酶底物检测

前言：生物发光是一种在生物体内由酶将化学能转化为光能的现象，在自然界中有超过30种生物发光体系，而我们所熟知的萤火虫的发光体系就是其中研究最早，应用也最广泛的一种。萤火虫的发光现象是由其体内的萤光素酶（luciferase）的催化下三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)与发光底物萤光素（lucierin）发生反应产生光。ATP被认为是一种在所有生物体生存和繁殖的细胞合成中必不可少的普遍能量来源，形象的说，它是一种通用的能量“货币”。ATP可以通过水解产生AMP和一个磷酸基团，同时释放出能量，供给细胞活动。ATP结构图发光反应的方程式：研究历史：1885年萤光素及萤光素酶第①次被Dubois提取出来；1952年Strehler和Totter首次使用萤光素酶粗制品测定ATP；1961年White等人工合成了萤光素；1985年Dewet, JR等首次克隆了P. Pyralis萤光素酶基因并在大肠杆菌中表达，从中得到具有活性的萤光素酶，从而开启了萤光素酶作为报告基因的历程。ATP的含量直接反应了细胞或微生物的含量，通过监测ATP含量的改变，可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质引起的细胞杀伤、细胞抑制和细胞增殖作用；另外ATP也常作为微生物污染的一个指标，检测ATP含量能直接反映出其受污染程度。测定生物体中ATP的水平及其动态变化便成为监测生物体必不可少的手段。接下来，小编将向大家具体介绍一下他在近年来的应用领域。应用领域01食品安全人类的身体健康、生命安全长期受到微生物污染的威胁，营养琼脂平板计数法是国际上针对微生物检测的现有标准方法，然而该方法要求在 37 ℃下持续培养 48 h，过于繁琐的操作无法实现快速检测。现下，国内也加大了对核酸法、电阻抗测量、免疫学方法、微菌落技术等各类微生物快速检测技术展开了研究、应用。ATP生物发光法因快速、简便且具有较高灵敏度的缘故，可用于实时监控微生物污染，与食品行业需求相符合，故而有关该技术的研究与应用十分广泛。其检测步骤通常为：①首先根据ATP发光检测试剂盒的使用说明将标准ATP按梯度稀释，与酶、底物、缓冲液按比例混合，使用发光检测设备（比如博鹭腾发光检测系列）测量对应的发光值，绘制标准曲线。②提取样品细胞中的ATP，稀释，之后按比例与酶、底物、缓冲液混合，使用发光检测设备测定发光值，代入标准曲线，即可知道样品中ATP浓度。（ATP浓度与细胞浓度关系的测定：取对数生长期的细胞，离心浓缩后用苔盼蓝染色，计活细胞数，之后在 96孔培养板上等比稀释，测定其发光值，发光值代入标准曲线获得ATP浓度，经过计算即可获得ATP浓度与细胞浓度关系。）应用案例：酒类制作过程中微生物浓度检测食品生产线卫生学检测环境保护部门水体微生物检测卫生监管部门微生物数量检测对应文献：[1]吴慧清.ATP生物发光法饮用水中细菌总数快速测定方法研究[J].中国卫生检验杂志,2009,19(9):1975-1978.[2]刘阳,牟金明.ATP生物发光法快速测定物体表面的菌落总数[J].安徽农业科学,2016,44(1):125-128.[3]易琳.微生物检测中 ATP 生物发光法的应用研究现状[J].生物化工,2019,5(1):124-126.[4]高红阁.ATP 生物荧光法在卫生监督工作中的应用进展[J].疾病监测与控制杂志,2013,7(9):548-550.[5]伍季.ATP生物发光法快速检测啤酒中的菌落总数[J].河南科学,2006,24(1):63-65.[6]李春艳,霍贵成.ATP生物发光法快速测定生乳中微生物总数的研究[J].食品工业科技,2008,29(7):233-238.[7]魏树源.三磷酸腺苷生物发光快速微生物检测法在疫苗中间品无菌试验中的应用[J].中国生物制品学杂志,2010,23(10):1120-1124.[8]丛苑,李平兰.ATP 发光法快速检测玉米中的霉菌[J].中国食品学报,2014,14(8):233-238.02药物敏感实验化疗是恶性肿瘤主要治疗手段之一，其地位已越来越重要。但因为不同类型的肿瘤以及不同个体的同类肿瘤存在异质性，以致惯用的经验式化疗效果尚不理想。临床上迫切需要有切实可靠的检测方法，在化疗实施前筛选出有效药物，进行个体化治疗，以提高疗效而减少毒副作用。ATP生物发光法是近年来发展起来的一种高度敏感的药物敏感试验。文献表明 ,将ATP生物发光法应用于临床个体肿瘤药物敏感性的预测，与临床有较好的相关性。基本思路为：①将癌细胞与药物体外混合培养一段时间。②与食品安全检测类似：绘制发光标准曲线→测定与药物混合培养细胞的发光值→代入标准曲线，最 后计算出药物对肿瘤的杀伤强度。应用案例：化疗药物筛选结核药物筛选细胞活性测定

人工金属酶作为一种潜在的分子药物，有望在人体内靶向治疗癌细胞，减少癌症治疗副作用。但未搞清内部催化机制时，其应用就显得有些束手束脚。本月，北京工业大学和中科院高能物理所联合的研究团队在《科学进展》上报告了一项研究，他们阐明了一种人工金属酶的精细分子结构和能级分布特征，并揭示了这种仿生酶的催化活性机制。天然酶有高效的催化性能，但生物医学中的应用对酶的稳定性和免疫原性有更高要求。为此，研究者对酶进行了一系列改造，使其得以在更多生物反应中施展拳脚。在新发表的研究中，科学家设计出活性中心为铜团簇的人工金属酶，辅以肿瘤靶向肽和血清白蛋白——前者帮助酶与肿瘤细胞定向结合，后者让酶更稳定、活性更高。为血清白蛋白换上金属团簇内核后，其生物兼容性和金属催化能力都有所改良。经过一系列计算和实验，科学家发现，这种人工金属酶与底物匹配度良好。而且，由于自身独特的几何形状，人工金属酶在肿瘤微环境中可长期、稳定、选择性地让过表达的过氧化氢转化，使其变为羟基自由基和氧气。羟基自由基既能持续切割肿瘤细胞的DNA，让治疗更高效，还能产生灵敏的化学发光，便于人们动态追踪疗效。研究团队还发现，随着催化反应的进行，人工金属酶的活性中心并不会损耗，因为团簇的金属价态实现了封闭式周期性循环，确保反应更稳定、持续。这项研究意味着人工金属酶的合成向精准按需又迈进一步。此外，金属团簇独特的催化动力学和稳定性构造出新的反应路径，帮助人们建立可视化检测、高效治疗特定肿瘤的新方法。

各有关单位及专家：由中国食品药品企业质量安全促进会立项，国家药品监督管理局疫苗及生物制品质量监测与评价重点实验室、武汉瀚海新酶生物科技有限公司提出的《生物制品中DNase残留检测－核酸荧光底物法》、《mRNA疫苗及药物中dsRNA杂质定量检测-ELISA法》、《生物制品中RNase残留检测－核酸荧光底物法》等三项团体标准，在汇总了标准起草工作组成员单位及有关企业和专家意见的前提下，现已完成征求意见稿，为保证该团标的科学性、实用性及可操作性，现公开征求意见。请各有关单位及专家认真审阅标准文本，对标准的征求意见稿（详见附件1、附件3、附件5）提出宝贵意见和建议，并将征求意见反馈表（详见附件7）于2024年09月30日前以信函或邮件的形式反馈至联系人，逾期未反馈意见的单位及个人视为无意见。联系人：孙金鑫联系方式：13121551000邮箱：FDSA@fdsa.org.cn 附件1：《生物制品中DNase残留检测－核酸荧光底物法》征求意见稿.docx附件2：《生物制品中DNase残留检测－核酸荧光底物法》征求意见稿 编制说明.docx附件3：《生物制品中RNase残留检测－核酸荧光底物法》征求意见稿.docx附件4：《生物制品中RNase残留检测－核酸荧光底物法》征求意见稿 编制说明.docx附件5：《mRNA疫苗及药物中dsRNA杂质定量检测-ELISA法》征求意见稿.docx附件6：《mRNA疫苗及药物中dsRNA杂质定量检测-ELISA法》征求意见稿 编制说明.docx附件4：征求意见反馈表.docx中国食品药品企业质量安全促进会关于《生物制品中DNase残留检测－核酸荧光底物法》等三项团体标准征求意见的函.pdf