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一、目的要求 通过对分离真菌用的马丁氏(Martin)培养基配制,掌握对选择培养基的配制方法,并明确选择的原理。 二、基本原理 马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4•7H2O、孟加拉红(玫瑰红,Rose Bengal)和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源,蛋白胨主要作为氮源,KH2PO4和MgSO4•7H2O作为无机盐,为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂,对真菌无抑制作用,因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长,从而达到分离真菌的目的。 马丁氏培养基配方如下: KH2PO4 1g MgSO4•7H2O 0.5g 蛋白胨 5g 葡萄糖 10g 琼脂 15—20g 水 1000ml pH 自然 此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3.3ml。临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml。 三、器材 KH2PO4,MgSO4•7H2O,蛋白胨,葡萄糖,琼脂,孟加拉红,链霉素; 试管,三角烧瓶,量筒,玻棒,培养基分装器,扭力天平,牛角匙,高压蒸汽灭菌锅等。 四、操作步骤 1.称量和溶化 按培养基配方,准确称取各成分,并将各成分依次溶化在少于所需要的水量中。待各成分完全溶化后,补足水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的溶液,在1000ml培养液中加入1%的孟加拉红溶液3.3ml,混匀后,加入琼脂加热溶化(方法同实验十九)。 2.分装、加塞、包扎、灭菌,无菌检查与实验十九相同。 3.链霉素的加入 由于链霉素受热容易分解,所以临用时,将培养基溶化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液,在100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml,使每毫升培养基中含链霉素30μg。
市场上供应的大多数培养液的配方非常接近,这使得细胞很容易适应新的培养液。这里我将详细介绍一个方法,这个方法是保守的,在大多数情况下可以进行删减一些步骤。最简单最节省时间的情况是把细胞直接分装到新的培养液中,观察几代以保证细胞的生长参数是可以接受的。这个方法适于悬浮细胞,不过也很容易扩展到贴壁细胞。细胞的生长参数1. 翻倍时间( Doubling Time )细胞的翻倍时间在评价昆虫细胞健康程度的参数中是最容易测量的。翻倍时间应该在细胞处于对数期复制时测量,对于 Sf9 和 Sf21 细胞来说通常是介于 16-24 小时之间,不过大多数在 20-22 小时。dt=t × ln2/ln(Ct/Co) ,其中 dt 为翻倍时间, Co 为起始细胞数目, Ct 为经过时间 t 后的细胞数目, t 为 Co 和Ct 两次计数之间的间隔时间,所有的时间都以小时为单位。2. 细胞大小( Cell Size )细胞的大小是监测细胞健康程度的一个非常有用的参数。如果细胞是健康的,细胞的大小均一,都处于该细胞株体积正常变化范围的下限。细胞的大小在不同的细胞株变化是很大的。对于我用过的 Sf9 和 Sf21 ,典型的直径是 16-18 m m ,不过我知道有些细胞株小至 14 m m 或者大至 19 m m 仍然很健康。3. 滞后期( Duration of Lag )当细胞的密度较低时,会有一个滞后期,其长短取决于分装或者传代后细胞的密度。一般说来,该密度越低,滞后期越长。对于一个特定的细胞株来说,当这个密度高出一个阈值时,滞后期的长短与密度无关;而低于一个阈值时,滞后期无限长,细胞不再增殖。4. 低密度分装极限( Low Density Split Tolerance )能够在一个较短的滞后期(小于 12 小时)复苏的细胞形状较好。不过这是细胞株的特性,需要进行实验来确定你的细胞株的密度极限。我的细胞株有些在分装成密度为 5 × 104 细胞 /ml 时仍然可以很好复苏,有些细胞株分装成 5 × 105 细胞 /ml 就不能复苏了。5. 高密度极限( High Density Maximum )这是你的细胞能生长的最大密度,高于这个密度你的细胞将进入平台期。这个指标既和细胞株有关,又和使用的培养液有关。我建议先把你的细胞株培养至平台期,然后把一些分装到新鲜的培养液中以后,使剩下的继续生长至平台期,同时密切监测细胞状况。一般来说,细胞的培养要避免密度超过高密度极限的 80% 。对于我培养的细胞,这个极限值从 2 × 106 至 12 × 106 细胞 /ml 不等。实验步骤第一阶段:1. 准备合适体积的由 25% 体积新培养液和 75% 旧培养液(即细胞原先适应的培养液)组成的混合培养液 I。2. 将细胞以通常分装时使用的最低分装密度的两倍分装到混合培养液 I 中。3. 使细胞生长到通常培养时的较高密度,监测细胞生长参数。4. 继续以步骤 2 中的密度分装细胞到新鲜的混合培养液 I 中,直到生长参数达到可以接受的水平。有时候分装一次就可达到要求。5. 一旦细胞稳定下来,以通常使用的最低分装密度分装细胞至新鲜的混合培养液 I 中,同样监测细胞参数。6. 细胞达到较高密度后,继续以步骤 5 中的分装密度把细胞分装到新鲜的混合培养液 I 中,直到细胞的生长参数达到可以接受的水平。7. 如果细胞恢复到正常状态,进行第二阶段的实验。8. 如果细胞不能达到正常状态,新培养液可能不适于培养这种细胞。9. 如果细胞在新培养液中的生长参数达到平衡状态,虽然与正常状态不同,但是可以为实验接受,也可进行第二阶段的实验。第二阶段:1. 准备适量的由 50% 新培养液和 50% 旧培养液组成的混合培养液 II 。2. 将细胞以两倍最低分装密度分装至混合培养液 II 中。3. 如第一阶段一样,监测细胞生长指数,使细胞达到稳定状态。然后将分装密度降到最低分装密度,再使细胞达到稳定状态。第三阶段:步骤同第一阶段和第二阶段,使细胞适应混合培养液 III ( 75% 新培养液和 25% 旧培养液)。第四阶段:1. 步骤同第一阶段、第二阶段和第三阶段,使细胞适应新培养液。2 . 当细胞在新培养液中达到稳定后,监测细胞的生长指数,看是否波动过大。
实验开始时加入的氮经过培养一段时间后,想测定培养液中剩余的氮量,用什么方法和仪器好呢!谢谢!