沙丁胺醇受体激动剂

LC-MS/MS法测定火腿肠中的3种&beta -受体激动剂（沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺） 仪器：液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）； 色谱条件： 色谱柱：Agela Venusil MP C18 (2.1mm× 100mm, 5&mu m)； 柱温：35℃；流速：0.3mL；进样量：10&mu L； 流动相：A相：甲醇；B相：0.1%甲酸水溶液； 洗脱程序： 时间（min） A(%) B(%) 0 5 95 5 80 20 5.5 5 95 7 5 95 质谱条件： 离子源：电喷雾离子源 扫描方式：正离子模式 检测方式：多反应监测（MRM） 电离电压：3.0kv 离子源：110° C 雾化温度：350° C 锥孔气流速：50L/h 雾化气流速：650L/h 样品前处理： 按照农业部1025号公告-18-2008方法执行； SPE柱：Agela Cleanert PCX（60mg, 3mL）货号：CX0603 试验结果： 图1 3种&beta -受体激动剂（沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺，浓度为10&mu g/L）混合标准溶液特征离子质量色谱图（LC-MS/MS） 注：沙丁胺醇（定量离子对m/z=240.1221.97, 保留时间t=2.08min）、莱克多巴胺（定量离子对m/z=202.2164, 保留时间t=3.14min）、克伦特罗（定量离子对m/z=277.11202.78, 保留时间t=3.21min） 图2-1 空白火腿肠添加3种&beta -受体激动剂（沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺添加浓度为1&mu g/kg）特征离子质量色谱图（LC-MS/MS）[平行样1] 实验数据分析： 准确度和精密度：本方法采用两个添加浓度（1&mu g/kg和10&mu g/kg），用空白添加标准校正，其回收率范围为70%-110%。三个平行样的相对标准偏差小于20%。 总结： Agela Cleanert PCX以及Agela Venusil MP C18 在前处理及液相色谱-串联质谱仪法测定沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺等3种&beta -受体激动剂试验中性能表现优异，可用于问题猪肉及其制品中的瘦肉精的检测。

&beta 2-受体激动剂是指含氮激素中的苯乙胺类药物（phenethylamines,PEAs）苯乙胺类药物具有苯乙醇胺结构母核，苯环上连接有碱性的&beta -羟胺侧链。盐酸克伦特罗为国家按兴奋剂管制的&beta 2-受体激动剂，目前，&beta 2-受体激动剂已有20多种，我国禁止所有&beta 2-受体激动剂用于养殖业。近年来，非法使用盐酸克伦特罗（非法用于养殖时俗称&ldquo 瘦肉精&rdquo ）饲养生猪事件屡禁不绝，严重危害食品安全和人民群众身体健康。一些不法养殖户转向购买人用盐酸克伦特罗或其他&beta 2-受体激动剂直接饲喂生猪。本文在已有的方法基础上改进了仪器方法，睿科仪器新推出的全自动固相萃取系统,与串联四极杆液质联用系统可以同时测定九种&beta 2-受体激动剂。实验证明该方法快速、简单，灵敏度高，完全达到了国内，欧盟和日本的要求。 试剂 标准品化合物的结构见图1。乙腈购买于Fisher公司，甲酸购买于Merck公司，甲酸铵购买于Acros Organics公司，水为Milli Q。 图1. 被测&beta 2-受体激动剂的结构 试样制备与保存 牛、猪肌肉组织：若为冷冻样品，将其放置室温下化冻。从原始样品中取出部分有代表性样品约100g，经组织搅拌机将样品均匀搅碎，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装入无菌采样袋中，加封后作出标记，一份作为试样，一份作为留样（-18℃保存），试样再利用匀质机10000r/min转速下将样品制备均匀。 样品前处理 样品制备 提取 1）称取制备好的样品2.00（± 0.02）g，置于50mL离心管中，加入8mL乙酸钠缓冲液，再加入50&mu L&beta -葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，匀质机匀质30s(10000 r/min)，37℃水浴酶解12h。 2）取出后放置室温，加入100&mu L &beta -激动剂内标工作溶液(8.7)，100&mu L &beta -激动剂加标溶液，加盖后涡旋振荡， 离心10min（5000 r/min），取4mL上清液加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL，混合均匀，用高氯酸调节pH值至1± 0.3。离心10min（5000 r/min），将全部上清液转移至另一50mL离心管中，用10mol/L氢氧化钠调节pH值至11。 3）加入10mL氯化钠饱和溶液和10mL异丙醇-乙酸乙酯（6+4）混合溶液，加盖至于水平振动器振荡10min。在5000 r/min下离心10min。 转移全部的有机相，在40℃水浴下氮气将其吹干。 4）加入5mL pH=5.2的乙酸钠缓冲溶液，涡旋振荡10s后，进行SPE净化 净化 1）将固相萃取小柱置于固相萃取装置Fotector上，次用5mL 甲醇、3mL水活化小柱； 2）将上述待净化的溶液加入萃取小柱，弃取流出液，然后依次用3mL去离子水，3mL 2%甲酸水溶液(v/v)，3mL甲醇淋洗小柱，弃取流出液，并采用负压抽干小柱； 3）10mL 5%氨水氨化的甲醇溶液洗脱目标物，此时收集洗脱液； 系统自动浓缩定容； 4）往管中加入1mL含0.1%甲酸的5%甲醇溶液复溶样品，涡旋震荡后，滤液待测。 分析条件 样品采用串联四极杆液质联用仪进行分析。 液相条件 采用液相色谱仪，配置有脱气机，二元泵，自动进样器。色谱柱： SB-C18, 2.1× 100, 1.8&mu m。流动相组成：A为10mM Ammonium Formate +0.1% Formic Acid水溶液（用乙酸调节pH值4.5），B为乙腈溶剂。流速0.3mL/min，柱温40℃。梯度洗脱。 质谱条件 串联四极杆质谱仪。在（+）ESI模式下，采集数据，设定质谱参数如下：Capillary 4000V，Drying Gas 11L/min，Neb Press 35 psi，Gas Temp 350℃，碰撞气为高纯氮气，Q1和Q3的分辨率均为单位质量分辨。MRM模式下的参数如下： 保留时间 化合物 母离子 子离子 驻留时间 (ms) 碰撞电压 (V) 碰撞能量 Energy (V) 4.95 特布它林 226 15210 100 15 170 10 100 30 4.98 齐帕特罗 262 244 10 100 10 185 10 100 25 4.98 沙丁胺醇 240 222 10 100 5 148 10 100 15 5.04 塞曼特罗 220 202 10 80 5 160 10 80 15 5.80 莱克多巴胺 302 284 10 100 10 164 10 100 15 6.15 妥布特罗 228 119 10 100 30 172 10 10010 6.18 克伦特罗 （瘦肉精） 277 203 10 100 10 259 10 100 5 6.37 溴布特罗 367 349 10 100 10 293 10 100 15 6.49 克仑潘特 291 203 10 100 15 273 10 100 5 6.52 马布特罗 311 237 10 100 15 293 10 100 10 6.83 马喷特罗 325 237 10 100 15217 10 100 25 表2. MRM模式下的质谱参数 结果与讨论 实际样品添加了2ppb的激动剂，经萃取、净化等步骤，其回收率在80-100%之间。其检测灵敏度, 如瘦肉的灵敏度可达10ppt。 图2. 0.5ppb的&beta 2-受体激动剂测得的谱图 更多信息请联系： 厦门总部： 地址：厦门火炬高新区创业园伟业楼北楼N206室 邮编：361004 联系人：游经理 电话：0592-5800190 传真：0592-5800191 服务热线：400-885-1816 E-mail: info@reeko.cc 北京分公司： 地址：北京市朝阳区东三环南路58号富顿中心C座518 邮编：100022 联系人：张经理 电话：010-58674766 传真：010-58674656 E-mail：liangku_zhang@reeko.cc 上海办事处： 地址：上海市长宁区法华镇路751弄34号404 邮编：201103 联系人：陈经理 电话/传真：021-52300176 E-mail：yufei_chen@reeko.cc 关于睿科 睿科仪器（厦门）有限公司是一家专业从事实验室分析仪器研发和生产的高科技企业，是集实验室样品前处理设备研发生产、前处理方法开发、实验室仪器销售为一体的专业厂家。 睿科仪器有限公司拥有专业的销售人员，配备具有研发经验的安装维修工程师和多年应用经验的应用工程师，为实验室分析工作者提供先进、优质的产品和高质量的技术服务。

今年3月，瘦肉精事件引发全国拉网式排查，瘦肉精事件闹得沸沸扬扬，10年间瘦肉精屡禁不绝，添加瘦肉精喂出来的猪不仅颜色光亮，而且可以增加猪的瘦肉率，现在人们都关注身材，不吃肥腻的肉，这也导致饮食习惯吃瘦肉，而添加瘦肉精的猪肉正好符合当今人们的饮食习惯，瘦肉精事件一出大家都在徘徊这肉还吃不吃？ 简介瘦肉精：一类动物用药的统称，任何能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。 目前，能够实现这种功能的物质是一类叫做β-兴奋剂的药物。与传统瘦肉精盐酸克伦特罗同属“肾上腺受体激动剂”的莱克多巴胺等同类药物同样也能提高猪的瘦肉率。盐酸克伦特罗的检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法、气质联用法及液质联用法。国家标准GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定中规定方法为气相色谱-质谱法（GC-MS）、高效液相色谱法、酶联免疫法，其方法检出限均为0.5ug/kg。SN/T 1924—2007 进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测方法采用LC/MS/MS法，该方法具有高灵敏度等优点被普遍使用。本文使用UPLC/XEVO TQ-S对猪尿液中的β-受体激动剂进行分析。实验方法UPLC条件LC系统： ACQUITY UPLC® 运行时间： 10min色谱柱： ACQUITY® BEH C18 1.7μm，2.1mm x 100mm流动相A： 0.1%甲酸水流动相B： 乙腈流速： 0.40mL/minMS条件MS系统： Xevo TQ-S离子模式： ESI+毛细管电压： 3.5kv源温度： 150℃雾化气温度： 500℃雾化气流速： 900L/hr锥孔气流速： 20 L/hrMRM条件：Quanpedia数据库Quanpedia是沃特世特有的一种可扩展和可搜索的数据库，为您提供LC/MS/MS定量方法信息，目前数据库已有超过1200种化合物，包括色谱方法、质谱方法、定量方法等，您可自由选择其中的任意化合物或化合物种类自动形成您所需的方法，无需再重新进行方法开发过程。下图为数据库得到的方法信息：自动生成MRM方法： 样品制备样品制备参照GB/T 22286-2008《动源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定》进行。■ 量取2.0mL猪尿液样品，加入8mL 0.2M的PH为5.2的乙酸钠缓冲液，充分混匀■ 加入50μLβ-Glucuronidase/aryl sulfatase混匀，于37℃水浴水解过夜■ 水解液振荡15min，在5000r/min条件下离心分离10min后，取4mL上清液中添加100uL 10ng/mL的内标溶液混匀，加入5mL 0.1M高氯酸混合均匀，并调节溶液PH值到1±0.3。以5000r/mim条件下离心分离10min后，移取上清液并用10M的氢氧化钠溶液调节PH值到11。■ 加入10mL饱和氯化钠溶液和10mL异丙醇-乙酸乙酯（6:4）混合溶液，离心分离后取有机相，在40℃水浴下用氮气将其吹干■ 提取残渣中加入5mL 0.2M乙酸钠缓冲液（PH5.2），超声混匀溶解残渣■ 样品净化（如下图所示），使用Oasis MCX（3cc/60mg）小柱■ 净化后的洗脱液用氮气吹干，用流动相溶解定容至1.0mL，过0.22μm滤膜，待进样分析 下图为数据库得到的方法信息： 固相提取净化过程Oasis MCX（3cc/60mg）：实验结果与讨论本方法才用一次进样同时监测猪尿液样品中的21种β-受体激动剂进行检测，在灵敏度、分离度方面获得满意的结果。与常规的串联四极杆质谱仪不同的是，Xevo TQ-S为您提供最好的定量数据的同时，还为您提供高质量的光MS/MS信息。对猪尿液中含0.5ug/L的受体激动剂样品，启用PICs（子离子确认扫描）功能，可在不影响MRM定量的同时得到各化合物子离子扫描图，与标样子离子图进行匹配，对样品中阳性结果定性起到帮助判断的作用。 结论本方法采用多离子反应监测（MRM）方式对21种β-受体激动剂进行检测，具有快速、准确、灵敏度高、分析周期短、适用范围广等优点。适用各类动物组织或动源性食品等的测定。IntelliStart技术可以使得开发分析方法过程变成流线型工作流程。这意味着需要更少的时间来开发方法，大大提高工作效率。强大的Quanpedia数据库包含上千种化合物的方法，自动生成方法文件让你轻松简单快速应对各种突发事件。PICs（子离子确认扫描）功能为您提供最好的定量数据的同时，还为您提供高质量的光谱MS/MS信息，对样品中阳性结果定性起到帮助判断的作用。关于沃特世公司 (www.waters.com)50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。 联系人：张林海沃特世公司市场部86(21) 61562642lin_hai__zhang@waters.com 周瑞琳 （Grace Chow）泰信策略（PMC）020-83569288grace.chow@pmc.com.cn