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流式细胞胞仪的分析及分选原理流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和数字信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。在对细胞悬液中的单个细胞或其超微结构进行多参数快速自动分析过程中,每秒钟能测量数千个至数万个细胞,能在分析过程中按实验设计要求对特定细胞进行分析,带细胞分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞,用于培养或进一步研究。一、工作原理流式细胞仪的工作原理借鉴了荧光显微镜技术,将荧光显微镜的激发光源改为激光,使其具有了更好的单色性与激发[/
北京和睦家医院 孙芾 王厚芳 流式细胞术(FCM)是70年代初发展起来的一项高新技术,80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了第一台流式细胞仪,到目前在医学院校、科研机构和医院已经有100多台。 FCM采用流式细胞仪对细胞悬液进行快速分析,通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测,得到该细胞的光散射和荧光指标,分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。FCM综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术,具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点,还有对所需细胞进行分选等特殊功能。随着该仪器性能的不断完善,操作简单的各新型流式细胞仪相继问世。新试剂的不断发现使试验费用日益降低,FCM也从研究室逐步进入临床实验室,成为常规实验诊断的重要手段,不仅为临床提供了重要的诊断依据,也使检验科室的诊断水平、实验技术提高到一个新的高度。
[font=DengXian]请问国内有开发流式细胞仪试剂的厂商?[font=DengXian]我们是荧光染剂的厂商,想找抗体公司合作评估开发试剂。[/font][/font]
第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍概念流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析,同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪(Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞仪特点[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/11/200811302229_121122_1769204_3.gif[/img]
流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器,它只能测量一个细胞的诸如总核酸量,总蛋白量等指标,而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说,它的细节 分辨率为零。
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想学习流式细胞相关知识,比如BD流式细胞仪,但不知道怎么学,有没有大神指导下该怎么学,先看什么,后看什么,有什么好的建议吗?
4.1 流式细胞仪基本原理1. 生物学颗粒分析原理① 流式细胞技术是在单细胞水平上,对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术,现已成为现代医学研究最先进的分析技术之一。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。② 生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等,所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。③ 流式细胞仪是以激光为光源,集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 ④ 流式细胞仪是在荧光显微镜技术、血细胞计数仪和喷墨技术的基础上发展起来的。⑤ 鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束,与水平方向的激光束垂直相交,染色的细胞受激光照射后发出荧光,这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收,经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息,就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。2. 流式细胞仪细胞分选原理在压电晶体上加上频率为30kHz的信号,使液柱断裂成一连串均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时,流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷,带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时,依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转,落入指定的收集器内,从而达到细胞分类收集的目的。4.2 流式细胞仪的分类和基本结构1. 流式细胞仪的分类流式细胞仪根据功能不同可分为临床型(亦称台式机)和科研型(亦称大型机)。流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。http://www.care100.com/yqxjpkc/images/112.gif
流式细胞仪(Flowcytometry)是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。
魏熙胤 牛瑞芳(天津医科大学附属肿瘤医院中心实验室 天津 300060)摘 要 流式细胞分析(flow cytometry FCM) ,即流式细胞术,是用流式细胞仪(flow cytome-ter FCM) 测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术。它是众多不同学术背景、不同科技领域相结合的结晶。它是物理学、生物学、医学等综合运用的产物。本文就流式细胞术的发展历史、流式细胞仪的原理及在各领域的应用进行综述,阐明现代流式细胞术由于结合单克隆抗体技术、定量荧光细胞化学技术,使其在生物学、临床医学、药物学、材料学等众多研究领域中的应用有更加突飞猛进的发展。关键词 流式细胞术(FCM) 历史 原理 应用
流式细胞仪,反(散)射光和荧光形成的原因是什么?具体原理,以及他们的流式参数?
谁知道目前市面上有那几家有便携式流式细胞仪,在户外使用的,急急急呀!!!谢谢了
95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型(又称小型机、台式机)和综合型(又称大型机、分析型)。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型,除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。二.流式细胞仪主要技术指标 1.流式细胞仪的分析速度:一般流式细胞仪每秒检测1000~[
1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1.1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪(flow cytonletry,FCM)是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础,是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是:测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量,即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量,且在统计学上有效。 1.2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年,Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管,在亮视野下用显微镜进行计数,并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland —Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter Parker Horst Kamentsky1 Gohde、Fulwyler Herzen—berg等人的不断改进,设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用⋯。近20年来,随着流式细胞仪及其检测技术和的13臻完善,人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作,以扩大FCM的应用领域和使用效果。宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等,例举了其在医学和生物工程中的应用,非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的,所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说,这本书太复杂太深奥。谢小梅 主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊 概括了流式细胞仪的工作原理,简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后,用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理,并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。
流式细胞分选原理
六. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号检测系统 当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射(Forward Scatter, FS)和侧向角散射或900散射(Side Scatter, SS),散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备(如染色)无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光,它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。前向角散射(FS)反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号;侧向角散射或900散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm)。488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白)、PI(碘化丙啶)、CY5(化青素)、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是: [/col
请教各位:流式细胞仪的厂家(进口)主要有哪几家?性能如何?阿玛西亚有流式细胞仪吗?有人和我说有,可是我没有找到相关资料?麻烦各位了[em61] [em17]
关于流式细胞仪的介绍[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=36531]流式细胞仪[/url]
流式细胞仪的前向角FSC和侧向角SSC原理是什么?
我司最近想采购一批流式细胞仪,地点重庆,可以上门考察交流。
流式细胞术是一项基于激光和免疫荧光的单细胞检测技术。当带有荧光标记的细胞或其它颗粒流动通过检测点时,激光与荧光素分子相互作用,产生的光信号可以定性或定量的表征细胞中被标记的成分。由于细胞的特异性主要由
[font=宋体]流式细胞术,作为一种先进的生物技术,已经在生物医学研究中占据了举足轻重的地位。这种技术以其高精度、高速度以及多参数同时检测的能力,广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学等多个领域。流式细胞术不仅可以对单个细胞进行多参数定量分析和分选,还能够对细胞内部的蛋白质、核酸、细胞受体以及细胞表面抗原等进行检测。因此,它在疾病诊断、药物筛选、细胞功能研究等方面具有广泛的应用前景。本文将对流式细胞术的检测原理、应用领域以及发展前景进行详细介绍,旨在为读者提供对这一技术全面而深入的了解。流式细胞术可以检测什么?下面是具体检测信息及应用:[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]细胞表型检测[/font][/font][/b][font=宋体]免疫细胞表型是流式细胞术最突出应用。[/font][font=宋体][font=宋体]通过检测免疫细胞群的表面或细胞内标志物,对其进行鉴定和表征。流式细胞术能够精确鉴定和分类免疫细胞群,例如[/font] [font=Calibri]T [/font][font=宋体]细胞、[/font][font=Calibri]B [/font][font=宋体]细胞、[/font][font=Calibri]NK [/font][font=宋体]细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板和粒细胞等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]研究人员可以识别和量化异质群体中的各种免疫细胞亚群。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]临床医生可以诊断和监测各种血液系统疾病、进行免疫免疫评估([/font][font=Calibri]8[/font][font=宋体]大类免疫细胞构成与肿瘤预后)。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]细胞活力检测[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]流式细胞术能够定量测量群体内和体外培养的活细胞和非活细胞。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过使用选择性标记活细胞或死细胞的荧光染料,流式细胞术可以提供精确可靠的活力测定,有助于确定细胞活力百分比。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]流式细胞术可以根据特定的标志物或染料区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞,从而更详细地了解细胞的健康和状态。通过将活力染料与细胞表面抗原、细胞内蛋白或功能测定的标记物相结合,研究人员可以在特定细胞类型或实验条件下获得有关细胞活力及其发生机制的全面信息。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]最常用的活性检测染料[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]死细胞:碘化丙啶([/font] [font=Calibri]propidium iodide[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]PI[/font][font=宋体])和[/font][font=Calibri]7-AAD[/font][font=宋体],与[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]结合,但只能进入膜受损的细胞,使死细胞发出荧光。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]凋亡细胞:[/font][font=Calibri]annexin V[/font][font=宋体]:对磷脂酰丝氨酸具有强结合亲和力的蛋白质,在细胞凋亡的早期阶段暴露在质膜的外表面[/font][font=Calibri]annexin V+PI[/font][font=宋体]是常用区分凋亡细胞和坏死细胞的组合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]活细胞:[/font][font=Calibri]calcein AM[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CFDA[/font][font=宋体]([/font][font=Calibri]carboxyfluorescein diacetate[/font][font=宋体])、[/font][font=Calibri]FDA [/font][font=宋体]([/font][font=Calibri]fluorescein diacetate[/font][font=宋体]) :进入活细胞,但只有在与细胞内酶相互作用时才会发出荧光[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞体内增殖:[/font][font=Calibri]CFSE(CFDA-SE)[/font][font=宋体]穿透细胞膜,在活细胞内与胞内蛋白共价结合,水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中,它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减,标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半,根据这一特性,它可被用于检测细胞增殖,细胞周期的估算及细胞分裂等方面。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]细胞周期分析[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]从流式细胞术的早期开始,细胞周期分析就成为有价值的应用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原理是基于荧光和核酸的量之间的关系。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]常用核酸结合染料:碘化丙啶([/font][font=Calibri]PI[/font][font=宋体]),[/font][font=Calibri]Hoechst[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]DAPI[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]7-AAD[/font][font=宋体],溴化乙锭等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]流式细胞术细胞周期分可以有很多方面的应用,例如,[/font][font=Calibri]DNA/Ki67[/font][font=宋体]测定可以将表型选择与细胞周期分析相结合,用于监测[/font][font=Calibri]p53[/font][font=宋体]细胞周期停滞,评估抗癌活,多药耐药性等。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]4.[/font][font=宋体]离子通道测定[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]钙作为关键的第二信使,在许多细胞信号通路中起着至关重要的作用。它在免疫细胞活化中尤为重要,包括[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞、[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞。[/font][/font][font=宋体]此外,钙信号传导还参与肥大细胞脱颗粒、神经元兴奋性、突触传递和神经递质释放至关重要。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞脱颗粒的早期测量值是通过使用钙离子载体[/font][font=Calibri]A23187[/font][font=宋体]的流式细胞术确定的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]常用荧光染料:[/font][font=Calibri]fluo-3 [/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]indo-1[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]虽然[/font][font=Calibri]Ca2+[/font][font=宋体]通道测量是最常见的应用之一,但其他离子如镁、钾、钠和氢也可以使用流式细胞术进行监测。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]5.[/font][font=宋体]细胞功能检测[/font][/font][/b][font=宋体]最早的检测是细胞酯酶。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]使用响应氧化态变化的活性染料检测粒细胞的氧化电位。例如,氢乙啶([/font][font=Calibri]hydroethidine[/font][font=宋体])用于中性粒细胞呼吸爆发。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二乙酸二氯荧光素([/font][font=Calibri]dichlorofluorescein diacetate[/font][font=宋体]),已被用于吞噬细胞功能研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]效应细胞杀伤功能,是流式细胞术的另外一个重要应用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]细胞因子是免疫细胞功能的重要执行分子,对科学研究,免疫细胞治疗,临床诊疗都及其关键。基于流式细胞术开发的多重细胞因子检测,已经有广泛应用。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]6.[/font][font=宋体]蛋白质工程[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]流式细胞术和分选传统上不是蛋白质工程中最常用的技术之一。然而,近年来,在该领域的应用越来越多。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]流式细胞术被用于酶学蛋白质研究,包括细胞色素[/font][font=Calibri]P450[/font][font=宋体]、葡萄糖氧化酶、几丁质酶、纤维素酶、过氧化物酶、酯酶、转移酶、β半乳糖苷酶、硫代内酯酶等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白质工程,包括在基因水平上引入突变(随机或特异性),以创建由数千到数百万个单个蛋白质变体组成的文库(如上图),使用流式细胞术[/font] [font=宋体]每天能够分析多达[/font] [font=Calibri]10^8[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10^9 [/font][font=宋体]个克隆,并对具有所需特性的克隆进行分类。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7.[/font][font=宋体]哺乳动物细胞和细菌细胞分选[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]细胞分选是流式细胞的重要应用之一,哺乳动物细胞相对成熟,不做赘述。细菌细胞方面的应用,也逐渐开始建立。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]与耗时的传统琼脂铺板检测方法相比,流式分选可以快速检测和分选悬浮液中的单个细菌细胞。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]尽管细胞分选仪具有高性能,但它们在微生物学中的应用一直受到限制。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]这主要是由于微生物体积小,因此很难将它们与培养基中的细胞碎片或背景颗粒区分开来。另一个潜在的问题是,通常没有细菌菌株特有的抗体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]限制细胞分选仪在细菌检测和分选中的适用性的其他因素主要与分选仪硬件功能本身有关,在流式细胞术仪器的早期,数量有限的激光器和检测器,限制一次只能使用一种或两种荧光染料。随着最新仪器的发展,多激光器和检测起的仪器被开发:包括赛默飞世尔的[/font][font=Calibri]Bigfoot[/font][font=宋体]光谱细胞分选仪,[/font][font=Calibri]BD FACSAria III[/font][font=宋体]分选仪,索尼[/font][font=Calibri]MA900[/font][font=宋体]细胞分选仪和贝克曼库尔特的[/font][font=Calibri]MoFlo Astrios EQ[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]此外,部分致病性细菌,需要在[/font][font=Calibri]BSL2[/font][font=宋体]以上的实验环境下进行,现在部分流式细胞术带有[/font][font=Calibri]BSL 2 hood[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]8.[/font][font=宋体]液滴微流体[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]液滴微流体是一个相对较新的领域,专注于皮升体积中含有细胞或[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的离散液滴的形成,操作和分析,应用于生物学、化学、材料科学和医学。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在生物学中,液滴微流体可实现单细胞分析、生物分子的高通量筛选、细胞异质性研究和药物发现。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]流式细胞术分析是研究单细胞的强大技术,可提供有关各种参数的宝贵信息。然而,它的测量仅限于直接连接到细胞的分子,例如表面或细胞内标记物,限制研究由细胞分泌或由[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]分子产生但不物理附的分子。液滴微流体提供了一种克服这一限制的新方法。将细胞或[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]封装在单个液滴中会产生离散的区室,从而能够分析由封装实体释放或产生的化合物。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]9.[/font][font=宋体]下一代生物制剂[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]生物制药已经占据了药物市场的重要份额,包括治疗性蛋白质([/font][font=Calibri]65%[/font][font=宋体]),疫苗([/font][font=Calibri]20%[/font][font=宋体])等。通过测序([/font][font=Calibri]NGS[/font][font=宋体])进行单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞库分析和克隆扩增鉴定,直接从人类幸存者克隆免疫球蛋白基因,分离出高亲和力中和抗体,加快了单克隆抗体药物的研发,然而,这种方法比较昂贵,且依旧需要后续的功能验证等。新策略可使用流式细胞术、[/font][font=Calibri]MACS[/font][font=宋体]或微流体将单细胞分离与功能筛选相结合,降低开发成本并消除失败的候选药物,是流式细胞术新的应用开发方向。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service][b]流式细胞检测技术服务[/b][/url],拥有[/font][font=宋体][font=宋体]①具有 [/font][font=Calibri]20,000 [/font][font=宋体]次以上流式抗体筛选鉴定经验及多年流式诊断抗体研发经验,在实验方案设计、样品制备、数据分析等方面确保科学性、准确性和可靠性[/font][font=Calibri] [/font][/font][font=宋体][font=宋体]②拥有 [/font][font=Calibri]1,000 [/font][font=宋体]余株自产精品流式抗体,覆盖细胞膜、胞内、核内及分泌抗原;[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③自产 [/font][font=Calibri]Annexin V/7-AAD [/font][font=宋体]凋亡检测试剂盒,并储备多种流式检测常用试剂,大大节约购买试剂的等待时间和实际费用;[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④可以提供近 [/font][font=Calibri]200 [/font][font=宋体]种细胞系选择,省去细胞样本寄送过程中的风险,并可以免费提供健康人外周血细胞对照品。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州:蛋白与抗体的专业引领者,欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]
流式细胞仪(Flow cytometer, FCM)是70年代发展起来的对单个细胞进行定性定量测定的新型仪器,亦称荧光激活细胞分类仪(FACSC),是一种将现代免疫荧光技术与流体力学、激光学、应用电子学和计算机等学科的先进技术相融合用于基础与临床细胞生物学研究的一项高科技实验检测仪器。它能在一定功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选,高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测到多个参数。与传统的荧光镜检测相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特点,已在医学、生物学的几乎所有领域里得到迅速的推广,并在各学科研究中发挥着重要的作用。我的这片文章9月发表,等正式发表了,我贴出来,需要的话可联系我shuguangfang@tom.com
流式细胞仪,哪位了解?哪里的好?请赐教!xq.shi@126.com
[font=宋体][font=宋体]在生物学和医学研究中,细胞增殖是一个关键过程,对于理解生命活动的基本规律以及疾病的发病机理具有重要意义。随着科技的发展,流式细胞仪作为一种高效、灵敏的分析工具,广泛应用于细胞增殖的检测。流式细胞仪通过快速分析单个细胞,可以对细胞周期、细胞增殖活性、细胞凋亡等多个方面进行研究。本文将探讨流式细胞仪在检测细胞增殖方面的主要方法,包括但不限于溴脱氧尿苷([/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体])掺入法、细胞周期蛋白检测法以及细胞大小分析法等,以期为读者提供全面的技术应用概览。流式细胞仪检测细胞增殖方法:[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体](氚离子)掺入法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理:是在细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成时,用[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]脱氧胸腺嘧啶核苷代替普通的脱氧胸腺嘧啶核苷掺入新合成的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]中,增殖的细胞因为掺入[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]而具有放射性,通过定量检测样品细胞的放射性大小而反映细胞的增值活性[/font][/font][font=宋体][font=宋体]缺点:[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体])使用的是具有放射性的同位素,操作较为复杂,同时需要采取放射性保护措施 [/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体])低比例高活跃增殖和高比例低活跃增殖可能得到的是相同的结果,用此方法无法进行鉴别 [/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体])此方法无法进一步得到具有活性的增值细胞用于下一步的研究 [/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]) 此方法时间较短,无法检测加入前细胞的增殖情况,而且检测到放射性只能说明细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成,而不能提供合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的细胞是否进入增殖阶段的信息[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、相对计数法[/font][/font][/b][font=宋体]原理:将对照组和各实验组控制在相同条件下直接计数然后比较计数结果得到增殖结论[/font][font=宋体]注意点:[/font][font=宋体][font=宋体]对照组与实验组每种细胞所加浓度必须相同,每组至少设置[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个复孔,这样每个孔可以得到[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]个细胞数,将[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个复孔取平均值后就是这个组的结果。如果同时需要得到每孔目标细胞增殖后的绝对参数,在每孔细胞中加入[/font][font=Calibri]1*105PE[/font][font=宋体]标记的人工微球作为内参[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]收集各组的细胞于[/font][font=Calibri]EP[/font][font=宋体]管中,注意必须尽量将各组的所有细胞都收集起来。标记需要计数细胞的标志表型的荧光素偶联抗体,[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃静置[/font][font=Calibri]30min[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]洗涤一次,洗去游离的抗体[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、示踪染料标记法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]示踪染料与细胞结合的方式:[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体])能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合 [/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体])能够非特异性地嵌入细胞膜的脂质双分子层中与细胞发生非共价性结合[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理:示踪染料的荧光信号都很强,当细胞分裂时,母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中,细胞荧光信号会被减弱一半,所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例就可以判断细胞增殖的强弱。当荧光强度减弱到标记时的[/font][font=Calibri]1/2[/font][font=宋体]以及以下的细胞都是增殖后的细胞,这些细胞所占比例越高则代表细胞增殖越活跃[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]标记方法:[/font][font=宋体][font=宋体]①纯化增殖反应的目标细胞,将细胞的浓度调整为[/font][font=Calibri]1*106/ml[/font][font=宋体],加入[/font][font=Calibri]CFSE[/font][font=宋体],其标记浓度为[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]微摩尔[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]升。置于[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]℃水浴中标记[/font][font=Calibri]15min[/font][font=宋体],在标记过程中每隔一段时间混匀细胞一次[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②加入预冷、含有血清的培养基终止标记,在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃冰箱中静置[/font][font=Calibri]5min[/font][font=宋体],离心沉淀[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③用培养基再洗涤一次,尽量洗净未结合的游离的[/font][font=Calibri]CFSE[/font][font=宋体],然后将目标细胞静置在增殖体系中[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]EdU[/font][font=宋体]掺入法[/font][/font][/b][font=宋体][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]:[/font][font=Calibri]5-[/font][font=宋体]溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶核苷的类似物,其特点是胸腺嘧啶环上[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]位[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]连接的甲基被溴取代,在细胞增殖[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成时可以与内源性的胸腺嘧啶核苷竞争掺入到新合成的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]中,而[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]抗体可以特异性的识别[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体],不与胸腺嘧啶核苷结合,所以可以用于检测细胞增殖[/font][/font][font=宋体][font=宋体]适用范围:适用于体内检测目标细胞的增殖,一般将[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]掺入小鼠的应用水中或经腹腔注射,经过一段时间后,取出目标细胞制成单细胞悬液然后用多聚甲醛固定细胞,后用打孔剂皂苷在细胞膜上打孔,最后标记荧光素偶联抗[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]抗体,目标细胞的[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]阳性细胞就是增殖的细胞,阳性比例越高,增殖越活跃。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、其他方法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]细胞周期法检测细胞增殖:流式细胞术能够检测细胞内[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的含量,所以可以检测细胞周期。处于[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]期的细胞,[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的量处于二倍体和四倍体之间[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]处于[/font][font=Calibri]G2/M[/font][font=宋体]期时,[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]量为四倍体。处于[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]期和[/font][font=Calibri]G2/M[/font][font=宋体]期的细胞比例越高说明细胞增殖越活跃[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]PCNA[/font][font=宋体]检测细胞增殖:[/font][font=Calibri]PCNA[/font][font=宋体](增殖细胞核抗原),在细胞核合成且只存在于细胞核内,是[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]聚合酶的辅助蛋白,所以与细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的合成关系密切,是反映细胞增殖状态的良好指标[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Ki-67[/font][font=宋体]检测细胞增殖:是一种与细胞增殖特异相关的核抗原[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CD71[/font][font=宋体]检测细胞增殖:是转铁蛋白受体,表达于细胞的表面,该受体广泛表达于各种恶性肿瘤细胞表面,正常细胞表达较少,与肿瘤细胞的增殖密切相关[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service][b]流式细胞检测技术服务[/b][/url],更多关于流式细胞仪检测细胞增殖详情欢迎咨询,详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州:蛋白与抗体的专业引领者,欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]
[align=center][size=24px]流式细胞仪监测适配体与靶细胞的结合[/size][/align][align=center]肖书棋 18122884967[/align][align=center][/align]本次说明是基于核酸适配体能与靶标进行特异性结合的原理,利用流式细胞仪监测适配体与靶细胞的结合状况,还能比较不同适配体与靶细胞之间的结合强度的比较;本次所使用的流式分析仪是BD FACSAria III。[font='times new roman'][size=16px]1.原理介绍:[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.1核酸适配体:[/size][/font]核酸适配体(Aptamer,Apt):是一段寡核苷酸序列(ssDNA或RNA),是利用指数富集的系统进化技术(the Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)在多样寡核苷酸序列的文库中,进行体外筛选得到。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026239049_1528_5413603_3.jpeg[/img][/align][align=center][size=13px]Aptamer结合靶标原理[/size][size=13px]图[/size][/align]如图所示,在合适的缓冲液环境下,单链寡核苷酸序列具有弯曲以及折叠成特定的三级空间结构的能力,该结构可以与靶分子特异性结合,SELEX技术就是应用该原理来进行选择的。将信息量巨大且随机的的寡核苷酸文库与靶标孵育,经过多轮的优胜劣汰和PCR扩增,最后得到能与靶标高亲和力性结合的寡核苷酸序列,即核酸适配体(Aptamer)。由于核酸适配体具有靶向特异性的特点,因此应用广泛;那么如何监测适配体靶向细胞亲和力的方法,就需要用到流式细胞术进行表征。[font='times new roman'][size=16px]1.2流式细胞仪原理:[/size][/font]流式细胞术能够快速检测细胞或者生物颗粒的特征,其检测灵敏,能够定性或者定量分析颗粒的参数,还具有细胞分选的功能,功能强大,分析参数多,实用性较强。流式细胞仪(flow cytometer,FCM)的设计应用了光学、细胞化学、电子学等技术,拥有较强大的细胞及微粒分析功能,在临床医学、免疫学、微生物学等等研究领域发挥着巨大的作用。流式分析可以检测细胞表面颗粒复杂程度、核酸以及蛋白质的含量、细胞表面积或者细胞表面的抗体、细胞受体等等,在多种研究领域起到重要作用。在本研究中应用流式分析细胞荧光强度的基本步骤原理是:(1)制备成单细胞悬液:将待测细胞预处理进行荧光标记后制成单细胞悬液,通过气压将流式管中的细胞悬液通过管道压进流动室,同时喷出的鞘液将细胞包裹,形成圆形的鞘流,细胞在鞘液的包被下单行排列,依次通过流动室检测区域。(2)形成光散射:激发光源侧向垂直射向单个细胞,含有荧光的细胞形成两种光:①前向散射光(forward scatter, FSC):激光束照射细胞时,光束偏移量较小(10°以内),散射至前方,可用于检测细胞等粒子的表面信息,颗粒体积越大,信号越强。②侧向散射光(side scatter,SSC)激光束照射颗粒,产生偏移角度为直角的散射光,可反应细胞内含物的信息。(3)光信号转化成电信号:光信号导入到计算机中,依次形成电信号,再转化为数字信息。应用FlowJo软件处理数据,可以获得相应的散点图、直方图等形式,便于直观分析。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026241158_6946_5413603_3.jpeg[/img][/align][align=center][font='times new roman'][size=13px]流式分析基本原理图[/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px]2.分析步骤:[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2.1细胞预处理:[/size][/font]通过流式分析预处理,可以使细胞在特定的环境,与带有FAM荧光的适配体进行特异性结合,通过平行实验使细胞与不同的适配体文库进行标记,最终表征其荧光强度,进行亲和力的分析与比较。如表所示,流式分析条件为:[align=center][size=13px]流式细胞分析条件探寻[/size][/align][table][tr][td][align=center][size=13px][color=#000000]孵育时条件[/color][/size][/align][/td][td][size=13px][color=#000000]孵育时体积[/color][/size][/td][td=2,1][align=center][size=13px][color=#000000]孵育时浓度[/color][/size][/align][align=center][size=13px][color=#000000]细胞浓[/color][/size][size=13px][color=#000000]度 [/color][/size][size=13px][color=#000000]单链DNA浓度[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]第二次洗涤用液[/color][/size][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][size=13px][color=#000000]4 ℃,30 min,BB,摇晃[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]500 μL[/color][/size][/align][/td][td][size=13px][color=#000000]2.5×10^6个/mL[/color][/size][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]125 nM[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]PBS x 2[/color][/size][/align][/td][/tr][/table]流式分析的大致步骤为:消化细胞、细胞与文库孵育、润洗重悬、上样分析。最终确定,初始的细胞悬液浓度为5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font] 个/mL,初始文库的浓度为250 nM;孵育时体系的总体积为250 L,细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL,适配体浓度为125 nM,环境为4 ℃、30 min,震荡。最后上样的细胞悬液体积为500 L,细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.1材料准备:[/size][/font][/align][align=center][size=13px] 流式分析主要仪器与试剂[/size][/align][table][tr][td][align=center]名称[/align][/td][td][align=center]规格/型号[/align][/td][td][align=center]作用[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]流式细胞仪[/align][/td][td][align=center]FACSAria III[/align][/td][td][align=center]对细胞进行流式分析[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]可调式混匀仪[/align][/td][td][align=center]MX-S[/align][/td][td][align=center]混悬适配体悬液[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]震荡仪[/align][/td][td][align=center]MX-M[/align][/td][td][align=center]震荡孵育体系,防止细胞贴壁[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]制冷恒温金属浴[/align][/td][td][align=center]HX-20L[/align][/td][td][align=center]热击适配体,使核酸变性恢复到自由的无规则卷曲状态[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]显微镜[/align][/td][td][align=center]DMI1[/align][/td][td][align=center]观察细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]水浴氮吹仪[/align][/td][td][align=center]FY-DCY12S[/align][/td][td][align=center]加热试剂[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]电子天平[/align][/td][td][align=center]JA2003[/align][/td][td][align=center]称量药品[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]离心管[/align][/td][td][align=center]15 mL×10、50mL×10[/align][/td][td][align=center]分装试剂,装载需离心的细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]低吸附离心管[/align][/td][td][align=center]2 mL×20[/align][/td][td][align=center]装适配体悬液,减少适配体与细胞在管壁上的吸附[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]一次性使用吸管[/align][/td][td][align=center]3 mL×20[/align][/td][td][align=center]方便地吸取PBS[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]细胞刮刀[/align][/td][td][align=center]3010×1[/align][/td][td][align=center]刮下贴壁生长的细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]PBS[/align][/td][td][align=center]50 mL×2[/align][/td][td][align=center]ScienCell[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Cell Dissociation Solution[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]消化细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.25%Trypsin-EDTA[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]Gibco[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1×PBS缓冲液[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]润洗细胞,重悬细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Cell Dissociation Solution[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]消化细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.25%Trypsin-EDTA[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]Gibco[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1×PBS缓冲液[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]润洗细胞,重悬细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]无酶无菌水[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]溶解适配体文库[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]DMEM高糖培养基[/align][/td][td][align=center]50 mL[/align][/td][td][align=center]停止消化[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]细胞[/align][/td][td][align=center]>5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个[/align][/td][td][align=center]作为目的细胞进行流式表征[/align][/td][/tr][/table]①配置Binding buffer(结合缓冲液BB):配置10 g/L BSA:称量0.1g BSA,溶于10 mL Washing Buffer,过膜;取上述溶液5 mL,加入到445 mL Washing Buffer中;再加入500 L鲑精DNA,混匀。②将U盘格式化,提前打开制冰机和金属浴(95℃);③37℃水浴:将无酶消化液、ECM、PBS(1)放入37℃水浴。④4℃冰敷:向泡沫盒中加碎冰,离心管架、温度计,准备4℃孵育环境,放入PBS和BB预冷。⑤打开显微镜(酒精擦拭载物台)。⑥打开离心机:120 g,1 min,25℃。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数和文库预处理[/size][/font][/align](1)细胞计数(20倍或者40倍显微镜):①采用直接计数法,在显微镜中随机选择五个点进行计数取平均值,根据视野的面积以及T75培养瓶面积计算细胞总数,推出公式:Y为总细胞数;X为视野中细胞平均数;Y=27886.12X(20倍镜下)/Y=111111.11X(40倍镜下)。为了保证流式有足够的细胞,需要保证细胞总数>5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL。②计算BB体积:V=Y/(2×10[font='times new roman'][size=16px]7[/size][/font])mL,用V体积的BB重悬细胞沉淀,可获得细胞浓度为5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的初始细胞悬液。(2)文库预处理:①将粉末状适配体文库进行离心:4000 r,5 min,4℃;使适配体粉末聚集在离心管底部,防止打开离心管时干粉状适配体飞出。②按照说明用一定体积的无酶无菌水溶解适配体,使适配体母液浓度在5 M。③取100 L母液,并加入900 LBB,使适配体浓度在500 nM。④再去上述液体500 L,并用BB稀释至浓度为250 nM,最终得到250 nM的适配体文库悬液。⑤95℃热击3 min,热击后放在泡沫盒中冰敷。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞处理[/size][/font][/align](1)消化:①PBS(37℃)润洗3次。②无酶消化液3 mL,消化9 min(等待期间准备好孵育用离心管;确认离心机参数为:120 rcf,1 min,25 ℃),吹打细胞使其从培养瓶表面脱落。直接转移至15mL离心管中,吹打混匀约20次(吹散细胞团,分离成单个细胞)。③显微镜观察确认细胞均从培养瓶上脱落,加入2-3 mL ECM至培养瓶中润洗,然后转移至上述离心管中,吹打终止消化。④离心:120 rcf,1 min,25℃。(等待期间各加入250 L待测文库至低吸附离心管中,注意要快速,吸取之前需要先混悬文库)。⑤离心之后小心倒出,用枪吸出剩下的ECM,加入2V L BB,重悬吸打混匀,获得5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的细胞悬液。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞与文库结合[/size][/font][/align]①孵育:分别加入250 μL上述细胞悬液至250 μL ssDNA文库中,进行孵育:4℃,30 min,打开摇床第二格。②等待期间离心机调至4℃;用密封袋装好洁净的1000 L枪头准备流式上样用;2.2.2.5 润洗重悬细胞①取出孵育好的体系,进行离心:4℃,120 g,1 min(等待期间准备好4℃ PBS)。②倒掉上清液,用枪头小心吸出管口残留的上清液,每管加500 L PBS(4℃)用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]吸打重悬约20次。③再次离心4℃,120 g,1 min。④第二次重悬:重复①-③步骤。⑤每管加入500 L PBS重悬,忽略实验损失,最后得到理论细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的细胞悬液。[font='times new roman'][size=16px]2.2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]送样分析[/size][/font]FAM荧光染色较弱,在预处理之后应尽快进行流式分析,流式分析上样程序复杂,需要正确进行开机,测样,关机的步骤,才能够得到准确的数据。[align=left](1)准备工作:[/align][align=left]准备1000 mL[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url],1000 mL 洁净枪头,流式管,质控微球。[/align][align=left]①开启液流系统:由上至下打开流式细胞仪开关;再开启计算机,打开FACSDiva软件,在“Cytometer仪器框”中确认流式细胞仪已与电脑连接,启动液流之前,确认液流系统水平,进行补充鞘液、去离子水、乙醇以及漂水,并清空废液。[/align][align=left]在“Cytometer”菜单中,点击“Fluidics Startup(启动液流系统)”,按照提示进行操作:确定气路和液路是从乙醇桶连接到了鞘液桶上:将蓝色液路管接到过滤器下方,透明气路管接到鞘液桶上;确定闭合的喷嘴是在流动检测池上。[/align][align=left]②将70 m的喷嘴放入装有超纯水的烧杯中,超声30 s,用无尘纸蘸干;抽出闭合的喷嘴;插入70 m的喷嘴(红圈朝上)。[/align][align=left]③点击“×steam”,开启液流,出现水滴状,调整使上端横线位于第二个或者第三个水滴的尾部,下端横线位于第三个或者第四个液滴的中部,调整好后关闭液流。[/align][align=left](2)做质控:[/align][align=left]①用CS&T微球,用之前一定将微球甩匀(保证取出的微球呈均匀体系)用涡旋震荡;取一支洁净的流式管加入333 L的鞘液,再加一滴微球(用之前用混悬仪混匀,正常的微球为浑浊状)。[/align][align=left]②打开液流系统,在“Cytometer”菜单下点击“CST”;展开Setup Control窗口:在Characterize菜单中中选择“Check Performence”;在Configuration流式设置中:喷嘴的大小:选择70m,点击左下角“set configuration”,再点击“OK”。[/align][align=left]③选择微球的Lot ID:与微球瓶身上编号对应:10549。[/align][align=left]④敲弹准备好的微球悬液使其混匀,进行上样,打开液流;确认激发光源没问题即可关掉页面并关掉液流。[/align][align=left](3)上样:[/align][align=left]①新建样品,并勾选FITC、SSC、FSC的H、A、W、log数据项。[/align][align=left]②作图:建立散点图,横坐标为FSC-H,纵坐标为SSC-H;再建立一个图:横坐标:FITC-H,纵坐标为:Count。[/align][align=left]③打开液流至3,选择对应样品;吹打混匀并放置样品,点击“LOAD”上样。调整FSC和SSC的电压,使散点图的中的点都集中在所圈的门中。(若散点偏右,则FSC电压过大,调整FSC电压使其变小,若散点偏上,则调整SSC使其变小。)当调整合适时点击“RECORD”记录数据。[/align][align=left]④计数完毕,调低流速,点击“unload”,选择第二个样品并重复第③步。[/align][align=left]⑤上样完毕之后,保存数据。[/align][align=left](4)关机步骤:[/align][align=left]①上一管clean液,高速冲2 min;再上一管去离子水,高速冲5 min;关闭液流,检查液路系统。[/align][align=left]②在“Cytometer”菜单中,选择“shutdown”,根据指示操作:取下70 m的喷嘴,超声清洗,安装闭合喷嘴(红色点朝上)。[/align][align=left]③把液路和气路连接到乙醇桶上,用乙醇冲洗(先拔气路再拔液路)。[/align][align=left]④装一管clean液,清洗上样针和流动池。[/align][align=left]完成上述步骤之后即可关闭界面。[/align][align=left][/align][font='times new roman'][size=16px]2.3数据处理:[/size][/font]将原始数据用Flowjo软件进行处理,得到散点图以及荧光强度直方图,接下来通过举例来说明数据如何分析:(1) 散点图分析:[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026242555_5228_5413603_3.jpeg[/img][size=13px]数据处理分析散点图[/size][/align]该图为散点图,可以看出大体分为两个集团,散点图有两个集团说明体系中有两种细胞粒子,并且在该图片的左下角粒子较少,说明细胞碎片较少,在预处理时较好地保护了细胞的完整性。散点图中可以区分出整个上样的体系中主要含有两种大小的细胞颗粒,在预处理的过程中,无酶消化液的消化能力较弱,并且细胞团密度较大,细胞间黏连较多,在最后孵育结束用PBS进行重悬的时候仍然能够肉眼可见有白色细微絮状物。FSC值越大,代表颗粒的体积越大;SSC值越大,代表颗粒内部的复杂程度越高。故可初步判断,G1门中的颗粒为未消化完全的细胞团,而G2门中的颗粒为分散的单个细胞。(2) 直方图分析:[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026243736_5071_5413603_3.jpeg[/img][size=13px]数据处理分析直方图[/size][/align]图中为G2门选中的样品的荧光强度,该图中有两个峰,横坐标10[font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font]附近所产生的荧光峰可以判定是残留的细胞碎片,可视为背景值,横坐标10[font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font]~10[font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font]附近的峰代表四个适配体分别与细胞结合所产生的荧光强度,SYL3C-Aptamer结合偏移量最大,荧光较强,且高荧光事件次数较多,说明SYL3C-Aptamer与单个细胞的结合能力最强,并且G2门中的颗粒大多数为消化完全的单个细胞,呈现出较好的特异性。总之,该组结果对比体现出,单个细胞靶点较多,适配体与单个细胞结合能力较高,通过荧光强度波峰的偏移所反映的适配体与细胞特异性结合能力的大小依次为SYL3C-Aptamer>EP166-Aptamer>CA2-Aptamer>ARC1172-Aptamer。同时,由图中可以看出:10th-ssDNA pool与SYL3C-Aptamer在10[font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font]~10[font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font]荧光强度波峰较高,说明二者与单个细胞的结合能力较好,结合位点较多,呈现良好的特异性和亲和性。SYL3-Aptamer荧光波峰明显右移,与单个细胞的结合位点较多。[font='times new roman'][size=16px]三、总结[/size][/font]本次说明旨在利用带荧光的适配体靶向特异性结合目的细胞的原理,利用流式细胞仪监测适配体结合靶细胞能力的强弱,同时还可以应用于不同适配体靶向同一种细胞的结合能力强弱的比较。进一步利用流式细胞仪,还可以测定适配体的Kd值;还可以根据预处理的条件不同,与对照组比较,来测定适配体靶向细胞的受体是位于细胞膜表面还是细胞内,从而进一步测定适配体的生物学稳定性。同时,流式细胞仪还有很多方面的应用,例如鉴定细菌、检测细胞凋亡等,一些抗体-细胞复合物的结合情况也能够由流式细胞仪来进行监测。 在进行流式上样的过程中,预处理、上样以及数据处理阶段都有需要注意的细节,例如:本次所使用的细胞为贴壁生长的内皮细胞,故在细胞预处理时需要先消化细胞;在进行上样前,需要将样品进行吸打混匀,以免细胞沉积在流式管底部,导致未吸取到样品;在应用流式细胞仪的过程中,使用前的维护、质控流程十分重要,该流程会直接影响所得数据的稳定性;不同的流式细胞仪的维护程序稍有不同,本次说明中的使用方法只适用于BD FACSAria III,流式细胞仪具有强大的分析功能,其在细胞研究中具有重要的作用。[align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align]
Cellscreen系统第一次实现了可重复对细胞培养进行观察。无需染色、无需制样,通过光学图像分析将细胞培养的生长曲线保存;与其它现有测试方法相比,Cellscreen系统对细胞培养无损伤性,独立性。第一次实现了对同一细胞培养区域进行多次测量。Cellscreen技术证明是一种精确的、可靠的、自定义实验条件、操作方便、节省成本的方法。Cellscreen能优化和加速新产品和测试程序的开发。 Cellscreen应用领域 Cellscreen模块化设计能适用于更广范的领域,例如: 制药研究:Cellscreen系统能缩短常规科研究时间,能拍摄细胞生长因子的各种因素,如毒性测试及生物适应性的测试。 生物技术研究:Cellscreen系统适用于增殖研究、过程(培养基)最优化、质量控制。另外,用于拍摄克隆细胞实验的新性质,如应用在新的治疗蛋白和抗体的研究。 Cellscreen系统的优势: l缩短制药研发的时间周期 l对细胞培养无损伤—细胞可再用于其它研究 l可扩展的详细的结果描述,对细胞培养过程的文档和图像存档 l与现有的方法相比,更精确——可靠、重复性、自定义 l很容易融入到日常实验 l很容易操作Multiwellplate l特别低的操作成本-对所有的测量只需要一个培养皿,不需试剂、不需对细胞染色。 l节省时间—不需样品制备 l技术成熟—innovatesAG图像识别技术 l模块化设计—系统可扩展其它分析模块 Cellscreen系统模块化设计: 为满足广泛的分析需求,Cellscreen系统是按模块化设计,能运行不同的软件系统。硬件由一个双处理器电脑及控制单元组成,控制单元通过高精度电机台自动聚焦、自动调光来控制显微镜;不同的软件模块对数码相机获取的图像进行分析,分析所得的图像和数据存储在终端数据库。 软件模块包括: l悬浮细胞的增殖研究模块(PS模块) l贴壁细胞的增殖研究模块(PA) l克隆细胞实验模块(CL) 细胞增殖研究模块(PS和PA)能重复观测细胞培养的生长因子,CL模块观察克隆细胞,并能追随到起源的单克隆细胞。 克隆细胞实验模块(CL) 在整个培养过程中,CL模块自动监控单个克隆细胞到群体的生长过程;为了证明细胞群体的单克隆细胞起源,需要监控整个生长过程。 Cellscreen系统用40倍放大系数抓取容器低部的16幅图像,它能代表整个容器的状态。 所有获得的图像和数据存档到数据库,因此可以跟踪任何生物群体的成长过程,证明生物群体起源的单克隆细胞。 很好的保护—Cellscreen的培养器 Cellscreen的培养器精确的安装在显微镜上,在测量过程中,对您贵重的细胞培养,它保持一个稳定的环境。对温度和CO2的浓度能精确的控制。培养器可以长时间或频繁的监控微量滴定盘,而不需移动它。 贴壁细胞的增殖研究模块(PA) PA模块通过测量细胞覆盖区域,用户可以观察到贴壁细胞的增殖。PA以40放大倍数获得图像。系统可以自由选择培养皿的区域。这系统适用于所有通用的微量滴定盘规格(6-96眼)。结果以图像和曲线的形式表示出来。PA模块将所有的图像和结果存档,输出格式CSV(兼容Excel格式)。 PA模块精确的测量至少80%细胞的生长因子,用于科研、发展、研制新产品。 悬浮细胞的增殖研究模块(PS) PS模块通常应用在对细胞生长因子影响的研究。为了获得生长曲线,悬浮液里培育的细胞数量被重复的量化——时间、原料、操作的消耗成本。对同一培养皿里的细胞生长,PS模块能重复计数、消除对每次测量都需要更换盘子的影响。 另外,Cellscreen系统对每个细胞进行计数,相对现存的细胞计数方法,它有很高的精确性。PS模块用的是100放大倍数,它获得的图像有很好的分辨率,能提供出细胞直径和细胞形状的一些信息。 Cellscreen系统概述 很容易综合到您的日常工作中——易学易用 实验和测量的标准化 在准备阶段,用户按要求设定实验配置。对实验条件有详细选择和描述,例如:微量滴定盘上的哪个培养皿,培养皿里哪个区域需要检测;另外一些参数需要选定,如:体积、细胞类型、培养方法、细胞直径。因为无需吸液管,其它方法中隐含的误差就很容易避免。 图像清晰、分析准确 现在的测量方法里,用CCD相机拍摄图像,对每一幅图片用相同的技术指标聚焦。 Cellscreen精确的控制技术保证,在每一个测量过程中,准确的拍摄培养皿的同一区域;因此对每一选择的区域,用户可以跟踪细胞的生长过程;PS软件对选定区域的细胞进行计数;CL和PA软件用来测定克隆细胞和悬浮细胞的表面区域。 广泛和详细的结果陈述 用户可以选择结果的描述方式:如照片、生长曲线、细胞浓度曲线图或幻灯片,用来证明细胞生长发育的全过程。所有的信息,如实验设置、图像的获得、处理结果以及一些简单的实验文档都自动保存在终端数据库。
流式细胞仪的原理.
DHI测定设备主要由三部分组成,乳成分测定仪,体细胞测定仪和自动进样器,其中乳成分测定仪和体细胞测定仪则用同一个自动进样器。本文主要从体细胞测定仪的结构和工作原理分析阐述维修该设备的一些步骤。1、流式细胞仪的结构体细胞测定仪主要采用流式细胞仪OR术的原理。流式细胞术(flow cytometery, FCM)是20世纪70年代发展起来的一种可以快速、准确、客观,可同时检测单个微粒(通常是细胞)的多项特性,并加以定量的技术。流式细胞仪是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术为一体的新型高科技仪器设备。一般其结构分为3部分:样品室及液流驱动系统;激光光源及光学系统;信号检测、储存、数据处理系统。仪器内部光学结构见图1。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308071351_456588_1644065_3.jpg从图1可以清晰的看出仪器的内部结构。其中样品室(也称为观察室)是仪器的核心部件之一,在样品室中被检测样品与激光相交,而样品室由石英玻璃制成,其形状为细孔,只供单列细胞流过,检测区在该孔的中心,这种结构的样品室的光学特性良好,流速较慢,因而细胞受照射时间长,可收集的细胞信号光通量大,配上广角收集透镜,可获得很高的检测灵敏度和测量精度。图2为流式细胞仪的模拟图,从图2更能直观的看到仪器的构造。通过仪器的构造了解仪器的工作原理,为仪器的维修打下坚实的基础。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308071353_456590_1644065_3.jpg图2 流式细胞仪的模拟图1.1激光光源和光学系统目前流式细胞仪的光源采用激光(laser)光源。激光是一种相干光源,它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照,是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动,每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右,每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号的强弱,与被照射的时间和激发光的强度有关,因此细胞需要足够的光照强度。1.2流式细胞仪的分析原理经过染色液染色的样品溶液通过样品管被压进喷嘴的中央,同时无细胞的鞘液也被压入喷嘴,形成包绕细胞的鞘液流,使细胞以单列进入样品室,与水平方向的激光光束(波长488nm)垂直相交。稳定的液流推进装置,使染色的样品呈单列,每个细胞以均等的时间依次通过激光照射区。被荧光染色的细胞受照射后,产生两种信号,一种是散射光信号,其又分为前向散射光(Forward scatter,FSC)和侧向散射光(Side scatter,SSC),前者一般与细胞体积的大小呈正比,而后者与细胞的颗粒度和复杂性有关。2、故障分析2.1光源散射当用离子液或标样对体细胞进行测定时,如果测定结果偏低,其原因很有可能是激光聚焦的问题,发生激光的散射,导致结果偏低。其现象见图3。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308071357_456602_1644065_3.jpg[/