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请问新购买的碱性磷酸酶怎么稀释? 需要特殊的缓冲吗?
我在用磷酸苯二钠测定土壤碱性磷酸酶时,配制的磷酸苯二钠(用硼酸缓冲液配制)溶液,在暗处放置了将近五天后出现了一些絮状物,请问下,磷酸苯二钠是不是现配现用啊?万分感谢!
[b][font='微软雅黑','sans-serif'][color=#FF6600]实验原理[/color][/font][/b][font='微软雅黑','sans-serif']碱性磷酸酶(alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase)广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中,ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关,参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域,一般在PH9.0~10.5范围内。Mg[sup]2+[/sup]对该酶的活力有显著的激活使用。[/font][font='微软雅黑','sans-serif']为了获得好的提取效果,在酶的制备过程,特别应注意以下几点:[/font][font='微软雅黑','sans-serif'](1)[/font][font='微软雅黑','sans-serif']选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始,否则应在低温下保存。[/font][font='微软雅黑','sans-serif'](2)[/font][font='微软雅黑','sans-serif']用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时,要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细,需缓慢加入并及时搅拌溶解,尽量防止泡沫形成,以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀,要静置20min以上,以使沉淀完全,然后方可时行离心分离。[/font][font='微软雅黑','sans-serif'](3)[/font][font='微软雅黑','sans-serif']有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作,缓慢加入,充分搅拌,避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后,最好立即将其溶于适量缓冲液中,以避免酶活力的丧失。[/font][font='微软雅黑','sans-serif'](4)[/font][font='微软雅黑','sans-serif']在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大,提纯步聚才有效。[/font][align=left][font='微软雅黑','sans-serif'] [/font][font='微软雅黑','sans-serif']酶活力的分析:通常是以对—硝基苯磷酸二纳(pNPP)为底物,在PH10.1的碳酸盐缓冲液(含2mmol/L Mg[sup]2+[/sup])的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯( pNP)在405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD[sub]4[/sub][sub]〇5[/sub]值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下,以5mmol/L pNPP为底物,在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg[sup]2+[/sup]的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。 [/font][/align]