电融合电穿孔仪

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纳米隧道电穿孔仪重磅出击红方块科博会在中国科学仪器博览会（简称：红方块科博会）召开之际，美国俄亥俄州立大学科学家开发出一种名为“纳米隧道电穿孔”的新技术，或称为NEP，将同期在红方块科博会上展出。 在红方块科博会中获悉长期以来，在进行基因治疗时，人们对插入细胞的药剂数量无法控制，因为人体绝大部分细胞都太小，最小的针头也无能为力。而NEP让我们能研究药剂和其他生物分子是怎样影响了细胞的生物和基因路径的，现有其他技术都无法达到这么细微的水平。展会中该校化学与生物分子工程教授詹姆斯·李说。科学家们用这种方法，将定量的抗癌基因成功插入到白血病细胞中并杀死了它们。 在红方块科博会中了解到，研究人员用聚合物压制成一种电子设备样机，用DNA(脱氧核糖核酸)单链作为模板来构建纳米隧道。詹姆斯·李发明了一种使DNA链解旋的技术，并使其按照需要形成精确结构。他们给DNA链涂上一层金涂层并加以拉伸，使之连接两个容器，然后将DNA蚀去，在设备内部留下一条连通两个容器的尺寸精确的纳米隧道。 隧道中的电极将整个设备变成一个微电路，几百伏特的电脉冲从一个装药剂的容器经纳米隧道到达另一个装细胞的容器，在隧道出口处形成了强大的电场，与细胞自身的电荷相互作用，迫使细胞膜打开一个小孔，足够投放药物而不会杀死细胞。调整脉冲时间和隧道宽度，就能控制药物剂量。利用纳米隧道电穿孔仪给细胞注射基因治疗药剂时，不用针头，而是用电脉冲通过微小的纳米隧道，几毫秒内就能把精确剂量的治疗用生物分子“注射”到单个活细胞内。 在红方块科博会期间科学家们指出，希望NEP能最终用于早期癌症检测与治疗，比如在干细胞或免疫细胞中插入精确剂量的基因或蛋白质，引导它们分化改变，不必担心过量注射带来的安全问题，然后把这些细胞放回体内作为一种细胞基础疗法。并且希望这种方法能用于白血病、肺癌及其他肿瘤。

http://img3.17img.cn/bbs/upfile/images/20100518/201005181701392921.gif高效基因导入-电穿孔在生命科学研究中的应用 讲座时间：2014年7月8日 14：00 主讲人：张 旭 生物科学硕士，毕业于美国普度大学，拥有丰富分子生物仪器技术经验，现任美国哈佛仪器大中华区上海代表处渠道经理。http://img3.17img.cn/bbs/upfile/images/20100518/201005181701392921.gif【简介】 电穿孔技术是利用电场作用使细胞膜的脂双层膜结构进行重新排列，形成许多微小的孔径，从而是外源分子可以通过细胞膜进入细胞的一种重要分子生物学技术。如今被广泛应用于生物医药领域，实现基因和药物导入特定的细胞、siRNA基因沉默和基因疗法、细胞融合和单克隆抗体制备以及核转移和动物克隆。与其他化学和生物导入方式相比，电穿孔有着得天独厚的优势，对导入的外源分子大小没有限制、无细胞毒性、具有很高的实验可重复性并且操作简单快捷。配合专业设计的多样性电极，电穿孔技术的应用对象也拓展至体外悬浮细胞、活体动物、离体组织、子宫内胚胎、卵内胚胎和贴壁细胞，并且可以进行大规模96孔高通量应用，从而使得电穿孔技术的应用领域得到了无限扩展，新的应用技术不断涌现......本期摘要：电穿孔/电融合技术介绍电穿孔技术原理影响电穿孔效率的关键因素电融合技术特点介绍-------------------------------------------------------------------------------1、报名条件：只要您是仪器网注册用户均可报名参加。2、报名并参会用户有机会获得100元京东卡一张哦~3、报名截止时间：2014年7月8 日 13:30 4、报名参会：http://simg.instrument.com.cn/meeting/images/20100414/baoming.jpg

1、什么是活体电穿孔活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用，并且效率较高。活体电穿孔法的原理很简单，在直流电场作用的瞬间，细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105～115μm ，这种通道能维持几毫秒到几秒，然后自行恢复。在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多，在基因治疗方面的优势也日趋显著，是一种很好的活体基因导入方法。活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。大量的研究表明活体电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。因此目前国内外对活体电穿孔法介导外源基因转移的研究越来越多。2、活体电穿孔的法的特点 活体电穿孔法基因导入和表达效率较高，它的特点主要在以下几个方面:首先，靶器官的选择面广，理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官。 在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中，则在某种意义上说已失去了基因导入的价值，这在基因治疗中是关键性的问题。当使用组织特异性表达载体时，研究人员应根据所构建的表达载体来选择基因转移和表达的靶器官组织。例如鱼精蛋白21 启动子可指导外源基因在精母细胞中特异性表达，以小鼠的睾丸作为靶器官将含有鱼精蛋白21启动子的表达载体导入，获得外源基因的表达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达。其次，对导入的外源基因片段的大小没有限制，从几KB 或十几KB 的表达载体， 到100～200KB 的YAC、BAC基因组 ，都有成功导入并获得表达的报道。此外活体电穿孔法操作简单快速，电穿孔的时间只有几秒钟，而且DNA片段不需要特殊的纯化操作。但电穿孔法也存在一些的缺点:首先，外源基因表达持续的时间很短，虽然外源基因导入后最快可在215 小时有表达，但大多1～2 月后表达量降至很低。外源基因表达的时间主要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大差异。由于应用不同的表达载体，Muramatsu 在小鼠肝脏进行电穿孔7天后则检测不到外源基因的表达，而Heller 21 天后还可以检测到外源基因的表达。如果选择代谢和酶活动旺盛的组织器官如肝脏，则表达持续时间会较短，表达时间在1 个月以内，但以骨骼肌为靶组织，表达可持续15个月。3、 活体电穿孔法与其他活体基因导入方法的比较 到目前为止，非病毒载体的活体基因导入方法有直接注射法、脂质体法、基因枪法、电穿孔法等。每一种方法都有其各自的特殊性，因此很难将这几种方法进行简单的比较。直接注射法：可将外源基因直接注射到靶位点或血管中，但此种方法不适合以肌肉作为靶器官，它的外源基因表达效率极低，仅为电穿孔法的百分之一。脂质体法：活体基因转移法中脂质体法更适宜较大面积组织的基因导入，但无法避免DNA浓度变低，在出血的情况下会使本来不高的DNA浓度更加降低，往往造成基因导入效率低。基因枪法：适合于DNA较易接触到的质地较坚韧的组织如皮肤，而视网膜、胚胎和禽类的胚盘等组织会由于机械刺激和出血造成器质性损伤或发育停滞，因而不能用基因枪法完成。DNA包裹的金属颗粒从基因枪发出到达组织表面大多只几百微米的距离，较深层的组织不易操作， 表达效率也较低。Muramatsu报道在材料一致的情况下，电穿孔法的基因导入和表达效率明显高于其它方法，而且电穿孔法适合多种组织的操作 。4 、活体电穿孔法施加条件的研究 波型的选择在电穿孔过程中方波较指数衰减波更能获得较高的基因表达。同时方波只要要求控制电压和时间，十分直观，而指数衰减波需要控制的电压、电容、电阻等参数，这样的条件摸索过程中，方波较指数衰减波更易得到高表达。

如题：用于植物原生质体融合的电融合仪有哪些进口品牌，价位各是多少？另外，电融合仪怎么选型？

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穿孔萃取法是测定人造板材中游离甲醛含量的传统方法，在欧洲提出并为我国采用，其原理是用甲苯通过液—固萃取将试件中甲醛萃取出来，然后通过穿孔器进行甲醛与水的液—液萃取，使甲苯中的甲醛又溶于水，然后在水溶液中进行测定。穿孔萃取法操作简单，测定时间较短，适用于试件的快速测定。穿孔萃取法实际上时测定人造板中所含的全部可能释放出来的甲醛。本文对穿孔萃取法测定人造板中游离甲醛含量影响因素进行探讨，以供参考。　　1 实验　　1.1 材料与仪器　　材料：高密度纤维板，刨花板（江苏玉兰木业有限公司提供）。　　试剂：甲苯，碘化钾，重铬酸钾，硫代硫酸钠，乙酰丙酮，甲醛（35%-40%），乙酸铵（以上均为分析纯）。碘化汞，无水碳酸钠，H2SO4，HCI，NaOH，I2，可溶性淀粉。　　仪器：穿孔萃取仪（上海玻璃仪器厂），0.01g电子天平，0.0001g电子天平，UV1240紫外分光光度计等。　　1.2 测试原理　　GB/T 17657—1999《人造板及饰面人造板理化性能试验方法》。　　1.3 计算　　甲醛释放量按下式计算，精确至0.1mg。　　E=（As-Ab）×f×(100+H)×V /M0　　其中：E—每100g绝干试件释放的甲醛毫克数，mg/hg；　　As—萃取液吸光度；　　Ab—蒸馏水吸光度；　　f—标准曲线的斜率；　　V—容量瓶体积，2000mL；　　H—试件的含水率，%；　　M0—用于萃取试件的质量，g

穿孔萃取仪用于人造板甲醛含量测定,要求质量好一些的,现有的玻璃太容易碎.

穿孔法测试甲醛是测试的甲醛总量？没做过穿孔法，哪位大侠了解？干燥器法是测试释放量

1、穿孔萃取仪，单独买架子大概要多少钱啊？2、装置的连接不是很会，有没有同行可以指导一下，最好有图片，3、实验需要在怎样的环境中进行啊？目前我们实验室条件比较差，没有恒温恒湿，可以做吗？4、萃取完的甲苯溶液大家都是怎么处理的呢？5、板材 是怎么锯成一小块块，使可以放进圆底烧瓶那样的小口的

谁做过人造板测试用的甲醛穿孔萃取仪的验收试验？乍么来验证这个仪器好不好用？

穿孔法测试板材中甲醛方法中甲苯添加量为何要求为600mL，这个量是怎么来的，为什么不定500mL呢？正好一瓶倒进去多方便呀

我们实验室刚建立，拟制定一套收费标准，请大侠帮忙，有的就发来分享，没有的就给一些建设性的建议哈！谢谢！主要是下面一些设备：1.安捷伦GC6890N(配FID,TCD检测器)2.Waters2695（配2996DAD，2424ELSD检测器）3.AKTA蛋白纯化系统（explore100，UV检测）4.Imaging－PAM荧光成像系统（有maxi－和mini两种探头可选）5.Li－6400R光合测定仪（有三种叶室，包括透明、荧光、红蓝）6.恒温恒湿箱（德国MMM climacell）7.色差计（美国HunterLab MiniScan XP）8.电穿孔仪（美国Biorad Gene Pulser Xcell）9.高压测序电泳仪（美国Biorad PowerPAC3000）10.冷冻研磨机（美国SPEX CertiPrep 6770）

各位高手，请问有谁知道建筑材料人造板穿孔萃取法中的 穿孔萃取仪 的用法， 最好附上照片。 标准是GB/T 17657-1999。 谢谢各位

请问各位达人啊,做木甲醛的穿孔萃取的时候如何才能控制回流速度达到标准的速度,我做的时候前辈说要在具体的那个位置,但是我觉得不太准确,不晓得大家有什么好的点子给小的支招啊.谢谢大家了啊

根据《中华人民共和国政府采购法》、《政府采购货物和服务招标投标管理办法》等规定，经财政部门批准的政府采购计划(编号：201109070104)批准，现就广西壮族自治区水产研究所实验仪器设备采购项目进行公开招标采购，欢迎符合条件的供应商前来投标：　　一、项目名称：实验仪器设备采购　　二、项目编号：GXZC2012-G1-20080-KW　　三、采购组织类型：部门集中　　四、采购方式：公开招标　　五、采购内容及数量：　　A分标序号货物名称数量单位1工业冷水机2台2水质分析仪1台3在线分析仪1台4水下荧光仪1台5底泥采样器1台6藻类辅助鉴定计数仪1台7海流计1台8便携测深仪1台9实时荧光定量PCR仪1台10高剪切分散乳化机1台11高压蒸汽灭菌器1台　　B分标序号货物名称数量单位1显微镜1台2电泳系统1套3电穿孔仪1台4重金属元素分析仪1台5水质监测仪1台　　C分标序号货物名称数量单位1离心机1台2离心机1台3水浴锅1台4抽湿机4台5纯水机1台6[/al

何处购买质量很好的穿孔萃取仪等玻璃器皿？我们在做GB17657-1999标准的甲醛测试，我们现用的萃取仪萃取效果不佳，玻璃质量比较薄，密封性不好。 同时希望购买到天玻或者北玻的玻璃器皿。

今天买了一只活鸭子，宰杀后在清洗时发现鸭肫上竟然有三个穿孔，肫壁还有多处异常突起，是否给鸭子喂了什么致突变的饲料导致的？感觉很可怕，只好把鸭肫扔了。http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em09501.gif

求穿孔萃取法测中密度纤维板，刨花板标准曲线，最近头疼，一直做不好，不知道有没有高人能分享一下自己的穿孔萃取法标准曲线？[em0801]

使用穿孔萃取法测试人造板甲醛含量，出现了两个问题，实在纠结。1，甲苯蒸汽升上去的时候，只有很少部分进入冷凝管，直接就被冷却，沿着管壁直接被冷却留下来了。实际甲苯根本没有和水进行萃取，就直接又回到烧瓶去了，这结果完全不可信啊。 这难道是因为最近温度低的原因？2，根本没有出现虹吸，只是上层甲苯流了下去，管放得已经是竖直的了，就是慢慢流，加大回流速度也没有用。大家有没有碰到过这些情况，要怎么改进，请大家帮忙想想办法。

新手，刚学甲醛释放量穿孔法检测，有以下以地方不明白。这是我做的甲醛释放量标准曲线的数据 我的甲醛标准曲线图：斜率 31.34 甲醛含量 吸光度0.00 0.037 0.75 0.052 1.50 0.094 3.00 0.126 7.50 0.270 15.00 0.515 现在的问题是：很多人说这个斜率值在20-25之间才是正确的！但是我们的甲醛释放量最终的检测结果却和国家质检院检测的一样！前面溶液配制都没问题，甚至各点溶液的颜色都基本一样！可是分光光度计所读出的吸光度就差很多了，斜率更是不一样！但最后的甲醛释放量计算结果却一样！求高手指点！急！2.我用的是721分光光度计，不是数显，这个灵敏度调整档应该在那个档位比较好呢？3.光度计：412纳米处，灵敏度档2 。不知道是不是显色剂的问题，肉眼看起来我们两个企业的溶液颜色差别不大。如果我的光度计有问题得话，问题在哪里呀！另外我看那个企业的15毫克/升甲醛溶液的吸光度数值是1.301，可是我家的这个分光光度计在0.01到1.0之间是可以准确读数的，1-2之间最小刻度是0.2，请问如果真的是我的数据有问题，我这个分光光度计该怎么读取15毫克/升甲醛溶液的吸光度数值呢？我的问题又处在什么地方呢？很困惑，求高手指点！急！！！这是另一个厂家的。甲醛含量 吸光度0.00 0.017 0.75 0.080 1.50 0.149 3.00 0.283 7.50 0.681 15.00 1.301

各位同仁好，请问谁有《[b]ISO 2591-1-1988 筛分试验第1部分:用于金属丝编织网及金属穿孔板的筛分试验方法》[/b]的标准文件吗？可否共享一份呢？谢谢了~

植物细胞原生质体制制备与融合2006-11-20 17:14植物细胞原生质体制制备与融合1、原生质体常现的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图用这种崭 图3-2新的手段冲破自然界的禁钢。１９３７年michel率先实施植物细胞融合的试验。如何去除坚韧的细胞'接成了牛物学工作者必须解决的首要难题。１９６Ｏ年该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。2、原生质体制备（１）取材与除菌 为了让制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根。子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗２～３次，然后浸人 ７０％酒精消毒后，再放进 ３％次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。（２）酶解 现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：反应液应是一种ＰＨ值在５·５～５·８的缓冲液，内合纤维素酶０．３%～３．０%以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等，②酶解：除菌后的叶片 撕去下表皮 切块放人反应液 不时轻摇 (条件25℃～30℃,2～4h)反应液转绿。反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。（３） 分离 在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取２００～４００目的不锈钢网或尼龙布ｊ叭ｉ过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。（４） 洗涤刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养。再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤２～４次。 （5） 鉴定 只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放人低渗溶液中，则很容易胀破。也。'厂月荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分中 此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定人、作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。4、 原生质体的融合（1）化学法诱导融合 化学法诱导融合无需贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇（ＰＥＧ）纳合成钙高ｐＨ诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。以下简介此方法（在无菌条件下进行）：按比例混合双亲原生质体-----滴加 ＰＥＧ溶液，摇匀，静置----滴加高钙高ｐＨ值溶液，摇匀，静置-----滴加原生质体培养液洗涤数次-----离心获得原生质体细胞团一筛选、再生杂合细胞。（２）物理法诱导融合 １９７９年Ｓｅｎｄａ等发明了微电极法诱导细胞融合。１９８１年Ｚｉ。。ｍａｎｎ等提出了改进的平行电极法，现简介如下：将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，亦可获得较高的融合率。上述操作实际上是供体与受体原生质体对等融合的方法。由于双方各具几万对基因，要筛选得到符合需要且能稳定传代的杂合细胞是相当困难的。最近，有人提出以Ｘ射线、伽玛射线。纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。轻剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移；致死量处理后合ｕ可能产生没再仅体万染色体ｗ划她旋余种。利用这种价值不对称融合方法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型．2） 亲本双方的细胞核和细胞质能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多。3） 融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象就越严重。 4） 融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或ＤＮＡ片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分生长成嵌合植株。5、 杂合体的鉴别与筛选双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养（液体或固体），再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。 (1) 杂合细胞的显微镜鉴别 根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：若一方细胞大，另一方细胞小，则大。小细胞融合的就是杂合细胞；若～方细胞基本无色，另一方为绿色，则自绿色结合的细胞是杂合细胞；如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合的标志；发现ｈ述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再牛培养基培养。（2）以互补法筛选杂合细胞 显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与个长 遗传互补法则可弥补以上不足。 遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。白化互补：不同基山叨的白化突变株出aBｘAh，可互补为绿色细胞株AaBb。生长互补：甲细胞株缺外源激素Ａ不能生长，乙细胞株需要提供外源激素Ｂ才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素Ａ、Ｂ的选择培养基上可能生长。抗性互补筛选：假如某个细胞株具某种抗性(抗青霉素)另一个细胞株具另一种抗性（如抗卡那霉素），则它们的杂合株将可在含上述两种抗生素的培养基上再生与分裂。这种筛选方式即所谓的抗性互补筛选。代谢互补筛选：根据碘代乙酚胺能抑制细胞代谢的特点，用它处理受体原生质体，只有融合后的供体细胞质才能使细胞活性得到恢复，等等。 （３）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ，见８．２．２．２）和随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。（４）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别质。

植物细胞原生质体制制备与融合1、原生质体常现的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图用这种崭 图3-2新的手段冲破自然界的禁钢。１９３７年michel率先实施植物细胞融合的试验。如何去除坚韧的细胞'接成了牛物学工作者必须解决的首要难题。１９６Ｏ年该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。2、原生质体制备（１）取材与除菌 为了让制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根。子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗２～３次，然后浸人 ７０％酒精消毒后，再放进 ３％次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。（２）酶解 现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：反应液应是一种ＰＨ值在５·５～５·８的缓冲液，内合纤维素酶０．３%～３．０%以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等，②酶解：除菌后的叶片 撕去下表皮 切块放人反应液 不时轻摇 (条件25℃～30℃,2～4h)反应液转绿。反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。（３） 分离 在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取２００～４００目的不锈钢网或尼龙布ｊ叭ｉ过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。（４） 洗涤刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养。再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤２～４次。 （5） 鉴定 只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放人低渗溶液中，则很容易胀破。也。'厂月荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分中 此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定人、作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。4、 原生质体的融合（1）化学法诱导融合 化学法诱导融合无需贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇（ＰＥＧ）纳合成钙高ｐＨ诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。以下简介此方法（在无菌条件下进行）：按比例混合双亲原生质体-----滴加 ＰＥＧ溶液，摇匀，静置----滴加高钙高ｐＨ值溶液，摇匀，静置-----滴加原生质体培养液洗涤数次-----离心获得原生质体细胞团一筛选、再生杂合细胞。（２）物理法诱导融合 １９７９年Ｓｅｎｄａ等发明了微电极法诱导细胞融合。１９８１年Ｚｉ。。ｍａｎｎ等提出了改进的平行电极法，现简介如下：将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，亦可获得较高的融合率。上述操作实际上是供体与受体原生质体对等融合的方法。由于双方各具几万对基因，要筛选得到符合需要且能稳定传代的杂合细胞是相当困难的。最近，有人提出以Ｘ射线、伽玛射线。纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。轻剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移；致死量处理后合ｕ可能产生没再仅体万染色体ｗ划她旋余种。利用这种价值不对称融合方法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型．2） 亲本双方的细胞核和细胞质能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多。3） 融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象就越严重。 4） 融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或ＤＮＡ片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分生长成嵌合植株。5、 杂合体的鉴别与筛选双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养（液体或固体），再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。 (1) 杂合细胞的显微镜鉴别 根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：若一方细胞大，另一方细胞小，则大。小细胞融合的就是杂合细胞；若～方细胞基本无色，另一方为绿色，则自绿色结合的细胞是杂合细胞；如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合的标志；发现ｈ述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再牛培养基培养。（2）以互补法筛选杂合细胞 显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与个长 遗传互补法则可弥补以上不足。 遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。白化互补：不同基山叨的白化突变株出aBｘAh，可互补为绿色细胞株AaBb。生长互补：甲细胞株缺外源激素Ａ不能生长，乙细胞株需要提供外源激素Ｂ才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素Ａ、Ｂ的选择培养基上可能生长。抗性互补筛选：假如某个细胞株具某种抗性(抗青霉素)另一个细胞株具另一种抗性（如抗卡那霉素），则它们的杂合株将可在含上述两种抗生素的培养基上再生与分裂。这种筛选方式即所谓的抗性互补筛选。代谢互补筛选：根据碘代乙酚胺能抑制细胞代谢的特点，用它处理受体原生质体，只有融合后的供体细胞质才能使细胞活性得到恢复，等等。 （３）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ，见８．２．２．２）和随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。（４）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别质。

我们要用玻璃融合枪,来融合安培瓶,就是那种玻璃房用的,有乙炔和氧气导管,燃烧的东西,不知道哪位有这东西