细胞克隆

概念：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

[size=16px]克隆形成实验[/size][size=16px]及划痕实验[/size][size=16px]、[/size][size=16px]流式细胞术[/size][size=16px]操作步骤[/size]软琼脂克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力软琼脂克隆形成实验适用于悬浮生长的细胞。1. 配胶液：用蒸馏水和琼脂糖粉配制浓度为 0.3% 的琼脂糖液，高压灭菌，置于42℃ 水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。2. 配制含 20% FBS 的 2×1640 培养基，用 0.22 ?m 的滤器过滤除菌。3. 铺下层胶：将 0.6% 的琼脂糖胶液与 2×1640 培养基等体积混合，以每孔 1.5mL 加至 6 孔板中，室温等其凝固。4. 细胞计数：将细胞用 PBS 洗一遍，离心，加入新的培养基混匀稀释，计数。H69-NC、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2 均以 1×104/孔铺入 6 孔板。5. 铺上层胶：将 0.3% 的琼脂糖胶液与 2× 培养基 1：1 混合，加入 100 μL 细胞悬液，混匀后，每孔加入 1.5 mL 混合液。6. 放入 37℃，5%CO2 培养箱培养，约 2-3 周后终止培养。7. 比较细胞克隆形成能力的差异，利用 Graphpad prism5 作图计算两种细胞克隆形成能力的差异。平板克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力平板克隆形成实验适用于贴壁生长的细胞。1. 细胞处理：将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞，用 PBS洗一遍，用胰酶消化并计数。2. 接种细胞： 将细胞接种于 6 孔板中， SW1271-NC 、SW1271-shMSI1-1 、SW1271-shMSI1-2 接种密度为 3×103/孔，注意一定让细胞均匀分布。于 37℃，隔离CO2 静置培养 2-3 周（终止培养时间以不小于 2 周且克隆之间不发生融合为标准）。3. 出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去旧培养基， 用 PBS 清洗 2 次，用 4% 多聚甲醛固定液固定 20 min，吸除固定液，用蒸馏水清洗 2 次后加适量结晶紫染色15-20 min，用蒸馏水洗去结晶紫，自然风干，用扫描仪扫描成图片。4. 在低倍镜下计数大于 50 个细胞的克隆数。5. 计算克隆形成率。细胞划痕实验1. 用记号笔在 12 孔板底部划两条平行线做为标记。2. 将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞接种至 6 孔板。3. 待细胞汇合度为 90% 左右时，用 10μL 枪头垂直于两条平行标记线进行划痕。4. 吸除培养基，1xPBS 漂洗 2 次，并换用无血清培养基培养。5. 分别在划痕后培养 0h，12h，24h，48h，72h 观察细胞迁移情况并拍照。流式细胞术1. 收集 H69、H82、H526、SW1271 的对照组和实验组细胞(包括培养上清中的细胞)，收集 1 - 10 ×105 个细胞，用预冷 PBS 离心洗涤。用双蒸水稀释 5 ×Binding Buffer为 1 × 工作液，取 500 μl 1 × Binding Buffer 重悬细胞。2. 每管加入 5 μl Annexin V-APC 和 10 μl 7-AAD。3. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 5 分钟。4. 上机进行分析。