自发荧光

重组人红细胞生成素（rhEPO）是全球最重要的生物制品之一，可用于治疗由慢性肾脏病、肿瘤化放疗或骨髓增生症导致的贫血。rhEPO是一种高度糖基化的糖蛋白药物，几乎rhEPO分子量的一半是由翻译后修饰的多糖组成。这些多糖包括N端链接寡糖链，其末端为唾液酸残基。唾液酸残基在控制rhEPO在体内半衰期起重要作用，并且影响其稳定性和电荷异质性。 电荷异质性（电荷变异体），即蛋白质表面电荷的改变。改变可以是由于电荷数量增减的直接改变，也可以是由于蛋白构象改变而间接引起的改变。产生电荷异质性的原因有很多，例如异构化、氧化、聚合、末端改变、脱酰胺化和糖基化等。 rhEPO电荷变异体产生最主要的原因是其高度糖基化，尤其是高度唾液酸化。电荷异质性是反应糖基化水平的重要表征之一，属于关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQA），监管机构要求必须在整个生产和贮存中对rhEPO的电荷异质性进行检测和表征。使用CZE方法表征rhEPO存在如下难点制剂中rhEPO含量相对较低，μg级别，需要浓缩样品提高检测灵敏度；制剂中含多种辅料组分，可能会对分析结果造成干扰。例如，促红素制剂中含有mg级别的人血白蛋白（HSA），使用CZE方法会对结果造成干扰；CEZ方法需对样品进行复杂前处理，去除辅料干扰。NIFDC解决方案 2021年，中国食品药品鉴定研究院（NIFDC）依据ICH（国际人用药品注册技术协调会）指导原则，利用全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术（iCIEF）自发荧光通道表征8种商品化rhEPO电荷异质性，并评估该方法的精密度、准确性、线性、范围和耐用性。 紫外吸收UV280nm是经典icIEF等电聚焦电泳检测通道。而自发荧光（NIF：Native Fluorescence）是指利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现检测，无需添加染料，提高检测灵敏度。 结果表明，对比CZE-UV（毛细管区带电泳-紫外）方法，iCIEF方法自发荧光通道检测具有更高的分辨率和灵敏度，同时具有快速检测、无需样品前处理、消除辅料干扰等优势。结果展示图1. A：紫外通道检测 B：自发荧光通道检测 图1结果显示，紫外通道检测（A）的信号很低；自发荧光通道检测（B），可以明显看到信号增强，且各个变异体分离效果较好。表1. 紫外通道检测和自发荧光通道检测对比 研究结果表明，两种通道检测下各变异体峰面积比例含量完全一致（表1）。图2. 自发荧光通道检测不同浓度样品表2. 文献报道其它方法定量限 研究人员考察了利用自发荧光通道检测1.25μg/m至20μg/ml浓度范围内样品（图2），各变异体面积比例含量和浓度线性关系良好，R方均不低于0.99。该方法定量限（LOQ）为0.1ug/ml（表2），根据文献报道显示，本方法灵敏度为最高。图3. 不同稀释度下的回收率 研究人员配制了7个不同浓度的样品对该方法准确性进行验证（图3），通过实际测定总峰面积和理论总峰面积来计算回收率，回收率在80-105%之间。图4. 耐用性评估 研究人员对方法耐用性进行评估（图4），比较不同两性电解质浓度、尿素浓度、不同毛细管以及不同样品放置时间情况下的各变异体等电点和峰面积百分比的差异。结果表明，变异体等电点差异不超过0.1，峰面积百分比RSD%不超过5%，方法耐用性良好。图5. 自发荧光检测模式表征8种商品化rhEPO电荷变异体 为了证明该方法对商品化rhEPO表征的适用性，研究人员利用所建立方法，对不同企业的8种商品化rhEPO电荷变异体进行表征（图5）。DP1-6有相似峰型，在DP3和DP6中，有一额外明显的小峰。DP7峰形独特，可能由于与其他DP相比糖基化不同所造成。结论 NIFDC利用ProteinSimple全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术自发荧光检测通道建立并证明了用于rhEPO电荷异质性表征的方法平台。该平台有如下特点：无需样品预处理，可直接表征rhEPO；自发荧光通道检测的rhEPO峰型与紫外吸收通道检测得到的峰型相同；与CZE-UV或icIEF紫外吸收通道检测相比，自发荧光检测灵敏度更高；不受高浓度辅料干扰（如人血清白蛋白和聚山梨酯，会干扰CZE分析，CZE 分析前，须通过多步分离步骤去除这些辅料）；该平台方法快速且操作简易。扫描下方二维码，获取ProteinSimplerhEPO表征解决方案参考文献：1. Li, Xiang et al. “Capillary isoelectric focusing with UV fluorescence imaging detection enables direct charge heterogeneity characterization of erythropoietin drug products.” Journal of chromatography. A vol. 1643 (2021): 462043.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

近日，中国科学院上海光学精密机械研究所高功率激光单元技术实验室陈丹平研究员团队发现BaF2-B2O3玻璃的橘红色自发光现象，相关研究成果发表于Journal of Non-Crystalline Solids。稀土离子4f壳内强烈而尖锐的电子跃迁，使其常被用来制备激光材料和荧光粉。但是稀土掺杂的LED材料面临着两个问题，一是由于荧光粉涂层透明度较低，光散射较大，导致LED的发光效率降低。二是稀土材料的不可再生性以及环境污染问题。开发较为环保的无稀土高效荧光LED材料成为以后的研究方向。 　　本研究发现，在CO还原气氛下制备的不含稀土离子的透明BaF2-B2O3玻璃体系在近紫外光下表现出橙红色自发光，在约397 nm的宽带光激发下，产生以650 nm为中心的550~850 nm宽带发光。图1 玻璃样品在(a)365 nm紫外灯和(b)日光灯下的照片 图 2(a)xBaF-C玻璃的激发光谱；(b)xBaF-C 和40BaF-A玻璃的荧光光谱 　　为了探究自发光现象的机理，研究人员在还原气氛和空气气氛下的进行了对比实验。并基于荧光光谱、电子自旋共振、拉曼和X射线光电子能谱的结果，推断在还原气氛导致玻璃中B3+被还原为B2+，B2+的s→p跃迁引起的荧光发射。本论文提出B2+的发光现象，为此玻璃发光现象的研究提供新的思路。该研究开发的橙色自发光玻璃材料，无稀土离子掺杂、透明性高、原料成本低、制备工艺简单、具有较宽的荧光发射带，在新型橙光LED玻璃中具有潜在的应用前景。图3 40BaF-C和40BaF-A样品电子顺磁共振谱图4 (a)40BaF-C和(b)40BaF-A样品的B 1s XPS图谱

颜色是商品外观设计的重要属性。彩色的电子产品金属外壳不仅满足了人们的审美需求，也增加了商品的附加价值。电化学沉积是目前广泛应用的金属合金表面着色技术，其颜色来自于由表面氧化层厚度决定的可见光干涉。由于该氧化层的厚度在产品的使用过程中不会改变，因此，该技术实现的产品颜色在使用过程中是固定的。　　近期，中国科学院物理研究所/北京凝聚态物理国家研究中心极端条件物理实验室的博士研究生王朋飞在导师、特聘研究员孙永昊和研究员白海洋的共同指导下，与来自物理所、中国科学院大学、钱学森空间技术实验室和杨伊万格利斯达浦金野大学的科研人员合作，发现了一种可以在自然条件下自发改变颜色的金属材料。这种金属材料的表面颜色几乎每周一变。该材料色泽均匀明亮、其表面在磨损后可自行修复重现颜色，且在紫外光下具有荧光效果。　　这种金属材料的可自发改变颜色特性来自该合金在室温条件下持续且不中断的自发氧化。这是一种由稀土元素铈作为主要组元的非晶合金。它由于具有铈的化学活性，因此在室温下具有高的氧化速率，由于非晶结构中均匀的缺陷分布，所以避免了如多晶合金中因局域缺陷位置快速氧化带来的锈斑，使得非晶合金的表面氧化层厚度均匀。研究人员通过在铈基非晶合金中掺杂钇，可加快该金属材料在自然条件下的变色，实现了对其变色速率的调节。图1. 不同钇元素掺杂的彩色金属玻璃宏观光学照片和光致发光现象图2.（a）无、（b）有钇元素彩色金属玻璃颜色随时间变化规律图3.高纯铈、非晶态铈基合金与同成分晶态铈合金的氧化动力学行为；非晶态铈基合金与同成分晶态铈合金经氧化后的光学照片　　中科院院士、物理所研究员汪卫华带领的非晶合金团队在稀土基非晶合金的研究中具有丰富的经验，主要研究成果曾多次发表在Phys. Rev. Lett.、Nat. Communs.等上，相关工作曾入选中国科学十大进展。可以自发改变颜色的金属材料的发现为稀土基非晶合金在功能材料的应用上添砖加瓦。该研究成果不仅说明了稀土基非晶合金在外观应用上的独特优势，也发现非晶合金可作为某些功能材料的前驱体，无论是在应用还是在基础研究上均具有潜力。　　研究工作获得国家自然科学基金等的支持。相关研究成果发表在Journal of Alloys and Compounds上。论文链接：https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0925838821015486