马铃薯葡萄糖琼脂含氯霉

1.原理分析 本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。 该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌(e.coli)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。2.试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或者纯造就物穿刺接种并涂布于斜面置36±1℃造就18-24h观察结果3.化学性质 　　粉红色粉末，一种鉴别培养基，由牛肉膏、酵母菌膏、卵白胨、 胨、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硫酸亚铁、氯化钠、硫代硫酸钠、酚红、琼脂等配合制造而成。易吸湿，加水煮沸熔解后成橘红色半透明液体，pH约7.5，冷至45℃开始凝固。

三糖铁琼脂培养基( l ）成分 蛋白胨 20g 硫酸亚铁 0.2g 牛肉浸出粉 5g 硫代硫酸钠 0.2g 乳糖 10g 002％酚磺酞指示液 12.5ml 蔗糖 10g 琼脂 12～15g 葡萄糖 1g 水 1000ml 氯化钠 5g ( 2 )制法 除乳糖、蔗糖、葡萄糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解，调pH 值使灭菌后为7.3 士0.1 ，加入琼脂，加热溶胀后，再加入其余成分，摇匀，分装，121 ℃ 灭菌15 分钟，制成高底层（2 ～3cm ) 短斜面。( 3 )用途 用于初步鉴别肠杆菌科细菌对糖类的发酵反应和产生硫化氢试验。 方法和结果观察：取可疑菌落或斜面培养物，做高层穿刺和斜面划线接种，置35 ℃ 培养24～ 48 小时，观察结果。培养基底层变黄色为葡萄糖发酵阳性，斜面层变黄色为乳糖、蔗糖发酵阳性；底层或整个培养基呈黑色表示产生硫化氢。

食物中葡萄糖的测定葡萄糖氧化酶法 1.原理 葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质，此有色物质在625nm 波长下与葡萄糖浓度成正比。通过测定蓝色物质的吸光度可计算样品中葡萄糖的含量。 2.适用范围 适用于谷类、乳类、饮料、酒类等食物样品和血液样品。检出量为0.02 mg。 3.仪器 722分光光度计。 4.试剂： 除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。 （1） 乙醇。 （2） 40% 三氯乙酸：称取40g 三氯乙酸，用水溶解并稀释至100ml。 （3） 2 mol/L NaOH 溶液：称取8g NaOH， 用水溶解并稀释至100ml。 （4） 1 % 邻联甲苯胺溶液：称取0.1 g 邻联甲苯胺溶解于10 ml无水乙醇中，倒入棕色瓶中，4 ℃ 冰箱保存。 （5） 乙酸缓冲液 （pH 5.0）：称取14.28 g 乙酸钠 （CH3COONa• 3H2O）溶于水中，加入2.7 ml 冰乙酸，并调节pH 5.0， 用水定容至1 L。 （6） 葡萄糖氧化酶溶液：称取一定量的葡萄糖氧化酶（Sigma 公司）用水溶解，使酶含量为100 U/ml。4 ℃ 冰箱保存一周。 （7） 过氧化物酶溶液： 0.010 g 辣根过氧化物酶溶于10 ml 水中，4 ℃ 冰箱保存一周。 （8） 酶溶液：取100 ml 乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、过氧化物酶溶液各1 ml，混匀。4℃ 冰箱可保存七周。 （9） 酶空白液：取100 ml 乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、过氧化物酶溶液各1 ml，混匀。4℃ 冰箱保存一周。（注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶） （10） 葡萄糖标准液：将葡萄糖标准品（纯度大于99%）于80 ℃干燥至恒量。精确称取0.050 g，用水移入100 ml 容量瓶中，定容至刻度线。相当于浓度为0.5 mg/ml。 5.操作步骤： 5.1样品处理： （1）固体样品：称取0.5～5g已粉碎的样品于锥形瓶中，加入50ml水后沸水浴15min。冷却后，转移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反复摇动混匀样品，过滤，弃初始几滴滤液。收集滤液。如果滤液澄清，可直接或经进一步稀释后用于测定。如果滤液浑浊，吸取20ml滤液转移至另一容量瓶中，加入无水乙醇至刻度。混合后静置至少30min。过滤，滤液用于测定。 （2） 液体样品，寡糖、淀粉等碳水化物水解液：吸取2～10ml样品或水解液，加入4倍量乙醇，混和。静置至少30min，过滤后滤液备用。（如果过滤后滤液仍浑浊，或样液体积过少，可3000rpm离心15 min，上清液备用。） 注：样品处理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白质。 5.2测定：标准管和样品测定管，按下表所列操作（单位：ml） 试 剂 标准空白管 葡萄糖标准管 样品空白管 样品测定管 葡萄糖标准液 —— 0.1～0.5 —— —— 样品提取液 —— —— 0.5 0.5 水 0.5 补至0.5 —— —— 酶溶液 5 5 —— 5 酶空白液 —— —— 5 —— 上述试剂混合后37℃ 水浴反应 15 min， 625 nm 测定吸光度值。 （注意：葡萄糖与酶溶液的成色反应与反应时间密切相关，如反应时间过长，溶液颜色会由蓝转变成灰色，并慢慢产生沉淀，所以反应时间应严格控制好。） 6.计算 根据吸光度值求出葡萄糖标准曲线的回归方程，采用插入法求出样品测定管中葡萄糖含量，再根据稀释定容体积和称样量，计算出样品中葡萄糖含量。 计算公式： X= (As-Ab)×V×F×0.1 0.5×m 式中: X——样品中葡萄糖含量，g/100g As—— 由标准回归方程求出的样品测定管中葡萄糖含量，mg； Ab——由标准回归方程求出的样品空白管中葡萄糖含量，mg； V——样品定容体积，ml； F——稀释倍数 0.5——测定时吸取样品提取液的体积，ml； m——样品质量，g； 0.1——将mg/g转换成g/100g的系数。 7.注意事项 （1） 此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反应，特异性强，灵敏度高。 （2） 如果样品提取液为无色，无需做样品空白。但是有些样品颜色很深，如饮料、菌藻类食物，或样品提取液浑浊，往往干扰测定结果但又难以去除，所以测定这类样品时需做样品空白管以减少干扰。我想问一下： ---有一个37度水浴加热，到底要几分钟，一开始我加了15分钟，但加完后，上半部分就变灰黄色，但冷却时会重新变回绿色，这有影响吗？我后来又重配试剂作了一次，但刚把酶溶液加入葡萄糖标准溶液还没加热就变兰色了，后来只要加热几分钟颜色就会变灰黄，这怎么回事？还要加热吗？暂时就这些，希望大家帮忙，谢谢！！！