定，以正确鉴定四种镇痛标准品混合物中可在正离子电喷雾模式下检测到的标准品。图2展示了TOIML化合物搜索结果页面的概览，其中突出显示了基于精确质量数、保留时间(可选)和理论同位素模式分布对咖啡因的鉴定。除了先前描述的PCA之外，TOIML中还整合了其它多变量统计工具，包括相关性和趋势分析。图3为一个示例，示出了四个加标标准品的归一化趋势图，表明每个标准品的六个技术重复样之间有着良好的一致性，并且相对丰度与实验设计一致。此外，TOIML还便于科学家将分析结果与其它组学数据关联，或为诸如EZinfo的独立统计软件包提供输入数据。下游生物信息学(即Umetrics软件)的结果可重新导入分析实验中，以将所有化合物数据合并为单个表格以供审查或分享。图2. TOIML化合物鉴定页面。图3.镇痛标准品的归一化丰度分析。在蛋白质组学实验中，分析了两个10ng大肠杆菌样品的三个重复样，分别加入了牛血清白蛋白(BSA)、乙醇脱氢酶(ADH)，烯醇酶和糖原磷酸化酶B。第一个样品(混合物1)中的加标蛋白质的柱上进样量均为1飞摩尔，而第二个样品(混合物2)中的加标蛋白质柱上进样量分别为8、1、2和0.5飞摩尔。因此，额定预期比值(混合物2:混合物1)应为8:1、1:1、2:1和0.5:1。在本研究中，使用nanoAC-QUITY UPLC系统结合Xevo G2-S QTof，在LC/MSE采集模式下对肽进行分离和分析。采用用于蛋白组学的TransOmics(TOIP)以及含有加标蛋白质序列信息的种属特异性数据库进行处理、搜索和定量。 TOIP流程包括以下步骤：1. 导入原始的MSE连续数据集(每个样品有三个技术重复样)2. 峰对齐，纠正不同分析运行间的保留时间偏移3. 色谱峰归一化，以便在不同样品运行间进行比较4. 色谱峰检测(峰选择)5. 利用集成数据库搜索算法鉴定蛋白质和肽6. 多变量统计分析7. 绝对和相对定量 TOIP提供了与TOIML相同的多变量分析工具。图4显示了所检测特征的PCA示例，即电荷态组。可明显看出，特征主要聚集在技术重复水平。其中一种加标蛋白质消化物的肽定性鉴定结果示于图5中，该蛋白质中鉴定出的所有肽的归一化表达谱如图6所示。对后者的定量精确度类型进行了确证，此类型可通过无标记MS研究及基于LC/MSE的采集策略获得。 图4.大肠杆菌中加入的混合物1（深蓝色）和混合物2（浅蓝色）的特征（电荷态组）PCA图。图5显示了差异加标样品中一个分析物的LC/MSE采集的定性结果概览。在本例中，BAS的柱上进样量为8 fmol，而大肠杆菌消化物的量为10 ng。结果如图6所示，展示了相关的相对定量结果。图5.大肠杆菌中加入的不同浓度牛血清白蛋白肽的定性LC/MSE鉴定结果。顺时针显示的依次是鉴定相关指标（得分和误差）、具体的轮廓线图以及标注的产物离子谱图。图6.牛血清白蛋白中鉴定出的肽的定量分析。结论■TransOmics信息学软件为多组学研究提供了一个简单易用、可扩展的系统■UPLC/MSE（LC结合数据独立型采集MS）可在单次实验中提供全面的定性和定量数据集■通过代谢物、脂质和蛋白质分析可快速获取补充信息并进行关联

蛋白质作为生命活动的执行者,通过自身结构的动态改变,以及与其他蛋白质相互作用组装为蛋白质复合物,调控各种生物学过程。因此,如何实现蛋白质复合物的精准解析已成为当前生命科学的研究热点。化学交联结合质谱(CXMS)技术作为蛋白质复合物解析的新兴技术,利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质分子内或分子间的氨基酸残基以共价键连接起来,再利用液相色谱-质谱联用对交联肽段进行鉴定,实现蛋白质复合物的组成、界面和相互作用位点的解析。该技术具有分析通量高、灵敏度高、可提供蛋白质间相互作用的界面信息、普遍适用于不同种类和复杂程度的生物样品等优势,已成为X射线晶体衍射、低温冷冻电镜、免疫共沉淀等蛋白质复合物研究技术的重要补充。化学交联位点的鉴定覆盖度和准确度决定着该技术对于蛋白质复合物结构的解析能力。目前,为了实现蛋白质复合物的高覆盖度交联,研究人员发展了可用于共价交联赖氨酸(K)的氨基、谷氨酸(E)/天冬氨酸(N)的羧基、精氨酸(R)的胍基以及半胱氨酸(C)的巯基等多种活性基团的新型交联剂。进而,为了提高低丰度交联肽段的鉴定灵敏度,体积排阻色谱法、强阳离子交换色谱法,及亲和基团富集策略被提出用于交联肽段的高选择性富集,如可富集型化学可断裂交联剂——Leiker,与不具备富集功能的交联剂相比,通过亲和富集可以将交联位点鉴定数目提高4倍以上。胰蛋白酶镜像酶(LysargiNase)的酶切位点与胰蛋白酶互为镜像,可特异地切割赖氨酸和精氨酸的N端。由于LysargiNase的N端酶切特点,电荷主要分布在交联肽段的N端,在碰撞诱导裂解(CID)和高能诱导裂解(HCD)模式下产生以b离子为主的碎片离子,与胰蛋白酶酶切肽段以y离子为主的碎片离子互为镜像补充,为胰蛋白酶酶解肽段在质谱鉴定中b离子缺失严重的问题提供了很好的解决办法。由于具有较高的酶切特异性和酶活性,镜像酶已经成功地应用于蛋白质C末端蛋白质组鉴定、磷酸化蛋白质组研究、甲基化蛋白质组鉴定等方面,然而在CXMS中的应用仍未见报道。为进一步提高对蛋白质复合物结构及相互作用位点的解析能力,本文发展了LysargiNase与胰蛋白酶联合酶切的方法,基于镜像酶正交切割的互补特性,通过产生赖氨酸及精氨酸镜像分布的交联肽段,以增加特征碎片离子数量和肽段匹配连续性,从而提升交联肽段的谱图鉴定质量,达到提高交联位点的鉴定覆盖度和准确度的目的。通过分别对牛血清白蛋白及大肠杆菌全蛋白样品的交联位点鉴定结果的考察,评价该策略对单一蛋白样品和复杂细胞裂解液样品蛋白质复合物表征的应用潜力。蛋白质样品制备称取牛血清白蛋白粉末,以20 mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES, pH 7.5)作为缓冲体系,配制0.1 mmol/L牛血清白蛋白溶液。大肠杆菌细胞(种属K12)在37 ℃下采用Luria-Bertani(LB)培养基培养24 h,然后于4 ℃以4000 g离心2 min,收集细胞沉淀。细胞沉淀采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍后,悬浮于细胞裂解液(含20 mmol/L HEPES和1%(v/v)蛋白酶抑制剂)中,冰浴超声破碎180 s(30%能量,10 s开,10 s关)。匀浆液于4 ℃以20000 g离心40 min,收集上清,采用BCA试剂盒测定所得蛋白质含量。稀释大肠杆菌蛋白裂解液至蛋白质含量为0.5 mg/mL。化学交联样品制备以20 mmol/L HEPES(pH 7.5)为溶剂配制浓度为20 mmol/L 的BS3交联剂母液 将交联剂母液加入牛血清白蛋白的缓冲溶液及大肠杆菌蛋白裂解液中,使交联剂的终浓度为1 mmol/L,在室温条件下反应15 min 通过添加终浓度为50 mmol/L的淬灭溶液NH4HCO3进行交联反应淬灭,并在室温下孵育15 min 在冰浴条件下,将交联样品逐渐滴入8倍体积的预冷丙酮中,于-20 ℃静置过夜 在4 ℃条件下,以16000 g转速离心,去除丙酮,然后将交联蛋白用预冷丙酮清洗2次,去除上清液后,于室温挥发掉残余的丙酮 以8 mol/L尿素溶液复溶蛋白质沉淀 将牛血清白蛋白交联样品以5 mmol/LTCEP作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原 将大肠杆菌样品以5 mmol/LDTT作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原,避免大肠杆菌蛋白在酸性条件下发生变性 添加终浓度为10 mmol/L的碘乙酰胺(IAA),在黑暗中,于室温下反应30 min 以50 mmol/LNH4HCO3稀释样品至尿素浓度为0.8 mol/L后,将样品均分为两份,一份以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈50:1的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解过夜,另一份加入终浓度为20 mmol/L的CaCl2,以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈20:1的比例加入LysargiNase,并在37 ℃温度下酶解过夜。液相色谱-质谱鉴定及数据搜索上述所有样品经过除盐,使用0.1%甲酸(FA)溶液复溶,用超微量分光光度计测定肽段浓度,进行反相高效色谱分离和质谱分析。牛血清白蛋白样品采用Easy-nano LC 1000系统偶联Q-Exactive质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA) 流动相B: 98%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~10 min, 2%B~7%B 10~60 min, 7%B~23%B 60~80 min, 23%B~40%B 80~82 min, 40%B~80%B 82~95 min, 80%B。Q-Exactive质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 300~1800,分辨率为70000(m/z=200),自动增益控制(AGC)为3×106,最大注入时间(IT)为60 ms,母离子分离窗口为m/z 2。MS/MS扫描的分辨率为17500(m/z=200),碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量(NCE)为35%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms,仅选择电荷值为3~7且强度高于1000的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。大肠杆菌样品采用EASY-nano LC 1200系统偶联Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液 流动相B: 80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~28 min, 5%B~16%B 28~58 min, 16%B~34%B 58~77 min, 34%B~48%B 77~78 min, 48%B~95%B 78~85 min, 95%B。Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 350~1500,分辨率为60000(m/z=200), AGC为4×105, IT为50 ms,母离子分离窗口为m/z 1.6。MS2扫描的分辨率为15000(m/z=200),碎裂模式为HCD, NCE为30%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms。仅选择电荷值为3~7且强度高于2×104的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。质谱数据文件(*.raw)采用pLink 2软件(2.3.9)对交联信息进行检索和鉴定。使用从UniProt于2019年4月27日下载的牛血清白蛋白序列和大肠杆菌序列,搜索参数如下:酶切方式为胰蛋白酶(酶切位置:K/R的C端)、LysargiNase(酶切位置:K/R的N端) 漏切位点个数为3 一级扫描容忍(precursor tolerance)2.00×10-5 二级扫描容忍(fragment tolerance)2.00×10-5 每条肽段的质量范围为500~1000 Da 肽段长度的范围为5~100个氨基酸 固定修饰为半胱氨酸还原烷基化(carbamidomethyl [C]) 可变修饰为甲硫氨酸氧化(oxidation [M])、蛋白质N端乙酰化(acetyl [protein N-term]) 肽段谱图匹配错误发现率(FDR)≤5%。映射胰蛋白酶与LysargiNase酶解样品的交联位点在牛血清 白蛋白晶体结构(PDB: 3V03)的映射 LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品的交联位点对及单一交联位点的互补性LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品共同得到的交联位点鉴定打分比较b+/++与y+/++离子碎片分别在α/β-肽段的碎片覆盖度LysargiNase与胰蛋白酶酶解的交联肽段质谱图大肠杆菌样品中LysargiNase与胰蛋白酶酶切鉴定蛋白质复合物信息互补性带点击了解原文：https://www.chrom-china.com/article/2022/1000-8713/1000-8713-40-3-224.shtml

胰蛋白酶消化，质谱法轻松鉴定蛋白质，已经是非常成熟的工作流程。即使是刚接触MS的使用者也可以很快掌握。在质谱法鉴定蛋白的工作流程中，蛋白质鉴定是通过使用搜索引擎，例如 Mascot或Matrix Science进行简单的数据库搜索来实现的。然而，对于数据库中未列出的蛋白质鉴定需求，或需要进行蛋白质末端序列分析的这两种情况，通常采用更昂贵的高端仪器和更复杂的工作流程，需要熟练的操作员。此外，蛋白质测序仪也通常用作蛋白质末端序列分析的方法，但遇到 N 端封闭的蛋白质，去封闭是必要的。作为样品序列分析前的预处理，预处理效果取决于蛋白质类型，可能效果不佳，对操作人员有一定要求，需要一定程度的技能和经验，这些可能会限制其使用。 近年来，利用MALDI-TOF离子源（ISD：In-Source Decay）中发生的蛋白质碎裂离子，可以分析N末端被封闭或未在数据库中登记的蛋白质序列MS图谱。此外，ISD理论上不受每个样品质量的限制，因此无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质进行测序。结合电泳胶提取蛋白和岛津台式机MALDI-8020，通过N端封闭蛋白的分子量测定和序列分析的例子，让我们来了解下大蛋白分子直接测序技术MALDI-ISD。 将模型样品N 端被乙酰化的牛碳酸酐酶 (Sigma-Aldrich)溶解在缓冲溶液中进行电泳， 95 °C 下加热 5 分钟，然后在聚丙烯酰胺凝胶（ATTO 12.5 %，预制 e-PAGEL）上进行电泳。所得聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝染色以检测蛋白质斑点。使用含有表面活性剂的提取缓冲溶液，我们从凝胶分离的碳酸酐酶的条带中提取蛋白质。使用氯仿/甲醇在提取缓冲溶液中沉淀蛋白质以去除表面活性剂和盐，并使用 MALDI-TOF 质谱仪进行测量。芥子酸用作 MALDI 基质用于蛋白质分子量测量，1,5-二氨基萘 (DAN) 用于 ISD 的序列分析。 图1、碳酸酐酶电泳图图2、从凝胶中提取的碳酸酐酶MS图（基质芥子酸） 接下来，从25 pmol凝胶蛋白条带中提取碳酸酐酶，与基质DAN混合，MALDI-8020线性模式进一步分析。结果如图3所示，主要检测到c离子（从蛋白质N段产生的片段）质量一致的峰。通过使用免费软件Mass++ TM和蛋白质氨基酸序列比对工具Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)，我们对从检测到的峰中获得的氨基酸序列进行了同源性搜索。 图3、MALDI-ISD鉴定结果 鉴定结果显示匹配结果最高的是碳酸酐酶。通过检测到的c离子片段质量和数据库中已有的碳酸酐酶氨基酸序列，我们可以推断出N段序列是SHHWGYGKH...，并且是N-乙酰化的。 MALDI-8020线性模式MALDI-ISD技术，无需复杂的工作流程，无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质（如本文所述m/z 29030示例）进行N端测序。 该方法在岛津应用专家与美国佛罗里达州立大学、日本爱媛大学高级研究支持中心生物医学分析部、利物浦大学生化与系统生物学系等共同发表的一篇文献中也有应用到。PEPPI-MS基于聚丙烯酰胺凝胶的预分馏，实现质谱法鉴定完整蛋白或蛋白复合物。凝胶分离回收14种人血清蛋白，提取后，用MALDI-8020的MALDI-ISD产生的产物离子鉴定人血清白蛋白N端氨基酸序列。 MALDI-8020是岛津MALDI家族一款体积小巧，性能卓越的特色产品。荣获2018 IBO工业设计大奖银奖。 主要特点：● 线性台式MALDI-TOF● 200Hz固态激光器，355nm波长● 进样速度快● TrueClean™ 自动源清洁功能。配备大口径离子光学系统，使仪器长期使用中源的污染风险降到最低。配备基于紫外激光器的源清洁功能，可自动快速实现源自清洁。● 静音（参考文献：岛津应用新闻 No.B83J. Proteome Res. 2020, 19, 3779−3791