千金子二萜醇二乙酰苯甲酰

背景介绍蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）技术是目前小分子药物研发领域最火热的技术之一。它颠覆了传统药物化学中“占位驱动 (occupancy driven)”的开发理念，借助内源性的泛素蛋白酶体系统有效地特异性降解致病蛋白，尤其是“不可成药（undruggable）”靶点。如此优秀的技术，不但让国内外众多制药巨头和Biotech公司趋之若鹜，更为科学家们打开了新世界的大门。中国科学院司龙龙课题组刚刚在Nature子刊发表了基于PROTAC技术的流感疫苗[1]doi: 10.1038/s41587-022-01381-4，沈阳药科大学陈丽霞和李华团队又创造性地将这项技术引入到了中药研究领域，在Acta Pharmaceutica Sinica B（APSB）发表了题为“PROTAC Technology as a Novel Tool to Identify the Target of Lathyrane Diterpenoids”的研究论文 [2] doi: 10.1016/j.apsb.2022.07.007。中药活性成分和其作用靶点的鉴定均在中药研发领域具有重要的科学意义和实用价值。尤其是靶点鉴定，它是理解中药机制和下游药物开发的基础和关键。但由于中药“多靶点、多成分”的作用模式，以及与靶点蛋白瞬时、弱亲和力的相互作用，导致中药的靶点鉴定存在巨大挑战，亟需研究的思路创新和技术创新。PROTAC技术中的蛋白降解剂是一种含有两个活性端的小分子化合物，一个活性端可与靶蛋白结合而另一个活性端结合E3连接酶；两个活性端通过linker相连接。鉴于PROTAC分子往往无需很强的亲和力即可有效地特异性降解靶蛋白，沈阳药科大学的研究团队大胆猜想该技术可用于鉴定中药成分及天然产物的作用靶点。研究人员将PROTAC技术与定量蛋白组学、微量热泳动（MST）分子互作检测技术相结合，从被降解的差异蛋白中找到中药靶点，并通过下游的一系列分子、生物化学和动物实验得到了功能验证。该流程被研究团队称为“靶向降解组学”，可以为中药成分的靶点鉴定提供新的解决方案。实验解读沈阳药科大学陈丽霞和李华团队在前期研究中从中药千金子中获得了一系列千金烷二萜类化合物，其中ZCY-001化合物具有最强的抗炎活性，并且具有低毒性。研究人员将该化合物的核心骨架Lathyrol（即千金子二萜醇）与沙利度胺 (E3连接酶CRBN配体) 通过PEG linker相连，得到了PROTAC分子ZCY-PROTAC。使用该PROTAC分子对细胞进行处理后提取蛋白，并使用TMT串联质谱标签进行标记定量蛋白组学分析（图1 A）。比较蛋白组学分析发现MAFF蛋白在ZCY-PROTAC处理后发生了最为显著的降解。Western Blot结果也显示, MAFF蛋白的降解水平与ZCY-PROTAC的剂量和作用时间是正相关的（图1 B）。这些结果表明，该蛋白可能是Lathyrol等千金烷二萜类化合物的最主要靶点。图1 ZCY-PROTAC可显著降解MAFF蛋白为了验证比较蛋白组学发现的靶点蛋白，研究人员采用微量热泳动(MST）技术直接检测Lathyrol及其衍生物ZCY020与MAFF蛋白的结合能力。如下图所示，Lathyrol与MAFF的亲和力为20.90 μM，ZCY020对MAFF的亲和力也在同一水平。以上亲和力检测结果也通过表面等离子共振（SPR）、细胞热迁移分析（CETSA）以及DARTS等实验得到了验证。这些结果证实了MAFF蛋白是中药千金子成分的直接作用靶点。图2 微量热泳动技术（MST）检测中药千金子活性成分与MAFF蛋白相互作用研究人员进一步采用生化和药理学实验深入研究阐明了千金烷二萜ZCY020以MAFF为靶点蛋白, Nrf2/HO-1信号通路为作用途径发挥抗炎作用。ZCY02可以促进MAFF-Nrf2异源二聚体的形成而抑制MAFF同源二聚体，进而调节HO-1的下游表达，从而在体内外发挥抗氧化和抗炎活性。本研究创造性地将PROTAC技术应用在了中药成分靶点的鉴定上，首先以中药活性成分为基础合成出PROTAC分子探针，再通过蛋白的特异性降解来发现中药活性成分的靶点蛋白。以MST为代表的的分子互作检测技术在靶点验证中发挥了重要作用，可直接定量分析中药活性成分与靶点蛋白的亲和力。作者将这一系列技术手段整合为一套可行的中药成分靶点鉴定新方法，可以有力地补充甚至替代现有技术。关于Monolith新一代分子互作检测仪德国NanoTemper公司自2010年推出第一款基于微量热泳动技术的Monolith分子互作仪。随着工业用户的增多且对高通量检测的需求越来越迫切，NanoTemper公司于2014年推出了自动化的检测仪器Monolith NT.Automated。基于用户的反馈，在2020年对该产品线进行了全面升级，推出了全新的Monolith系列仪器。（点击图片，查看更多详情）产品特点：仅需微量样品，即可直接在溶液中测定分子间结合。无需固定，不受检测样品种类的限制。检测速度快、测量范围广 (Kd : 从pM到mM)。仪器操作简单，无需繁琐的清洗维护。参考文献[1] Si L, Shen Q, Li J, et al. Generation of a live attenuated influenza A vaccine by proteolysis targeting. Nat Biotechnol. 2022 Jul 4. [2] Wu Y, Yang Y, Wang W, et al. PROTAC Technology as a Novel Tool to Identify the Target of Lathyrane Diterpenoids. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2022 Jul 16.

2013年6月15日，据欧盟网站消息，欧盟发布(EU)No 545/2013号委员会条例，修订了(EC)No 1334/2008号食用香精香料法规，禁止2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩(3-acetyl-2,5-dimethylthiophene)作为食用香料用于食品。 　　据欧洲食品安全局2013年5月15日公布的2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩评估结果，2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩在体内外试验均具有致突变性，因此本法规将其从许可香料清单中删除。 　　同时，禁止2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩作为食用香料投放市场或用于食品；禁止含有香料物质2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩的食品投放市场，禁止2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩作为香料进口或含有2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩的食品进口。 　　对于在本法规生效前上市的含有2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩的食品可在其保质期内进行销售；本法规生效前进口的含有2,5-二甲基-3-乙酰基噻吩的食品不适用于本法规。 　　本法规自公布之日起生效。

步琦SFC系统纯化利多卡因与乙酰氨基酚SFC应用”1简介药物是一种由化学或生物来源制成的产品，用于人类或动物的医疗治疗，这些药物往往以化学合成的形式来生产。化学合成是一种通常伴随着杂质存在的过程，因为产率很少是 100%。这些杂质可能会对最终产品的疗效、安全性和质量产生重大影响。因此，对药物进行纯化以确保合成化合物的纯度和完整性是至关重要的，药物的纯化可以通过色谱法等多种方法进行。最近，超临界流体色谱（SFC）已经作为一种替代反相液相色谱（RP-HPLC）的方法出现。SFC 使用超临界二氧化碳作为流动相的一部分，这是一种清洁且环保的溶剂，很容易从最终产品中去除。此外，SFC 结合了气相色谱和液相色谱的优点，在提供高分辨率的同时也能以更快的速度分离样品。在 SFC 的方法开发过程中，最大的难点在于没有一种通用的固定相。因此需要在不同的固定相上进行筛选，以确定要分离的样品的最佳选择性。CO2 的低极性溶剂特性允许在色谱柱筛选时同时考虑非极性和强极性的固定相。在确定最佳固定相后，就可以进一步放大到制备规格。在本次应用中，我们会例举利多卡因和乙酰氨基酚的合成案例，利用 SFC 系统来高效去除合成过程中的杂质，获取高纯度目标化合物。在这一过程中，需要先进行合适色谱柱的筛选，再放大至制备色谱的规格。2设备BUCHI Sepmatix 8x SFC 8通道平行色谱系统BUCHI Sepiatec SFC-50 超临界制备色谱系统BUCHI PrepPure 硅胶，5um,250×4.6mm BUCHI PrepPure 二醇基，5um,250×4.6mm BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×4.6mm BUCHI PrepPure 2-EP，5um,250×4.6mm HILIC柱，5um,250×4.6mm (Dr. Maisch GmbH)BUCHI PrepPure PEI，5um,250×4.6mm BUCHI PrepPure CBD，5um,250×4.6mm 氰基柱，5um,250×10mm ，(Dr. Maisch GmbH)BUCHI PrepPure PEI，5um,250×10mm BUCHI PrepPure 氨基，5um,250×10mm3化学品与样品化学品：二氧化碳 (99.9%)甲醇 (≥99%)甲醇溶液中2M的氨溶液甲酸（99%）去离子水为了安全处理，请注意所有相应的MSDS！样品：乙酰氨基酚合成产物利多卡因合成产物4程序设定BUCHI Sepmatix 8x SFC平行色谱系统流动相：A= 二氧化碳；B= 甲醇柱尺寸：250×4.6mm流速：3mL/min（每根色谱柱）检测：DAD 紫外扫描 200 nm - 600 nm流动相条件：0&minus 0.5min5%B0.5 – 8.0 min5 – 50 % B8.0 – 9.4 min50 % B9.4 – 9.5 min50 – 5 % B9.5 – 10 min5 % B筛选过程完全自动运行，流速设置为 3mL/min 每通道，使用流控单元，平衡每一根色谱柱。样品自动注入（V = 5 μL），并开始平行筛选（运行时间 =10min）。背压调节器设置为 150 bar，柱子加热至 32℃，可按需往改性剂中加入添加剂改善峰型。BUCHI Sepiatec SFC-50超临界制备色谱系统流动相：A= 二氧化碳；B= 甲醇柱尺寸：250×10mm流动相条件：等度运行条件检测：紫外所有 10mm ID 色谱柱都在预设流速下平衡 3 分钟，使用自动进样器上样，并开始运行。背压调节器设置为 150 bar，柱子加热至 40℃，可按需往改性剂中加入添加剂改善峰型。5结果5.1 乙酰氨基酚乙酰氨基酚（下称 AA），也常被称为对乙酰氨基酚，是一种镇痛剂、解热剂和手性药物。它属于非阿片类镇痛剂这一类。在化学上，它可以通过对氨基苯酚（下称 AP）与乙酸酐的反应来合成，在此过程中发生 N-乙酰化（见图1）。为了确定乙酰氨基酚合成产物的最佳纯化分离固定相，首先进行了柱筛选（见图1）。▲ 图 1：顶部：乙酰氨基酚合成的反应方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 仪器色谱柱筛选结果；从左到右：硅胶，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI和CBD；运行时间 = 10分钟。图1显示，二醇基和 2-EP 相并未表现出分离度，硅胶相、CBD 相、氰基相和氨基相未显示出理想的分离度，因为它们无法实现基线分离。HILIC 和 PEI 相具有良好的选择性和分辨率，且分辨率始终远高于 1.5（见表1）。1.5 的分辨率意味着可以很好地分离 2 个峰。表1 还显示了洗脱顺序，氰基相显示出相反的洗脱趋势，对氨基苯酚先洗脱，然后是对乙酰氨基酚。筛选结果表明，反应并非百分之百完全，因为产物中仍含有大量对氨基苯酚。▲ 表1：样品在不同固定相色谱柱条件下的分辨率值和洗脱顺序选择 PEI 相色谱柱放大至制备规格，因为它具有最高的分辨率（见图2）。根据筛选时的色谱图，我们可以确定 AA 和 AP 在甲醇为 35&minus 40% 之间洗脱。图2（顶部）显示了在 40% 甲醇等度条件下，在10 x 250mm 的PEI 色谱柱上对 AA 进行纯化的情况，结果显示 AA 和 AP 可以非常良好地分离。因此在相同的条件下，可以实施一个堆叠注射方法，用于自动纯化并收集 AA （见图2，底部）。▲ 图2：单次注射（顶部）和堆叠注射（底部）用于AA的纯化；运行条件：流速=30 mL/min， 甲醇= 40 %，温度 = 40 ℃，压力BPR = 150 bar，注射 = 250 µ L，UV波长 = 254 nm；堆叠注射条件：注射次数 = 10，堆叠时间 = 1.8 min，Fractions = 1（基于时间的）。5.2 利多卡因利多卡因（下称 L），化学名为 2-二乙基氨基 -N-(2,6-二甲基苯)乙酰胺，是一种用作局部麻醉剂和抗心律失常药物的药物，它作为钠通道阻断剂起作用。利多卡因可以通过两步合成过程生产（见图3）。第一步中，2,6-二甲基苯胺（下称 X）的氨基组团被酰化 。第二步中，中间产物（下称 IP）通过与二甲胺的亲核取代反应转化为利多卡因。因此，需要进行两步纯化过程。色谱柱筛选的结果如图3所示，筛选过程中，在改性剂甲醇中始终添加 20 毫摩尔氨水作为碱性添加剂。▲ 图 3：顶部：利多卡因合成的反应方程式，底部：Sepmatix 8x SFC 仪器色谱柱筛选IP与利多卡因结果；从左到右：硅胶，氨基，二醇基，氰基，2-EP，HILIC，PEI 和 CBD；运行时间 = 10分钟。从结果来看，所有色谱柱都可用于中间体 IP 的第一步纯化分离，因为都具有基线分离的效果。其中氨基相具有最高的分辨率，且在甲醇比例较低时就能出峰（见图3）。对于第二步利多卡因的纯化，氰基和CBD相无法实现基线分离，而氨基再次表现出最佳的分离度（见表2）。在洗脱顺序上，第一步中间体的纯化出峰顺序都是先 X 再 IP，而第二步的利多卡因的纯化除了硅胶相之外都是先 L 再 IP（见表2）。▲ 表2：样品在不同固定相色谱柱条件下的分辨率值和洗脱顺序最终选择 10 x 250mm 的氨基色谱柱进行制备纯化，因为它的分辨率总是最高的（见表2）。氨基柱筛选结果显示，X 和 IP 出峰时的甲醇比例约为 10 - 19%，L 和 IP 出峰时的甲醇比例约为 11 - 19%。图 4 a) 显示的是甲醇比例为 16% 等度条件下的 IP 的单次纯化分离图谱，图 4 b) 显示的是甲醇比例为 20% 等度条件下的 L 的单次纯化分离图谱。在相同的条件下，可以进行叠层进样分离，分别自动纯化 IP 和 L，并进行馏分收集（见图 4 c) 和 d)）。▲ 图4：中间体 IP 的单次进样（a）和叠加进样（c）；运行条件：流速 = 20 mL/min，改性剂 = 甲醇 + 20 mM 氨水，改性剂 % = 16 %，温度 = 40 °C，压力 BPR = 150 bar，进样量 = 170 μL，紫外波长 = 254 nm；叠加进样条件：进样次数 = 15，叠加时间 = 0. 75 min, Fractions = 1 (基于时间) 利多卡因L的单次进样 (b) 和叠加进样 (d) 运行条件：流速 =20 mL/min, 改性剂 = 甲醇 + 20mM 氨水, 改性剂 % = 20 %, 温度 = 40 °C 和压力 BPR = 150 bar, 进样 = 170 μL, 紫外波长 = 254 nm 叠加进样条件：进样次数 = 20, 叠加时间 = 0.65 min, Fractions = 1 (基于时间)。6结论在进行有机合成后，由于副反应或转化率未达到 100%，通常仍会存在杂质，这些杂质必须去除，尤其是在药品生产中。在药物合成研发领域，时间与效率至关重要。BUCHI 的 SFC 色谱解决方案为研发人员提供了强大的工具，通过 Sepmatix 8x SFC 色谱柱筛选系统与 Sepiatec SFC-50 制备色谱系统相结合，可快速筛选出合适的色谱柱并线性放大至制备规格。SFC-50 的叠层进样功能，不仅能实现无人值守自动分离，还可显著提高分离效率，从而加快药物合成研发的速度。7参考文献Medikamente & Medizinprodukte (admin.ch) (Status 23.11.2023).https://doi.org/10.1016/j.chroma.2011.09.029https://doi.org/10.1016/j.chroma.2012.06.029https://doi.org/10.1016/j.chroma.2005.03.073https://doi.org/10.1016/j.jpba.2007.08.013.PRACTICAL APPLICATION OF SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY FOR PHARMACEUTICAL RESEARCH AND DEVELOPMENT, Vol. 14, M. Hicks and P. Ferguson, 2022 Elsevier Inc.Th. Eicher und H. J. Roth Synthese, Gewinnung und Charakterisierung von Arzneistoffen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1986).The synthesis of Lidocaine (University of San Diego).Winterfeld, K. – Praktikum der organisch-prä parativen Pharmazeutischen Chemie, 6. Auflage, Steinkopff Verl., Darmstadt (1965).Axel Kleemann, Jürgen Engel, Bernd Kutscher und Dietmar Reichert: Pharmaceutical Substances, 4. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (2000).