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[size=18px][b][b]一、实验原理[/b][/b][/size] [b][size=17px]1.适用范围:[/size][/b][size=17px]芽孢染色法适用于能够形成芽孢的各类芽孢杆菌。[/size] [b][size=17px]2.原理:[/size][/b] [size=17px](1)芽孢染色法属于复[/size][size=17px]染色法,是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理,用不同染料进行着色,使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。[/size] [size=17px](2)芽孢壁厚、透性低,着色、脱色均较困难,因此,当先用一弱碱性染料,如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时,此染料不仅可以进入菌体,而且也可以进入芽孢,进入菌体的染料可经水洗脱色,而进入芽孢的染料则难以透出,若再用复染液(如番红液)或衬托溶液(如黑色素溶液)处理,则菌体和芽孢易于区分。 [size=17px](3)芽胞具有高度的折光性,外膜致密,渗透性低,故普通染色法不易使其着色,芽胞染色法是根据芽胞既难以着色,而一旦着色又难以脱色的特点设计的。所有芽胞染色法都基于同一个原则:采用着色力强的染料,并加热以促进标本着色,然后使菌体脱色,而芽胞上的染料仍保留,经复染后,菌体和芽胞呈现不同的颜色。[/size] [size=17px][b][b][size=17px]二、染液的配制[/size][/b][/b][/size] [b][size=17px]1.5%孔雀绿水溶液:[/size][/b][size=17px]孔雀绿5.0g,蒸馏水100mL。[/size] [b][size=17px]2.0.5%番红溶液:[/size][/b][size=17px]番红O(safranine,又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL,溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中,用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。[/size] [size=17px][b][b][size=17px]三、应用[/size][/b][/b][/size] [size=17px]芽孢染色法是生物学和医学领域中常用的实验技术,用于观察和研究细胞的结构和功能。芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是鉴别细菌的重要依据。[/size] [size=17px][b][b][size=17px]四、实验步骤 [/size][/b][/b][/size] [b][size=17px]1.[b]制[/b][/size][/b][size=17px][b]片[/b]:取洁净的载玻片,在载玻片上滴加一滴生理盐水,然后用接种环蘸取少量芽孢菌跟水混匀,晾干,用酒精灯固定。[/size] [b][size=17px]2.[/size][/b][size=17px][b]浸染[/b]:将固定好的涂片放入含5%孔雀绿水溶液的50[/size]℃水浴染色缸中,浸染15min。[size=17px]或者在涂片上滴加孔雀绿,用酒精灯加热,切勿干涸,要保持涂片湿润。 [/size] [b][size=17px]3.[/size][/b][size=17px][b]冲洗[/b]:取出载玻片,用水冲洗多余染液,直至出水无色为止。[/size] [b][size=17px]4.[/size][/b][size=17px][b]复染[/b]:0.5%碱性番红复染1min。[/size] [b][size=17px]5.[/size][/b][size=17px][b]冲洗[/b]:用水冲洗多余染液,直至出水无色为止,晾干。[/size] [b][size=17px]6.[/size]镜检:[/b]先低倍镜找到区域后,换油镜观察芽孢和菌体。[size=17px]菌体呈红色或粉色,而芽孢呈绿色。[/size] [size=18px][font=system-ui, -apple-system, BlinkMacSystemFont, &][b]五、[/b][/font][font=system-ui, -apple-system, BlinkMacSystemFont, &][b]注意事项和操作技巧[/b][/font][/size] [size=17px]1.选用适当菌龄的菌种,幼龄菌尚未形成芽孢,而老龄菌芽孢囊已经破裂。 [/size] [size=17px]2.加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态,加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂,加热不够则芽孢难以着色。[/size]加热过程中要及时添加染色液,切勿让标本干涸。 3.芽孢观察也可以直接使用简单染色法。比如用番红或结晶紫染色后,芽孢不着色,菌体染色。[/size]
一、目的要求 学习并掌握芽孢染色法。 二、基本原理 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理,用不同染料进行着色,使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低,着色、脱色均较困难,因此,当先用一弱碱性染料,如孔雀绿(malachite green)或碱性品红(basicfuchsin)在加热条件下进行染色时,此染料不仅可以进入菌体,而且也可以进入芽孢,进入菌体的染料可经水洗脱色,而进入芽孢的染料则难以透出,若再用复染液(如番红液)或衬托溶液(如黑色素溶液)处理,则菌体和芽孢易于区分。三、器材 枯草芽孢杆菌,蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),生孢梭菌(Clostridium sporogenes); 孔雀绿染液,番红水溶液,苯酚品红溶液,黑色素溶液等。 四、操作步骤 方法1、 (1)将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌,作涂片、干燥、固定。 (2)滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。 (3)用木夹夹住载玻片在火焰上加热,使染液冒蒸汽但勿沸腾,切忌使染液蒸干,必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不加热,改用饱和的孔雀绿水溶液(约7.6%)染10分钟。 (4)倾去染液,待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。 (5)用番红水溶液复染1分钟,水洗。 (6)待干燥后,置油镜观察,芽孢呈绿色,菌体呈红色。 方法2、 (1)取二支洁净的小试管,分别加入0.2ml无菌水,再往一管中加入1—2接种环的蜡状芽孢杆菌的菌苔,另一管中加入1—2接种环的生孢梭菌的菌苔,两管各自充分混合成浓厚的菌悬液。 (2)在菌悬液中分别加入0.2ml苯酚品红溶液,充分混合后,于沸水浴中加热3—5分钟。 (3)用接种环分别取上述混合液2—3环于两片载玻片上,涂薄,风干后,将载玻片稍倾斜于烧杯上,用95%乙醇冲洗至无红色液流出。 (4)再用自来水冲洗,滤纸吸干。 (5)取1—2接种环黑色素溶液于涂片处,立即展开涂薄,自然干燥后,油镜观察,在淡紫灰色背景的衬托下,菌体为白色,菌体内的芽孢为红色。
[size=12px][b][b]一、形态学特征[/b][/b] 形态学鉴别菌种是最直接的方法,也是最简单的方法。[b][color=#000000][b][color=#000000][b]1.菌落特征[/b][/color][/b][/color][/b]不同的菌种在不同培养基上菌落形态不同,这是鉴别所有菌种的特征之一。不同的芽孢杆菌,菌落的大小、颜色、凸起、边缘形状等也不同。因此,根据菌落形态可以区分不同的芽孢菌种。有的边缘整齐,有的边缘呈锯齿状,特征非常明显。拿到菌种,记住菌落形态或拍照记录很重要。[b][color=#000000][b]2.芽孢位置[/b][/color][/b]芽孢杆菌,属于革兰氏染色阳性菌,最大的特点就是能够产生芽孢,不同的芽孢杆菌芽孢出现的位置不同,这是鉴别芽孢杆菌的重要特征之一。有的芽孢在菌体的中部、有的在菌体一侧或顶端。可以按照芽孢的位置区分是否属于自己的菌种。观察芽孢可以采用简单染色法也可以采用芽孢染色法。 [b][b]二、生化生化特征[/b][/b] 相比形态学特征,生化特性比较繁琐,但是鉴别芽孢杆菌的重要方法。通过分析芽孢杆菌分泌的代谢产物,比如说酶活、条带的位置、抑菌圈、有机酸等,鉴别是否是目标产物,进而鉴别是否是自己的菌种。 [b][b]三、分子生物学手段[/b][/b] 如果形态学方法和生理生化方法不能鉴别,只能采用分子生物学手段。每个菌种的遗传物质都不同,常采用16S rDNA测序,跟已知序列进行比对后,可以准确地定位芽孢杆菌的种属,这是鉴别菌种最重要的方法。 [/size]