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金相显微镜暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象,微尘在强光直射通过的情况下,人眼不能观察,这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了体积,为人眼可见。暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体,而是将光线改变途径,使其斜射向被检物体,使照明光线不直接进入物镜,利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图象。暗视野观察的分辨率远高于明视野观察,最高达0.02—0.004暗视野实际是暗场照明发。它的特点和明视野不同,不直接观察到照明的光线,而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此,视场成为黑暗的背景,而被检物体则呈现明亮的象。
1、原理:暗视野显微镜是利用丁达尔(Tyndall)光学效应的原理,在普通光学显微镜的结构基础上改造而成的。暗视野聚光器,使光源的中央光束被阻挡。不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光改变途径,倾斜地照射在观察的标本上,标本遇光发生反射或散射,散射的光线投入物镜内,因而整个视野是黑暗的。 2、适用范围:暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品。这些样品因为具有和周围环境相似的折射率,不易在一般明视野之下看的清楚,于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比。这种显微镜能见到小至4~200nm的微粒子,只能看到物体的存在、运动和表面特征,不能辨清物体的细微结构。 3、使用方法 (1)把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。 (2)选用强的光源,但又要防止直射光线进入物镜,所以一般用显微镜灯照明。 (3)在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油,目的是不使照明光线于聚光镜上面进行全反射,达不到被检物体,而得不到暗视野照明。 (4)升降集光器,将集光镜的焦点对准被检物体,即以圆锥光束的顶点照射被检物。如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置,则应首先进行中心调节,使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。 (5)选用与聚光器相应的物镜,调节焦距,找到所需观察的物像。
全自动菌落计数仪因其使用的自动化程度高、分析结果可核对、样品信息可留存等,已逐渐被越来越多的科研院所、卫生疾控部分所喜爱。如何选型,才能获得性能卓越的菌落计数仪,并取得高性价比呢?这得从该类仪器的原理来解释。现今面市的所有全自动菌落计数仪器均是采用成像分析法实现自动计数的,即由【成像硬件+分析软件】所组成,这二块内容的任何一块上出现失分,都会严重影响计数分析结果的稳定性。 一、成像硬件的选型 成像硬件用于获得清晰有效的菌落图像,以便分析计数。现今的成像硬件有拍照成像的、扫描成像的。由摄像头拍照成像的优点是:成像速度快,能确保在0.5秒内获得菌落图像。由单反相机、卡片机拍照成像的优点是:能自动对焦、且像素分辨率一般更高,但其成像需要3~4秒的时间。然而,拍照成像的致命弱点是:成像环境中的光线强度,无论是暗视野,还是背光,想要做到图像中心与边缘保持完全一致,是不可能的。从而引起平皿上亮度的不一致,这就严重干扰了菌落目标的自动识别。因此,如果要选购拍照成像的,其分析软件就一定要具有背景矫正功能,以便自动改善成像的效果。扫描成像与在灯箱中营造均匀面光源不同,是将线光源通过移动变成面光源的,因此光线强度非常均匀,其均匀度通常比拍照灯箱的面光源要高一个数量级,从成像硬件的根本上解决了菌落目标的亮度不匀问题,因此计数分析非常稳定。目前,以300dpi分辨率(3482×2396像素成像)扫描6个90mm直径平皿的速度,暗视野成像约12秒、背光成像约20秒,就其成像速度而言,与单反相机、卡片机拍照成像的速度相当。由于扫描成像的光线均匀度远远高于拍照成像,为获得高质量的成像效果,以便实现“傻瓜式”分析。扫描成像的另一优点是:成像分辨率可调,单平皿成像最高可达4800dpi(即:25.4/4800=0.00529mm/像素),是任何拍照成像远不及的。可以预期:扫描成像将很快成为主流选择。 二、分析软件的选型 分析软件是全自动菌落计数仪的另一块核心成分。因为菌落生物的存在多样性,在培养基上的表现或显像不可能大体一致,针对这类变化,在分析软件选型上要考虑:对于各类成像干扰的自动排出能力。比如:是否能自动矫正背景,等等。另外,对于严重粘连在一起的团装、链状分布菌落,将其自动分割开来的水平,也是评价分析软件的考量指标。尤其是:对于同类菌落的“一键”化的智能分类计数能力,以及对于菌落计数分类的自动识别学习能力,更是评价分析软件的关键考量指标。现在比较好的分析软件,还集成了对6个90mm直径平皿的抑菌圈全自动测量功能,以及对抗生素效价分析、药敏分析功能,可避免用户重复购置成像用的硬件。一般分析软件都具应具备对于分析结果和标记图像的保存、查看功能。 三、精准、稳定的傻瓜式操作 全自动菌落计数仪就是为了减轻工作人员工作强度的,在现今的高技术下,若还需要估算才能测出菌落数的话,应是比较落后了。最好的是:能“不变应变”精准、稳定地傻瓜式操作的分析软件,其对于菌落形态和样品状态的不确定性,能够自动适应,以避免不断地调节菌落分割参数,其最多由对话交互来擦除那些个污染部分,即可。