酶活力检测

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  • 高通量种子呼吸和活力测量系统采用非接触氧气测量技术,可对密封于微孔板每个孔中的种子的耗氧率进行测定,进而评估种子的活力。系统由内置荧光光纤氧气传感器的96孔板、氧气测量主机及数据采集分析软件组成,可高通量检测评估种子活力。 功能特点l 氧气测量高精度、高可靠性、低功耗、低交叉敏感性、快速响应时间l 轻松校准l 非侵入性和非破坏性测量l 紧凑设计,适用于培养箱和摇床l 其他应用领域包括:高效筛选、过程工程、小规模细胞培养和呼吸速率测量、酶活性测定、环境分析等 技术参数1. REDFLASH氧气测量技术:基于独特的氧气敏感REDFLASH传感器材料,用红光激发能够在近红外(NIR)波段产生氧气依赖的荧光。2. 技术优势:红光激发显著减少了由自发荧光样品引起的干扰;NIR检测技术显著减少了环境光的干扰。3. 适用场景:原位检测,可在培养箱里或摇床上使用,便于温度控制。4. 可选氧气传感器类型:薄膜贴(标配)或者纳米颗粒。5. 薄膜贴直径约为1-1.5毫米,固定在孔底中心,无光学隔离。6. 氧气测量范围:0-50%O2(气体)或0-44mg/L(液体)。7. 氧气分辨率:0.1% O2@ 20% O2(气体)或0.05 mg/L@ 8.8 mg/L(液体)。8. 氧气测量精度:±0.6% O2@ 20% O2(气体)或±0.3 mg/L@8.8 mg/L(液体)。9. 氧气测量漂移:0.5% O2每月(气体)或0.20 mg/L 每月(液体)。10. 响应时间:<30s。11. 最小使用寿命:100万次。12. 配套采集软件:新一代用户友好的多功能采集软件,可在同一个窗口管理多达3台设备。13. 配套分析软件:提供耗氧率计算和漂移补偿等数据处理和分析功能。14. 微孔板:圆底(270 μL)或平底(350 μL)96孔的透明聚苯乙烯孔板,支持预消毒(EtO环氧乙烷)处理。 安装案例
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  • 种子活力监测系统 400-860-5168转4662
    本系统由VisiSens TD和Viviplate组成。Viviplate包括各种规格的孔板,底部完全由氧传感器箔 SF-RPSu4 组成;VisiSens TD基本系统允许用户在一张图像中记录所有孔。孔板的黑色壁可减少环境光、散射光和反射的干扰。样品将直接在传感器箔上生长,就像样品在其他生长表面上一样。样品和传感器之间的最小距离可以研究细胞的微环境。使用成像技术可视化孔内的梯度和热点,并跟踪它们随时间的变化。提供了同时比较和监测大量样品中氧气分布的解决方案。系统特点氧气分布的 2D 可视化样品微环境信息孔板所有孔都可以记录在一张图像中多个样品的比较和监测用于种子、细胞和微生物等培养操作软件本系统操作基于VisiSens ScientifiCal 程序,通过置入VisiSens PlateTrack 插件实现样品多样化分析。技术参数Viviplate多孔板测量范围:O2:0 – 100%饱和空气(0 – 20.9% O2);响应时间:溶解氧:30 s.测量温度范围:+ 5℃ 至 + 45℃兼容性:水溶液,乙醇(最大 10 % v/v),甲醇(最大 10 % v/v),pH 2 – 10每孔最大填充量:3mL每孔生长面积:约1.9cm2多孔板适配器尺寸:14 cm x 10 cm x 12 cm材质:PLA重量:130 g
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  • 火力发电机组是现代能源工业的重要部分,其中润滑系统是维持机组正常运转的重要保障。在润滑系统中,油颗粒度检测显得尤为重要,它直接关系到机组的稳定性和可靠性。然而,由于各种原因,如机械摩擦、温度变化、氧化等,油中可能会出现颗粒物,这些颗粒物会严重影响润滑效果,加剧机械磨损,甚至引发重大事故。 【案例】某火力发电厂,由于未建立有效的油颗粒度检测制度,致使机组在运行过程中出现了严重故障。该电厂的润滑系统使用了高粘度的油品,但由于油品中的颗粒物较多,导致了润滑效果下降,机械摩擦加剧,最终在运行过程中出现了轴瓦磨损、轴颈断裂等严重故障。在维修过程中,电厂不仅承受了高额的维修费用,还因故障导致停机,损失了大量的能源产值。 【分析】出现上述问题的原因主要有两方面:一是油品质量监管不力,未能在入库时进行有效的颗粒度检测;二是缺乏定期的油品检测和更换,导致油品在运行过程中劣化,产生大量的颗粒物。 【解决方案】为避免类似故障的发生,该电厂应采取以下措施:1. 在入库时对油品进行严格的颗粒度检测,确保油品质量; 如何对油品进行颗粒度检测,是很关键的一步。要进行颗粒度检测,必须确保选择一款检测准确度高、精度高、性能稳定的油品颗粒度检测仪,之前用过的不同品牌颗粒度检测仪,比较推荐的有普洛帝、贝克曼,这两款产品性能都还可以,普洛帝售后周期相对更及时。普洛帝油液颗粒度分析仪(实验室台式机:PLD-0201;现场便携机:PLD-0203、PMT-2)是电力行业不二选择。普洛帝油液颗粒度分析仪采用普洛帝技术—“光阻测量颗粒”,并采用油液行业经典方法NAS1638和ISO4406,并可根据用户的要求,内置用户所需多种标准。引用精密柱塞泵和超精密流量电磁控制系统,实现进样速度恒定和进样体积精确的双控制,取样量1ml~无限大随意设定,准确无误。 内置统计、粒径曲线和脉冲阻值,可设定通道粒径值。 集成式全自动取样装置,内设压力系统和搅拌装置,使仪器可实现样品脱气、均匀和高粘度样品的检测。 采用大屏幕液晶显示,触摸屏菜单操作,键盘、触摸双输入,外形美观功能齐全。数据处理功能强大丰富,可根据用户给出油液等级和数据,绘制分布直方图等。 内置操作系统和微型打印机,无需外接电脑和打印机可直接测试和打印。 具有标准串行RS232口,可外接计算机存储检测结果,方便数据分类、检索。可按ISO11171和ISO4402等标准进行标定、校准。 技术参数:订制要求:各类有机系产品液体(润滑油)检测要求;激光传感检测器:第八代双激光窄光检测器(更精确、更稳定、更迅速);评判方法:满足ISO4406-99、ISO4406-87、NAS1638、MOOG、ISO11218、DL/T1096等标准;检测方法:GJB380、DL/T432、ISO11500等标准;计量校准:GB/T18854、JJG/T 066、ISO11171、ISO4402或JJG1061 等标准;测试软件:P6.4分析测试软件集成版&PC版;控制方式:集成式工控机控制或工业PC控制;检测范围:1~1000μm(根据传感器选型而定),建议选择0.5-600μm;重合精度:10000粒/mL(5%重合误差); 评价等级:可根据NAS1638、ISO 4406等直接评定油液污染等级; 数据输出:可显示颗粒物大小、数量、曲线和分布等,内置打印机,可打印输出; 报告方法:颗粒数/ml及污染度等级;标准接口:RS232接口可接计算机;电 源:220V,±50Hz。2. 建立定期的油品检测和更换制度,根据油品的性能和颗粒度情况决定是否更换;3. 配备先进的油品净化设备,及时清除油中的颗粒物;4. 加强设备的维护和保养,减少机械摩擦产生的颗粒物。 通过以上措施的实施,不仅可以提高机组的稳定性和可靠性,还可以降低维修成本,提高能源利用率。因此,火力发电机组用油颗粒度检测是必不可少的环节,必须引起足够的重视。
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  • 几种酶的酶活力检测方法及结果分析

    几种酶的酶活力检测方法及结果分析

    [align=center]几种酶的酶活力检测方法及结果分析[/align][align=center]西安国联质量检测技术股份有限公司[/align][align=center]安评中心:王涛[/align]大蒜属百合科葱属植物蒜的鳞茎,其风味独特,营养丰富,用途十分广泛。在生产上,大蒜不能通过杂交制种,只能采用其鳞茎繁殖,由于长时间的营养繁殖造成植株体内病毒积累,使得蒜头变小,品种退化,产量降低,大大降低了大蒜的商品价值。大蒜在长期的生长过程中,由于受到病原菌的植物的附着与侵入,会产生自身的抗性机制,其中的保护性反应是复杂的新陈代谢的结果,其生理反应是通过酶催化活动来实现的。这些酶包括抗病性酶超氧岐化酶SOD,多酚氧化酶PPO和过氧化物酶POD等,以及感病性酶纤维素酶和果胶酶。本文主要描述了大蒜苗中的SOD,PPO,POD,纤维素酶和果胶酶的酶活力检测方法,并从酶活的角度分析,大蒜茎尖脱毒技术可以有效提高SOD,PPO,POD等与植物抗病性有关的酶的活性,而与植物感病性有关的酶的活性如纤维素酶和果胶酶的活性有所降低,其中脱毒苗中的SOD,PPO和POD的活性分别比未脱毒苗相应地高出93.37 U/g,19.48 U/gmin和382.55 U/gmin,纤维素酶和果胶酶的活性则分别低出18.29 U/gmin和38.08 U/gmin。这就从植物生理的角度上验证了脱毒大蒜苗抗病和高产的原因。[b]1实验药品及仪器1.1缓冲液的配置[/b]1.1.1磷酸缓冲液的配置首先分别配置母液A、B,再根据质量分数分别取对应的母液,调pH即可。母液A:0.2 mol/L Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]溶液:称量71.63 g Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]12H[sub]2[/sub]O,定容至1 L。母液B:0.2 mol/L NaH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]溶液:称量31.21 g NaH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]2H[sub]2[/sub]O,定容至1 L。0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH7.8,内含1%PVP):22.875 mL A +2.125 mL l B+1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),稀释至100 mL。0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0):3.075 mL A + 21.925 mL B,稀释至100 mL。0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0):12.3 mL A + 87.7 mL B,稀释至200 mL。1.1.2醋酸缓冲液的配置同磷酸缓冲液一样,先配置母液。母液A:0.2 mol/L HAc溶液:吸取11.5 mL 醋酸溶液,定容至1 L。母液B:0.2 mol/L NaAc溶液:称量27.2 g 三水合乙酸钠,定容至1 L。0.2 mol/L (pH4.6) 醋酸缓冲液:51 mL A + 49 mL B混合均匀即可。0.2 mol/L(pH4.8)醋酸缓冲液:40 mL A + 60 mL B混合均匀即可。1.1.3其他试剂的配置100 umol/L EDTA-Na[sub]2[/sub]溶液:称取0.03721 g EDTA-Na[sub]2[/sub],用磷酸缓冲液定容至1 L。20 umol/L核黄素:称取0.00753 g核黄素定容至1 L。130 mmol/L甲硫氨酸(Met):称取1.9399 gMet,用磷酸缓冲液定容至100mL。750 umol/L氮蓝四唑(NBT):称取0.06133 g NBT,用磷酸缓冲液定容至100 mL。0.1 mol/L邻苯二酚:称取1.1011 g邻苯二酚定容至100 mL。20%三氯乙酸(TCA):称取20 g TCA定容至100 mL。二氧甲基酚即愈创木酚30%H[sub]2[/sub]O[sub]2 [/sub]3,5-二硝基水杨酸显色剂(DNS显色剂):称取2.5 g DNS溶于水中,加入2.5 g氢氧化钠、50 g酒石酸钾钠和100 mL水,加热溶解后再加入0.5 g苯酚和0.125 g无水亚硫酸钠,待全部溶解后冷却,定容至500 mL,贮于棕色瓶中,放置一周后使用,用之前过滤[sup][/sup]。葡萄糖标准液:称取0.54 g葡萄糖定容至500 mL。纤维素底物(CMC):称取0.625 g羧甲基纤维素钠溶于0.2 mol/L (pH 4.6) 醋酸缓冲液中,定容至100 mL。果胶底物:称取0.5 g果胶溶于0.2 mol/L (pH 4.8) 醋酸缓冲液中,定容至100 mL,放置冰箱内冷藏。D-半乳糖醛酸标准液:称取0.1 g D-半乳糖醛酸溶于0.2 mol/L (pH 4.8) 醋酸缓冲液中,定容至100 mL。[b]1.2主要实验仪器[/b]紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司可见光分光光度计 上海第三分析仪器厂TCL-16C型台式离心机 上海安亭科学仪器厂超净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂电热恒温水浴锅 上海跃进医疗器材厂灭菌器 上海申安医疗器械厂海尔冰箱 青岛海尔集团电子分析天平 北京赛多莉斯天平有限公司数显pH计;恒温光照培养箱;制冰机;计时器;[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url];试剂瓶;容量瓶。[b]2实验方法2.1材料[/b]大蒜脱毒试管苗:采用大蒜茎尖组织脱毒技术,经过3次继代培养所获得的生长健壮脱毒苗。大蒜苗植株:将市售山东金乡大蒜,分瓣去皮后,栽种于花盆中,日光照射,生长两个月之后所得植株。[b]2.2方法[/b]共测两组植株(第一组为大蒜脱毒苗,第二组为大蒜苗植株即未脱毒苗)的五种酶的酶活,这五种酶分别是超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、纤维素酶和果胶酶,最后将两组酶活数据分别做对应比较。同一植株做三次平行实验,取平均值。[b]3酶活测定3.1超氧物歧化酶(SOD)活力的测定[/b]本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,这种自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙。后者在560 nm处有最大吸收,而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。3.1.1粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中,加入1 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.8,内含1%PVP)在冰浴下研磨匀浆,匀浆液装入2 mL离心管中,在4000 r/min下离心10 min,取上清液,冷藏待用。3.1.2显色反应取7只5 mL透明度好的试管,用记号笔编号,1为空白管,2~4为测定管,5~7为对照管。各管按照表3-1依次添加试剂溶液,混匀后,将空白管置于暗处,其它各管置于4000 lx日光灯下反应20 min。[align=center]表1 测定SOD活性试剂添加量[/align][align=center]Table 1 The add content of reagent to SOD[/align][table][tr][td][align=center]试剂[/align][/td][td][align=center]用量/ mL[/align][/td][td][align=center]备注[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.05 mol/L磷酸缓冲液[/align][/td][td][align=center]1.5[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]130 mmol/L Met[/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]750 umol/L NBT[/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][td=1,2][align=center]总体积为3.0 ml,对照管与空白管加入缓冲液代替酶液[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]100 umol/L EDTA-Na[sub]2[/sub][/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]20 umol/L 核黄素[/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]酶液[/align][/td][td][align=center]0.05[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]蒸馏水[/align][/td][td][align=center]0.25[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][/table]3.1.3活力测定与计算以暗处管为空白,分别测定其它各管在560 nm波长下的吸光度(OD)。以抑制NBT光化还原的50%作为一个酶活性单位(U)表示。按下式计算SOD的总活性:SOD总活性(U/g)=(A[sub]o[/sub]-A[sub]s[/sub])*V[sub]t[/sub]/ A[sub]o[/sub]*0.5*W*V[sub]1 [/sub](公式3-1)式中:SOD总活性以每克鲜质量的酶单位表示(U/g);A[sub]o[/sub]-照光对照管的吸光度;A[sub]s[/sub]-样品管的吸光度;V[sub]t[/sub]-样品液总体积(mL);V[sub]1[/sub]-测定时样品液用量(mL);W-样品鲜质量(g)。[b]3.2多酚氧化酶(PPO)活力的测定[/b]多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶,能使一元酚和二元酚氧化生成醌,其活性可以用比色法测量产物的形成,邻苯二酚是其常用的底物。3.2.1粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中,加入2 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0),在冰浴下研磨匀浆,匀浆液装入2 mL离心管中,在4000 r/min下离心15 min,取上清液,冷藏待用。3.2.2活力测定与计算取2支试管,一支为空白对照管,对照管中加入1 mL酶液+3 mL 0.05 mol/L(pH 6.0)磷酸缓冲液;另一支为测定管,测定管中加入1 mL酶液+1 mL 0.1 mol/L邻苯二酚+2 mL 0.05 mol/L(pH 6.0)磷酸缓冲液。然后在37 ℃水浴保温10 min,立即冰浴,冷却下来之后,各管加入2 mL 20% TCA终止反应。立即在410 nm波长下测定吸光度,每min测一次,共测3 min。以每min内吸光度变化0.01为酶活性单位(U)。PPO活性(U/gmin)=ΔA*V[sub]0[/sub]/0.01W*V[sub]1[/sub]*t [sub] [/sub](公式3-2)式中:ΔA = A[sub]s[/sub]-A[sub]o[/sub];A[sub]o[/sub]-对照管的吸光度;A[sub]s[/sub]-测定管的吸光度;V[sub]0[/sub]-酶液提取总量(mL);V[sub]1[/sub]-测定时酶液用量(mL);W-样品鲜重(g);t-反应时间(min)。[b]3.3过氧化物酶(POD)活力的测定[/b]选用愈创木酚法,即在过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质,可用分光光度计测量生成物的含量。3.3.1反应混合液的制备量取50 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0),加入28 uL二氧甲基酚,加热搅拌至溶解,冷却后再加入19 uL 30% H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub],混合均匀保存于冰箱中。3.3.2粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中,加入5 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0),在冰浴下研磨匀浆,匀浆液装入2 mL离心管中,在4000 r/min下离心15 min,取上清液,冷藏待用。3.3.3活力测定与计算取2只比色杯,一只加入2 mL反应混合液和1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0),作为校零对照;另一只加入2 mL反应混合液和1 mL酶液,立即开启秒表计时器,在470 nm波长下测定吸光度,每隔1 min读数一次。以每min吸光度变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)。POD活性=△A*Vt /0.01W* V[sub]1[/sub]*t (公式3-3)式中:△A-反应时间内吸光度的变化量;V[sub]t[/sub]-酶液总体积(mL);V[sub]1[/sub]-测定时酶液用量(mL);W-样品鲜重(g);t-反应时间(min)。[b]3.4纤维素酶活力的测定[/b]选用DNS法测定纤维素酶活力。DNS法测定的是纤维素酶对羧甲基纤维素钠(CMC)的糖化能力,其水解产物如纤维二糖和葡萄糖是还原糖,可以将DNS还原成棕红色的氨基化合物,在一定浓度范围内,还原糖的量与该物质溶液颜色的深浅成比例,因此可以用分光光度计进行测定,该方法可表示纤维素酶的总活力。3.4.1绘制葡萄糖标准曲线取5支试管,用记号笔编号后,按表3-2量取试剂,每管分别加入1 mL 2 mol/L氢氧化钠和2 mL DNS显色液,摇匀后置于沸水浴中加热5 min,流水冷却,用蒸馏水定容至10 mL,静置20 min后以1号管为对照于490 nm波长处测吸光度,绘制标准曲线。[align=center]表2葡萄糖标准曲线制作表[/align][align=center]Table 2 Standard curve of Glucose[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td]标准葡萄糖溶液(mL)[/td][td]0.2 mol.L[sup]-1[/sup],pH4.6醋酸钠缓冲溶液(mL)[/td][td][align=center]试管中葡萄糖量(umol)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]5.0[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]4.6[/align][/td][td][align=center]2.4[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]0.6[/align][/td][td][align=center]4.4[/align][/td][td][align=center]3.6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]0.8[/align][/td][td][align=center]4.2[/align][/td][td][align=center]4.8[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]1.0[/align][/td][td][align=center]4.0[/align][/td][td][align=center]6.0[/align][/td][/tr][/table]3.4.2粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中,加入2 mL 0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.6),在冰浴下研磨匀浆,匀浆液装入2 mL离心管中,在4000 r/min下离心15 min,取上清液,装入离心管中再离心10 min,定容至10 mL,冷藏待用。3.4.3活力测定与计算取3支试管,一支作为空白对照,另2支作为平行样品。样品管中加入50℃预热的酶液1 mL,底物溶液(CMC)4 mL;空白对照管加4 mL底物溶液(CMC)。3支试管放入50℃水浴中,5 min后取出,立即加入1 mL 2mol/L NaOH溶液和2 mL DNS显色剂。摇匀后,空白对照管中加入1 mL酶液,立即将3支试管放入沸水浴中,反应5 min后取出,流水冷却,定容至10 mL,在490 nm波长处测吸光度。用测得的OD值在标准曲线上差得相应的葡萄糖的量,代入下面公式计算活力。以每min催化纤维素水解成1 umol葡萄糖的酶量表示酶活大小(U)。纤维素酶活性(U/gmin)=葡萄糖量/5*E* W (公式3-4)式中:5为反应时间(min);Ew为1 mL酶液中含有的酶量(g);W-样品鲜重(g)。[b]3.5果胶酶活力的测定[/b]选用DNS法测定果胶酶活力。该方法是利用果胶酶在一定温度,时间和条件下水解果胶,释放出还原性D-半乳糖醛酸,与3,5-二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物,即发生显色反应。在一定范围内,水解生成D-半乳糖醛酸的量与吸光度成正比,与果胶酶活力成正比,通过分光光度计测定吸光度,可以计算出果胶酶的活力。3.5.1绘制D-半乳糖醛酸标准曲线取6支试管,编号后依次按照表3-3加入试剂,摇匀后置于沸水浴中反应5 min后,冷却,用蒸馏水定容至10 mL,静置20 min后以1号管为对照于540 nm波长处测吸光度,绘制标准曲线。[align=center]表3[b] [/b]D-半乳糖醛酸标准曲线的绘制[/align][align=center]Table 3 Standard curve of D-Galacturonic acid[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td]D-半乳糖醛酸标准液(mL)[/td][td]0.2 mol.L[sup]-1[/sup],pH4.8醋酸缓冲液(mL)[/td][td][align=center]DNS显色液(mL)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]4.0[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]0.2[/align][/td][td][align=center]3.8[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]3.6[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]0.6[/align][/td][td][align=center]3.4[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]0.8[/align][/td][td][align=center]3.2[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]6[/align][/td][td][align=center]1.0[/align][/td][td][align=center]3.0[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][/table]3.5.2粗酶液的提取与提取纤维素酶的方法相同。3.5.3活力测定与计算取5支试管,用记号笔编号。1、2号管为样品管,分别加入1 mL果胶底物,在48℃水浴中预热5 min,再分别加入4 mL 0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.8),之后,1号管中加入1 mL酶液,立即摇匀,在48℃水浴中反应30 min;2号管中加入1 mL酶液,立即放入沸水浴中反应5 min,冷却。分别取1、2管中容液各2 mL于3、4管中,并加2 mL水,2.5 mL DNS显色剂,混匀,沸水浴反应5 min,流水冷却。5号管加入4 mL 0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.8),2.5 mL DNS显色剂,静置20 min后以5号管为对照校零,在540 nm波长处测3、4管的吸光度;用测得的(OD[sub]3[/sub]-OD[sub]4[/sub])值在标准曲线上查得相应的D-半乳糖醛酸的量,代入下面公式计算活力。以每min酶作用生成的D-半乳糖醛酸的量为一个酶活单位(U)。果胶酶活性(U/ gmin)=Y*3*N/t* W [sub] [/sub](公式3-5)式中:Y-酶作用生成的D-半乳糖醛酸的量;3-测酶活取了反应液的1/3;N-样品稀释倍数;W-样品鲜重(g);t-反应时间(min)[b]4标准曲线的绘制4.1葡萄糖标准曲线[/b]依照3.4.1步骤,最后测得各个试管中的吸光度依次为0,0.432,0.672,0.865,1.073。按照表4,以葡萄糖浓度为横坐标,490 nm处的OD值为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线(如图1)。[align=center]表4葡萄糖标准曲线[/align][align=center]Table 4 Standard curve of Glucose[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]葡萄糖浓度umol[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]2.4[/align][/td][td][align=center]3.6[/align][/td][td][align=center]4.8[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]490 nm OD[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]0.432[/align][/td][td][align=center]0.672[/align][/td][td][align=center]0.865[/align][/td][td][align=center]1.073[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,580,219]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807010439441511_1108_2904018_3.png!w580x219.jpg[/img] [/align][align=center]图1葡萄糖标准曲线[/align][align=center]Figure 1 Standard curve of Glucose[/align][b]4.2 D-半乳糖醛酸标准曲线[/b]依照3.5.1步骤,最后测得各个试管中的吸光度依次为0,0.211,0.384,0.561,0.743,0.965。按照表5,以D-半乳糖醛酸的量为横坐标,540 nm处的OD值为纵坐标,绘制D-半乳糖醛酸标准曲线(如图2)。[align=center]表5 D-半乳糖醛酸标准曲线[/align][align=center]Table 5 Standard curve of D-Galacturonic acid[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]D-半乳糖醛酸的量mL[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]0.2[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]0.6[/align][/td][td][align=center]0.8[/align][/td][td][align=center]1.0[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]540 nm OD[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]0.211[/align][/td][td][align=center]0.384[/align][/td][td][align=center]0.561[/align][/td][td][align=center]0.743[/align][/td][td][align=center]0.965[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,579,188]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807010440011153_826_2904018_3.png!w579x188.jpg[/img] [/align][align=center]图2 D-半乳糖醛酸标准曲线[/align][align=center]Figure 2 Standard curve of D-Galacturonic acid[/align][b]5结果与分析[/b]将所测得的OD值,根据各个公式计算出SOD,PPO,POD,纤维素酶和果胶酶的酶活力,结果如表6所示。再将大蒜脱毒试管苗与未脱毒苗酶活测定结果做成柱状图进行比较,如图3所示。可以看出,脱毒试管苗中的SOD,PPO,POD的活性均高于未脱毒试管苗的对应酶的活性,而这三种酶都与植物的抗病性有关,说明在抗病性上脱毒试管苗强于未脱毒试管苗;纤维素酶和果胶酶的活性则是未脱毒苗比脱毒试管苗高。此外,作为植物抗氧化系统第一道防线的SOD,其活性大小在脱毒试管苗与未脱毒苗中相差93.37 U/g,前者比后者高出约1.5倍,说明经脱毒的试管苗抵御活性氧侵害的能力更高。PPO能催化木质素及其他酚类氧化物的形成,从而构成保护性屏蔽,抵抗抗病菌的入侵,也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用。脱毒试管苗的PPO活性比未脱毒苗的PPO活性高出19.48 U/gmin,约2.45倍。说明脱毒苗在抵抗抗病菌的入侵方面,能力更强。在植物对病原菌侵染的防卫反应中,POD和SOD都有着极其重要的作用,SOD能有效的清除机体内的超氧自由基,它可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢,而POD可以将过氧化氢分解为完全无害的水,在脱毒试管苗与未脱毒苗中POD的活性均比较大,两者相差382.55 U/gmin,约1.7倍,说明经脱毒的试管苗可以更有效的抵御过氧化氢的毒害。而纤维素酶和果胶酶均与植物的感病性有关,其活性则是未脱毒苗比脱毒试管苗高,分别高出18.29 U/gmin和38.08 U/gmin,约2.4倍和1.2倍,说明脱毒苗的感病几率有所降低。POD不仅可以将过氧化氢分解为完全无害的水,而且还具有多种生理功能,如从叶绿体和细胞质中去除过氧化氢、氧化有毒化合物、合成细胞壁、对各种胁迫的应急、吲哚-3-乙酸的调控、乙烯的生物合成等,还参与了植物酚类的聚合和氧化以及木质素和植保素的合成。因此POD是植物体中活性较高的一种酶,从图3中也可以看出,POD的活性在五种酶中最高。[align=center]表6 大蒜脱毒试管苗与未脱毒苗酶活测定结果[/align][align=center]Table 6 Enzyme activity assay results between virus-free garlic in vitro and not virus-free plantlets[/align][table][tr][td][align=center]酶总活性[/align][/td][td][align=center]SOD[/align][align=center](U/g)[/align][/td][td][align=center]PPO[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][td][align=center]POD[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][td][align=center]纤维素酶[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][td][align=center]果胶酶[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]脱毒苗[/align][/td][td][align=center]157.46[/align][/td][td][align=center]27.43[/align][/td][td][align=center]610.95[/align][/td][td][align=center]7.77[/align][/td][td][align=center]31.97[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]未脱毒苗[/align][/td][td][align=center]64.09[/align][/td][td][align=center]7.95[/align][/td][td][align=center]228.40[/align][/td][td][align=center]26.06[/align][/td][td][align=center]70.05[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,564,289]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807010440223303_2970_2904018_3.png!w564x289.jpg[/img] [/align][align=center]图3大蒜脱毒试管苗与未脱毒苗酶活测定结果比较[/align][align=center]Table 3 Comparison of enzyme activity assay results between virus-free garlic in vitro and not virus-free plantlets[/align]

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